As neoplasias malignas são responsáveis por milhões de mortes todos os anos, sendo que os problemas acarretados por tumores gástricos representam a terceira causa de morte por câncer a nível mundial. Um dado preocupante em relação ao câncer gástrico é em relação a sobrevida global de 5 anos que é de apenas 30%, aproximadamente. Um dos principais fatores que acarretam em taxas tão alarmantes é que em estágios iniciais o câncer gástrico é assintomático, fazendo com que o seu diagnóstico ocorra normalmente em estágios mais tardios. Além disso, prognósticos ruins mesmo em estágios iniciais da doença são comuns neste tipo de câncer, principalmente devido ao alto índice de resistência das células tumorais aos tratamentos convencionais. Com a necessidade de novos biomarcadores e novas modalidades de tratamentos, o estudo do secretoma de células tumorais vem sendo amplamente explorado. Este tipo de estudo é utilizado como meio de identificar novas moléculas que possam ser utilizadas em diagnósticos mais precoces assim como novos alvos terapêuticos. Por isso, o objetivo desse trabalho foi analisar o perfil do secretoma de células tumorais derivadas de linhagens de câncer gástrico (ACP02 e ACP03), em comparação com uma linhagem de mucosa gástrica normal (MN01), buscando novas moléculas que possam servir de biomarcadores, bem como fonte para novos alvos terapêuticos. Para o alcance desse objetivo o meio condicionado das diferentes linhagens celulares foi coletado, e as proteínas presentes foram concentradas através de ultrafiltração e identificadas através de análises por Q-Tof LC/MS/MS. A análise de espectrometria de massas identificou 333 proteínas secretadas, sendo 86 exclusivamente secretadas por ambas as linhagens de câncer gástrico. Após a identificação, as proteínas foram analisadas através de biologia de sistemas e, devido a sua importância, as proteínas PDIA6, GDF15 e HSP47 foram escolhidas para análises por Western blot e qPCR. A análise de Western blot confirmou que as proteínas GDF15 e HSP47 são secretadas apenas pelas linhagens de adenocarcinomas gástricos. Porém quando analisamos a proteína PDIA6 não conseguimos comprovar a sua secreção diferencial pelas linhagens de adenocarcinomas. Com estes resultados, resolvemos analisar a proteína HSP47 como possível alvo terapêutico, através do efeito do seu silenciamento nas linhagens de câncer gástrico pela técnica de CRISPR. Estas análises demonstraram que o silenciamento da proteína HSP47 reduziu a capacidade migratória, invasiva e de formação de esferas nas células tumorais. Em síntese, os resultados demonstraram que a HSP47 pode ser um possível alvo terapêutico no tratamento do câncer gástrico, e que HSP47 e GDF15 possuem potencial para serem utilizadas como biomarcadores devido a sua secreção diferencial pelas células tumorais. / The malignant neoplasms are responsible for millions of deaths every year, and the gastric cancer is the third leading cause of cancer deaths worldwide. An alarming finding regarding gastric cancer is the five-year survival rate of only 30%. One of the main problems related to gastric cancer is that it is asymptomatic in the initial phases of the disease, making their diagnosis usually occur in later stages. Also, poor prognoses even in the early stages of the disease are frequent in this type of cancer, mainly due to the high resistance of tumor cells to conventional treatments. The study of the secretome of tumor cell lines has been extensively explored to discover new biomarkers and new modalities of treatments, that can be used in earlier diagnoses as well as new therapeutic targets. Then, the present study aimed to characterize the secretome of two human gastric cancer cell lines (ACP02 and ACP03) in order to compare their differences concerning the non-neoplastic gastric cell line (MN01). For this purpose, we collected the conditioned medium of these cell lines and concentrated the secreted proteins by ultrafiltration. After that, the identification of the proteins was made by ultra-performance Q-Tof LC/MS/MS. Mass spectrometry-based proteomics identified 333 proteins in the three cell lines of which 86 proteins are identified exclusively from the two carcinoma cell lines. After the identification, the proteins were analyzed through system biology and, due to their importance, the proteins PDIA6, GDF15 e HSP47 were chosen for western blot and qPCR analyzes. The Western blot analysis showed that GDF15 and HSP47 are secreted only by the tumor cell lines. However, when we analyzed de PDIA6 protein, we are not able to confirm the differential secretion by the tumor cell lines. With these results, we decided to analyze the HSP47 protein as a possible therapeutic target, through the effect of its silencing on gastric cancer lines by the CRISPR technique. These analyses showed that HSP47 silencing decreases the migration, invasion, and sphere forming capacity in gastric tumor cells. In summary, the results demonstrated that the HSP47 protein may be a possible therapeutic target in the treatment of gastric cancer and that HSP47 and GDF15 proteins have potential to be used as biomarkers, due to their differential secretion by tumor cells.

