<I>Neospora hughesi</I> is a recently described cause of equine protozoal myeloencephalitis (EPM). In the present study, we examined the susceptibility of BALB/c gamma-interferon gene knockout (gamma-INFKO), BALB/c, CD-1, and C57BL/6 strains of mice and gerbils to infection with tachyzoites of the Nh-A1 strain of <I>N. hughesi</I>. Only the gamma-IFNKO mice developed severe clinical disease following infection with <I>N. hughesi</I>. The most severe lesions were in the hearts of these mice. Two dogs fed the brains of mice, shown to contain <I>N. hughesi</I> tissue stages by cell culture and g-IFNKO mouse bioassay, did not shed <I>N. hughesi</I> oocysts over a 23 day observation period. We report important differences between the nucleotide and deduced amino acid sequences of the dense granule proteins GRA6 and GRA7 of <I>N. hughesi and N. caninum</I>. The newly defined proteins of <I>N. hughesi</I> are referred to as NhGRA6 and NhGRA7. From analysis of the sequences we found that there is a 14.8% difference in deduced amino acid sequence between NhGRA7 and NcGRA7, and a 4% difference between NhGRA6 and NcGRA6 in areas that could be compared. This thesis supports the identification of <I>N. hughesi</I> as a separate species from <I>N. caninum</I> and describes novel methods of distinguishing between the two. / Master of Science

Dans la cellule hôte, Toxoplasma gondii se développe dans une vacuole parasitophore (VP) caractérisée par un réseau de nanotubes membranaires (RNM) dont la composition, le mécanisme de formation et la fonction sont obscures. Quelques protéines GRA, dont GRA2 et GRA6, sont sécrétées dans la VP à partir des granules denses puis ciblées au RNM. Cette localisation s'accorde avec l'hélice alpha-hydrophobe de GRA6 et les hélices alpha-amphipathiques de GRA2. Avant et après sécrétion dans la VP, les protéines GRA sont partiellement solubles. Le phénotype de parasites délétés de leur(s) gène(s) GRA2 et/ou GRA6 révèle que ces 2 protéines sont indispensables à la formation du RNM. J'ai montré 1) qu'avant leur insertion dans les membranes de la VP, la solubilité des protéines GRA est préservée grâce à des interactions hydrophobes avec peut être, des micelles de l'espace vacuolaire ; 2) que GRA12, une nouvelle protéine du RNM, n'interagit pas avec GRA2 dans ces membranes. 3) que l'adressage spécifique de GRA6 au RNM est déterminé par son domaine N-terminal hydrophile. 4) J'ai montré que GRA2 recombinante a une affinité pour le phosphatidyl inositol (4, 5) diphosphate avec lequel elle interagit via ses hélices alpha-amphipathiques. GRA2 déforme des liposomes de courbure membranaire importante pour générer de courts tubules membranaires. La tubulation est accentuée par GRA6 qui s'associe aux liposomes, quelque soit leur diamètre. Ces résultats valident le rôle direct de GRA2 et GRA6 dans la formation du RNM et laissent envisager un modèle de sa formation, dans lequel GRA6 favoriserait l'assemblage de vésicules lipidiques que GRA2 fusionnerait en tubules membranaires. / Within the host cell, Toxoplasma gondii multiplies in a parasitophorous vacuole (PV) characterized by a membranous nanotubular network (MNN). Its components, the mechanism of its formation and its function remain unknown. A few GRA proteins, including GRA2 and GRA6, are secreted from the dense granules into the PV and are targeted to the MNN. This location is in agreement with the hydrophobic alpha-helix predicted in GRA6 and with the GRA2 amphipatic alpha-helices. However, before and after their secretion in the PV, the GRA proteins are partially soluble. The phenotypic analysis of parasites deleted from their GRA2 and/or GRA6 gene(s) had shown that both these proteins are indispensable for MNN formation. During my thesis, I showed that before their insertion into the PV membranes, the GRA proteins solubility is preserved by establishing hydrophobic interactions, likely with micelles in the PV space. I also showed that GRA12, a novel MNN-associated protein, does not interact with GRA2 within these membranes. Using GRA6 as a model of study, I contributed to demonstrate that the GRA6 specific targeting to the MNN relies on its N-terminal hydrophilic domain. I demonstrated that recombinant GRA2 recognizes inositol (4, 5) biphosphate with which it interacts via its amphipatic alpha-helices. GRA2 deforms liposomes of steep membrane curvature into short membranous tubules. The tubulation is increased by GRA6 which associates with liposomes independently of their diameter. These results validate the direct role of both GRA2 and GRA6 in MNN formation and led us to propose a model in which GRA6 would tether vesicles, the fusion of which would be induced by GRA2.