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Made available in DSpace on 2014-07-29T15:16:28Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Marcelo Ramada -.pdf: 3086154 bytes, checksum: d8d600492d75495c63dd916423b6e86b (MD5) Previous issue date: 2010-03-31 / Trichoderma harzianum is a saprophytic fungus, known for its potential as a biological control agent of different phytopathogens that causes losses in crops. Its action is based on different mechanisms like volatile and non-volatile antibiotics production, competition for nutrient and space, production of hydrolytic enzymes and mycoparasitism. Fusarium solani is the agent of bean dry root rot, and is responsible for significant losses. This work sought to analyze and identify secreted proteins from T. harzianum grown in the presence of F. solani cell wall, in an attempt to obtain new insights on biocontrol.In the dual culture test, T. harzianum proved to be a potent antagonist of F. solani. Some differences in the secreted proteins profile and final medium pH were observed when T. harzianum was grown in TLE medium containing glucose and in TLE and Minimum medium containing the cell wall of the phytopathogen. 33 proteins from 18 different genes were identified. The protein Sm1 was identified and secreted in all growth conditions. Many hydrolytic enzymes related to mycoparasitism, like endochitinases, β-1,3, β-1,6-glucanases, proteases and α-1,3-glicanases, were identified and among the proteases, a hypothetical metalocarboxipeptidase and a serine subtilisin-like never described for T. harzianum. Some enzymes with unkown roles in the mycoparasitism, such as β-1,3-glucanosyltransferase, secreted only in MM growth medium supernatant, were also identified. / Trichoderma harzianum é um fungo saprofítico, conhecido devido ao seu grande potencial como agente de controle biológico de diferentes fitopatógenos. Sua ação é baseada em diferentes mecanismos como a produção de antibióticos voláteis e não-voláteis, competição por espaço e nutrientes, produção de enzimas hidrolíticas e o micoparasitismo. Fusarium solani causa a podridão radicular seca no feijoeiro, resultando em perdas significativas. Este trabalho buscou analisar e identificar as proteínas secretadas por T. harzianum quando crescido na presença de parede celular de F. solani, em uma tentativa de obter novas informações sobre o biocontrole. Nos testes de pareamento, T. harzianum provou ser um potente antagonista de F. solani. Foi observada uma variação tanto no perfil de proteínas secretadas quanto no pH final, quando T. harzianum foi crescido em meio TLE contendo glicose e em meio TLE e Mínimo (M.M.) contendo parede celular do fitopatógeno. No total, 33 proteínas de 18 genes diferentes foram identificadas neste trabalho. A proteína Sm1 foi identificada e secretada em todas as condições de crescimento. Várias enzimas hidrolíticas relacionadas ao micoparasitismo, como endoquitinases, β-1,3, β-1,6-glicanases, proteases e α- 1,3-glicanases, foram identificadas e dentre as proteases, uma hipotética metalocarboxipeptidase e uma serina subtilisin-like nunca descritas em T. harzianum. Foram identificadas, também, enzimas que não possuem função conhecida no micoparasitismo, como a β-1,3-glicanosiltransferase, presente somente no sobrenadante do crescimento realizado em MM.

Biotransformação é uma estratégia promissora para a descoberta de novas moléculas de interesse farmacêutico e industrial. Fungos têm demonstrado habilidade para biotransformar muitas moléculas naturais e sintéticas. Um produto natural muito estudado e de potencial para a indústria farmacêutica é o Lapachol, uma naftoquinona que apresenta uma ampla diversidade de atividades biológicas. Existem na literatura muitos estudos de biotransformação utilizando fungos, mas pouco se sabe sobre como esses microrganismos transformam essas moléculas, e quais proteínas e vias metabólicas estão envolvidas nesses processos. A proteômica tornou-se uma das principais abordagens para analisar e compreender os sistemas biológicos. Dessa forma, o objetivo desse estudo foi compreender o processo de biotransformação do lapachol pelo fungo Phanerochaete chrysosporium, identificando os biotransformados, suas atividades biológicas e investigando o proteoma do fungo durante o bioprocesso a fim de identificar as proteínas e as vias metabólicas envolvidas. O fungo foi capaz de biotransformar o lapachol e gerou dois análogos, um já teve sua estrutura elucidada e é inédita na literatura. O proteoma intracelular foi analisado por eletroforese bidimensional e, após análises quanti e qualitativas, as proteínas selecionadas foram submetidas à espectrometria de massas por MALDI-TOF/TOF. Após análises, com a ferramenta de bioinformática BLAST2GO, determinou-se que as enzimas identificadas hiperabundante e ou exclusivas da condição lapachol estavam principalmente envolvidas com processos de detoxicação e resposta ao estresse oxidativo. Além disso, foram detectadas diversas enzimas com atividade de oxirredução. Além do mais, a técnica de Shotgun LC-MS/MS foi realizada. A identificação e quantificação (label-free) das proteínas foram feitas através da análise de dados MS/MS brutos pelo software MaxQuant/Andromeda. As diferenças nas expressões das proteínas identificadas entre os grupos foram computadas usando o software Perseus. Este estudo foi capaz de identificar um total de 221 proteínas intracelulares e 28 extracelulares, sendo que 54 proteínas intracelulares e 4 proteínas extracelulares foram estatisticamente diferentes ou únicas para uma condição (lapachol ou controle). Manganês-peroxidase e ?-glicosidase, ambas enzimas com interesse biotecnológico, foram identificadas exclusivas e aumentada, respectivamente na condição lapachol, desssa forma, o lapachol pode ser um bom agente pró-oxidante, pois estimulou a produção dessas enzimas oxidativas. Époxido desidrogenase e álcool desidrogenase parecem estar envolvidas na rota de biotransformação do lapachol, a primeira catalisando a abertura do epóxido e a segunda, reduzindo regioseletivamente carbonilas. O derivado PC01 mostrou-se mais tóxico para células de adenocarcinoma mamário que o lapachol e 3 e 5 vezes menos tóxico para células epiteliais normais que cisplatina e lapachol, respectivamente, mostrando-se um composto promissor. Esta é a primeira vez que a proteômica foi utilizada para investigar a biotransformação do lapachol. / Biotransformation is a promising strategy to discovery of new molecules with pharmaceutical and industrial interest. Fungi have demonstrated the ability to biotransform many natural and synthetic molecules. A very studied natural product of potential for the pharmaceutical industry is Lapachol, a naphthoquinone with a great diversity of biological activities. There are many biotransformation studies in the literature using fungi but little is known about how these microorganisms transform these molecules, which proteins and metabolic pathways are involved in these processes. Proteomics has become one of the main approaches for analyzing and understanding biological systems. The objective of the present study was to understand the biotransformation process of lapachol by Phanerochaete chrysosporium, identifying the biotransformed and its biological activities and investigating the fungus proteome during the bioprocess to identify the proteins and the metabolic pathways involved. After 24 h of bioprocessing, the fungus was able to biotransform lapachol and generated two analogues, one already had its structure elucidated and is unpublished in the literature. The intracellular proteome was analyzed by two-dimensional electrophoresis and, after quantitative and qualitative analyzes, the selected proteins were submitted to MALDI-TOF/TOF mass spectrometry. After analysis, with the BLAST2GO bioinformatics tool, it was determined that the enzymes identified as hyperabundant and exclusive to the lapachol condition were mainly involved with detoxification and oxidative stress response processes. Moreover, several enzymes with oxreduction activity were detected. In addition, the Shotgun LC-MS/MS technique was performed on intracellular and extracellular proteins. Identification and quantification (label-free) of the proteins were performed by the analysis of MS/MS raw data using MaxQuant/Andromeda software. Differences in the expressions of the proteins identified between the groups were computed using Perseus software. This study was able to identify a total of 221 intracellular and 28 extracellular proteins. 54 intracellular proteins and 4 extracellular proteins were different or unique statistics for a condition (lapachol or control). Manganese-peroxidase and ?-glycosidase, both enzymes of biotechnological interest, were identified exclusively and increased respectively in the lapachol condition, thus, lapachol may be a good pro-oxidant agent, since it stimulated the production of these oxidative enzymes. Epoxide dehydrogenase and alcohol dehydrogenase appear to be involved in the lapachol biotransformation route, the first catalyzing the epoxide opening and the second, regioselectively reducing carbonyls. The PC01 derivative was shown to be more toxic to mammary adenocarcinoma cells than lapachol and approximately 3 to 5 times less toxic to normal epithelial cells than cisplatin and lapachol, showing a promising compaund. To our best knowledge, this is the first time that proteomics has been used to investigate the biotransformation of lapachol.