Neospora caninum (filo Apicomplexa) é um parasita obrigatório intracelular como todos os membros deste filo, alguns reconhecidos por causarem doenças com impacto relevante na saúde humana (Plasmodium e Toxoplasma) e veterinária (Babesia, Eimeria e Cryptosporidium). Causador da neosporose, N. caninum vem emergindo como um dos maiores causadores de abortos infecciosos em bovinos, levando a consideráveis perdas econômicas na bovinocultura mundial. Devido à sua recente descoberta, o conhecimento sobre diversos processos bioquímicos de N.caninum ainda é limitado, demandando novas pesquisas para a compreensão de seus mecanismos de sobrevivência e consequente identificação de alvos para intervenção terapêutica. O processo de invasão celular é bastante investigado em pesquisas envolvendo apicomplexas, uma vez que a sobrevivência desses parasitas depende do sucesso de sua entrada na célula hospedeira. Proteínas secretadas de organelas filo-específicas (micronemas, roptrias e grânulos densos) estão intimamente envolvidas com a invasão celular. Elas são responsáveis pela interação inicial com a célula hospedeira, participam da junção de movimento formada no momento da invasão, e contribuem para a estabilização do vacúolo parasitóforo. Neste trabalho as proteínas secretadas por taquizoítas de N. caninum foram investigadas de duas formas: (1) por caracterização molecular de proteínas com domínio Apple; e (2) por estudo do secretoma do parasita. Os domínios proteicos do tipo Apple são caracterizados pela capacidade de interação proteína-proteína e proteína-carboidrato, e estão presentes em algumas proteínas micronêmicas com propriedades adesivas. Neste trabalho três proteínas de N. caninum contendo domínios Apple foram caracterizadas: MIC17A, MIC17B e MIC17C. A análise das sequências proteicas e das estruturas dos domínios Apple, obtidas por modelagem molecular, mostraram alta identidade sequencial e estrutural entre MIC17A e MIC17C. Apesar de ser paráloga às outras duas, MIC17B apresenta diferenças importantes em sua sequência e estrutura. Para MIC17B e MIC17C foram realizados experimentos de detecção das proteínas nativas nos extratos total e secretado do taquizoíta que sugerem diferentes formas de processamento entre essas proteínas no parasita. Para MIC17B foi confirmada a localização em micronemas, num padrão diferente do observado para MIC17C. Os ensaios de invasão combinados aos de localização indicam que estas proteínas estejam relacionadas ao processo de invasão celular, porém, suas funções permanecem desconhecidas. O secretoma é o conjunto de proteínas secretadas pelo parasita e, para explorar a composição deste extrato (ESA) no taquizoíta de N. caninum, duas abordagens complementares foram utilizadas. Na primeira abordagem foram identificadas as proteínas presentes no ESA por espectrometria de massas. Na segunda abordagem realizou-se uma ii quantificação relativa das proteínas, marcadas por dois isótopos, nos extratos totais de taquizoítas submetidos ou não ao estímulo secretório. O resultado esperado seria com as proteínas secretadas diminuídas no parasita estimulado. Em ambas as abordagens foram utilizadas técnicas de espectrometria de massas de alta resolução (nanoLC-MS/MS), o que resultou num alto número de identificações; 615 proteínas no ESA e 2011 proteínas quantificadas. A comparação das duas abordagens permitiu o reconhecimento de proteínas com maior probabilidade de secreção. Uma rede de interação entre as proteínas diferencialmente expressas foi predita, gerando resultados que, associados às informações sobre as proteínas aumentadas, permitiram uma investigação sobre proteínas potencialmente envolvidas com a regulação do metabolismo relacionado à secreção. Os resultados obtidos por ambos os estudos aqui demonstrados somam conhecimento acerca do parasita N. caninum e demonstram ser úteis para guiar a busca e seleção de alvos a serem investigados para o desenvolvimento de terapêutica contra a neosporose. / Neospora caninum (Apicomplexa phylum) is an obligatory intracellular parasite like all members from this phylum, some causing diseases with relevant impact on human (Plasmodium and Toxoplasma) and veterinary (Babesia, Eimeria and Cryptosporidium) health. Causative agent of neosporosis, N. caninum has emerged as one of the leading causes of infectious abortion in cattle, generating huge economical losses in worldwide livestock. Due to its recent discovery, knowledge of N. caninum biochemical processes remains scarce, demanding new research for comprehending its survival mechanisms and, consequently, identifying new targets for therapeutic intervention. The invasion process has often been investigated in apicomplexans since their survival depends on the success of their entry into the host cell. Proteins secreted from phylum-specific organelles (micronemes, rhoptries and dense granules) are deeply involved with invasion. They are responsible for the initial interaction with the host cell; participate of the moving junction formed in the moment of invasion; and contribute for the stabilization of the parasitophorus vacuole. In this study, the proteins secreted by N. caninum tachyzoites were investigated in two ways: (1) the molecular characterization of Apple domaincontaining proteins; and (2) exploring the parasite secretome. The Apple protein domains are characterized by the ability to interact as protein-protein and proteincarbohydrate, and are present in some microneme proteins with adhesive properties. Here three N. caninum proteins containing Apple domains were characterized: MIC17A, MIC17B and MIC17C. Analyses of the Apple domains sequences and structures, obtained by molecular modeling, revealed high sequential and structural identities between MIC17A and MIC17C. Although being a paralog of the other two proteins, MIC17B presents significant differences in its sequence and structure. Experiments were performed for native MIC17B and MIC17C detection in the total and secreted tachyzoite extracts, suggesting different processing forms for these proteins in the parasite. For MIC17B, the microneme localization was confirmed, differently from the pattern observed for MIC17C. Invasion and localization assays indicated that these proteins are related to the cell invasion process; nevertheless, their functions remain unknown. The secretome is the set of proteins secreted by the parasite and, to explore this extract (ESA) composition in N. caninum, two complementary approaches were used. Firstly proteins present in ESA were identified by mass spectrometry. In the second approach, a relative quantification was performed on the proteomes of ethanol stimulated/non stimulated tachyzoites, expecting that the secreted proteins would be down regulated at the stimulated parasite. Both approaches were performed with high resolution mass spectrometry techniques (nanoLC-MS/MS), reaching a high number of identifications: 615 proteins iv in ESA and 2011 quantified proteins. The comparison between both approaches allowed the recognition of the most likely secreted proteins. An interaction network was predicted, involving the differentially expressed proteins. These results, associated with the information of up regulated proteins, allowed the investigation of proteins potentially involved with the secretion metabolism regulation. The findings from our two studies add up knowledge about N. caninum and demonstrate to be useful in guiding the search and selection for new targets for therapeutic development against neosporosis.

Neospora caninum (filo Apicomplexa) é um parasita obrigatório intracelular como todos os membros deste filo, alguns reconhecidos por causarem doenças com impacto relevante na saúde humana (Plasmodium e Toxoplasma) e veterinária (Babesia, Eimeria e Cryptosporidium). Causador da neosporose, N. caninum vem emergindo como um dos maiores causadores de abortos infecciosos em bovinos, levando a consideráveis perdas econômicas na bovinocultura mundial. Devido à sua recente descoberta, o conhecimento sobre diversos processos bioquímicos de N.caninum ainda é limitado, demandando novas pesquisas para a compreensão de seus mecanismos de sobrevivência e consequente identificação de alvos para intervenção terapêutica. O processo de invasão celular é bastante investigado em pesquisas envolvendo apicomplexas, uma vez que a sobrevivência desses parasitas depende do sucesso de sua entrada na célula hospedeira. Proteínas secretadas de organelas filo-específicas (micronemas, roptrias e grânulos densos) estão intimamente envolvidas com a invasão celular. Elas são responsáveis pela interação inicial com a célula hospedeira, participam da junção de movimento formada no momento da invasão, e contribuem para a estabilização do vacúolo parasitóforo. Neste trabalho as proteínas secretadas por taquizoítas de N. caninum foram investigadas de duas formas: (1) por caracterização molecular de proteínas com domínio Apple; e (2) por estudo do secretoma do parasita. Os domínios proteicos do tipo Apple são caracterizados pela capacidade de interação proteína-proteína e proteína-carboidrato, e estão presentes em algumas proteínas micronêmicas com propriedades adesivas. Neste trabalho três proteínas de N. caninum contendo domínios Apple foram caracterizadas: MIC17A, MIC17B e MIC17C. A análise das sequências proteicas e das estruturas dos domínios Apple, obtidas por modelagem molecular, mostraram alta identidade sequencial e estrutural entre MIC17A e MIC17C. Apesar de ser paráloga às outras duas, MIC17B apresenta diferenças importantes em sua sequência e estrutura. Para MIC17B e MIC17C foram realizados experimentos de detecção das proteínas nativas nos extratos total e secretado do taquizoíta que sugerem diferentes formas de processamento entre essas proteínas no parasita. Para MIC17B foi confirmada a localização em micronemas, num padrão diferente do observado para MIC17C. Os ensaios de invasão combinados aos de localização indicam que estas proteínas estejam relacionadas ao processo de invasão celular, porém, suas funções permanecem desconhecidas. O secretoma é o conjunto de proteínas secretadas pelo parasita e, para explorar a composição deste extrato (ESA) no taquizoíta de N. caninum, duas abordagens complementares foram utilizadas. Na primeira abordagem foram identificadas as proteínas presentes no ESA por espectrometria de massas. Na segunda abordagem realizou-se uma ii quantificação relativa das proteínas, marcadas por dois isótopos, nos extratos totais de taquizoítas submetidos ou não ao estímulo secretório. O resultado esperado seria com as proteínas secretadas diminuídas no parasita estimulado. Em ambas as abordagens foram utilizadas técnicas de espectrometria de massas de alta resolução (nanoLC-MS/MS), o que resultou num alto número de identificações; 615 proteínas no ESA e 2011 proteínas quantificadas. A comparação das duas abordagens permitiu o reconhecimento de proteínas com maior probabilidade de secreção. Uma rede de interação entre as proteínas diferencialmente expressas foi predita, gerando resultados que, associados às informações sobre as proteínas aumentadas, permitiram uma investigação sobre proteínas potencialmente envolvidas com a regulação do metabolismo relacionado à secreção. Os resultados obtidos por ambos os estudos aqui demonstrados somam conhecimento acerca do parasita N. caninum e demonstram ser úteis para guiar a busca e seleção de alvos a serem investigados para o desenvolvimento de terapêutica contra a neosporose. / Neospora caninum (Apicomplexa phylum) is an obligatory intracellular parasite like all members from this phylum, some causing diseases with relevant impact on human (Plasmodium and Toxoplasma) and veterinary (Babesia, Eimeria and Cryptosporidium) health. Causative agent of neosporosis, N. caninum has emerged as one of the leading causes of infectious abortion in cattle, generating huge economical losses in worldwide livestock. Due to its recent discovery, knowledge of N. caninum biochemical processes remains scarce, demanding new research for comprehending its survival mechanisms and, consequently, identifying new targets for therapeutic intervention. The invasion process has often been investigated in apicomplexans since their survival depends on the success of their entry into the host cell. Proteins secreted from phylum-specific organelles (micronemes, rhoptries and dense granules) are deeply involved with invasion. They are responsible for the initial interaction with the host cell; participate of the moving junction formed in the moment of invasion; and contribute for the stabilization of the parasitophorus vacuole. In this study, the proteins secreted by N. caninum tachyzoites were investigated in two ways: (1) the molecular characterization of Apple domaincontaining proteins; and (2) exploring the parasite secretome. The Apple protein domains are characterized by the ability to interact as protein-protein and proteincarbohydrate, and are present in some microneme proteins with adhesive properties. Here three N. caninum proteins containing Apple domains were characterized: MIC17A, MIC17B and MIC17C. Analyses of the Apple domains sequences and structures, obtained by molecular modeling, revealed high sequential and structural identities between MIC17A and MIC17C. Although being a paralog of the other two proteins, MIC17B presents significant differences in its sequence and structure. Experiments were performed for native MIC17B and MIC17C detection in the total and secreted tachyzoite extracts, suggesting different processing forms for these proteins in the parasite. For MIC17B, the microneme localization was confirmed, differently from the pattern observed for MIC17C. Invasion and localization assays indicated that these proteins are related to the cell invasion process; nevertheless, their functions remain unknown. The secretome is the set of proteins secreted by the parasite and, to explore this extract (ESA) composition in N. caninum, two complementary approaches were used. Firstly proteins present in ESA were identified by mass spectrometry. In the second approach, a relative quantification was performed on the proteomes of ethanol stimulated/non stimulated tachyzoites, expecting that the secreted proteins would be down regulated at the stimulated parasite. Both approaches were performed with high resolution mass spectrometry techniques (nanoLC-MS/MS), reaching a high number of identifications: 615 proteins iv in ESA and 2011 quantified proteins. The comparison between both approaches allowed the recognition of the most likely secreted proteins. An interaction network was predicted, involving the differentially expressed proteins. These results, associated with the information of up regulated proteins, allowed the investigation of proteins potentially involved with the secretion metabolism regulation. The findings from our two studies add up knowledge about N. caninum and demonstrate to be useful in guiding the search and selection for new targets for therapeutic development against neosporosis.

Toxoplasma gondii est un parasite intracellulaire responsable de la toxoplasmose. Lors de l’infection aiguë, le parasite se divise dans une vacuole parasitophore (VP), compartiment d’interactions avec la cellule hôte. La VP se modifie pour former un kyste qui persiste au cours de la phase chronique. Le rôle des protéines de granules denses (GRA) dans ce processus est suggéré par leur abondance dans la VP et la paroi kystique. Par des approches de génétique inverse et de protéomique, le but de ce travail visait à préciser au plan moléculaire, le rôle de la protéine GRA5. En utilisant un modèle de différenciation parasitaire in vitro, l’étude des phénotypes d’un mutant invalidé du gène gra5 a permis de découvrir son rôle clé dans la formation des kystes par le maintien 1/ de l’intégrité de la membrane délimitant la VP en cours de différenciation, 2/ de l’accumulation d’autres composants parasitaires dans la VP et 3/ de son interaction avec le reticulum endoplasmique de l’hôte. / Toxoplasmosis, which is caused by the intracellular parasite Toxoplasma gondii is characterized by a life-long chronic infection. The parasites replicate inside a parasitophorous vacuole (PV), which evolves into a persistent cyst. The molecular mechanisms governing the differentiation process are poorly characterized. It is known that the dense granules proteins (GRA) are major components of both the PV and the cyst wall, enabling their interaction with the host cells. Using a Prugniaud cystogenic type II strain in which the gra5 gene was invalidated and a combination of cellular and proteomic approaches, we discovered that GRA5 regulates i) the molecular content of the PV, ii) the PV interaction with the host endoplasmic reticulum and iii) host cell homeostasis,that is necessary to ensure the formation of a stable cyst wall.