Ao longo dos últimos anos, tornou-se evidente que o início e a progressão do câncer dependem de vários componentes do microambiente tumoral, incluindo células imunes e inflamatórias, fibroblastos, células endoteliais, adipócitos e matriz extracelular. Estes componentes e as células neoplásicas interagem entre si e trocam sinais pró e antitumor. O presente estudo teve como objetivo analisar o secretoma de células neoplásicas sob estresse e seu efeito no microambiente tumoral. Para este fim, duas linhagens celulares de carcinoma epidermóide de cabeça e pescoço foram cultivadas em duas condições de estresse: hipóxia e radiação. Os meios condicionados por estas células (secretoma 1) e o seu controle foram utilizados para cultivar células neoplásicas e fibroblastos humanos normais da cavidade oral. Os resultados sugerem que os sinais derivados das células neoplásicas em resposta a estresse dirigem a expressão gênica e proteica, bem como o comportamento celular das células vizinhas. Foram identificadas 38 proteínas celulares e nove proteínas secretadas com expressão aumentada e 61 proteínas celulares e 70 secretadas com expressão reduzida em células neoplásicas sob estresse hipóxico. Também foram identificadas 59 proteínas celulares e 29 proteínas secretadas com expressão aumentada e 59 proteínas celulares e 19 secretadas com expressão reduzida em células neoplásicas e fibroblastos humanos normais tratados com o meio condicionado por células sob estresse hipóxico. O secretome de células sob estresse não foi capaz de induzir proliferação de células neoplásicas e fibroblastos humanos normais, mas promoveu migração e invasão. Os resultados podem contribuir para o melhor entendimento do efeito dos fatores parácrinos liberados pelas células neoplásicas sobre a expressão gênica, bem como sobre o comportamento das células tumorais e estromais / Over the past years, it has become evident that cancer initiation and progression depends on several components of the tumor microenvironment, including inflammatory and immune cells, fibroblasts, endothelial cells, adipocytes, and extracellular matrix. These components and the neoplastic cells interact with each other providing pro and antitumor signals. The present study aimed to analyze the secretome of cancer cells under stress and their effect on the tumor microenvironment. For this purpose, two cell lines from head and neck carcinomas were cultured in two stress conditions - hypoxia and radiation. The medium conditioned by these cells (secretome 1) and their control were used to grow untreated neoplastic cells and normal human fibroblasts from oral cavity. Our results showed that signals derived from cancer cells in response to stress drive gene and protein expression and cell behavior. Thirty-eight overexpressed cellular and 9 secreted proteins, and 61 underexpressed cellular and 70 secreted proteins were identified in neoplastic cells under hypoxic stress. Fifty-nine overexpressed cellular and 29 secreted proteins, and 59 underexpressed cellular and 19 secreted proteins were identified in neoplastic cells and normal human fibroblasts treated with the medium conditioned by cells under hypoxic stress. The secretome of cells under stress was not able to induce proliferation of cancer cells and normal human fibroblasts, but promoted migration and invasion. The results may contribute to understand the effect of paracrine factors released by neoplastic cell on gene expression as well as on stromal and tumor cells behavior

Orientador: Fernanda da Cruz Landim / Resumo: As células-tronco mesenquimais (MSCs) exercem seus efeitos terapêuticos predominantemente pela sua atividade parácrina. Como o secretoma desempenha um papel direto nas atividades biológicas das MSCs, a análise de seus componentes proteicos é um passo fundamental para identificar os principais responsáveis no controle e regulação dos muitos processos biológicos desenvolvidos por essas células. O secretoma de MSCs pode ser modificado e melhorado de forma in vitro para estimular efeitos celulares específicos desejados para aplicações terapêuticas, e uma maneira de modificá-lo é por meio de modificações nas condições de cultura. No presente estudo, objetivou-se descrever o secretoma de células-tronco mesenquimais derivadas de tecido adiposo (AD-MSCs) de gatos e cães submetidos a diferentes condições de cultivo, identificamos e comparamos os efeitos exercidos por diferentes modificações de cultivo. Para a produção de meio condicionado, as células foram descongeladas e cultivadas com meio DMEM/F12 com 20% de FBS, suplementado com antibióticos e antimicóticos em uma incubadora com umidade controlada a 37,5 °C, e 5% de CO2. Após atingir pelo menos 70% de confluência, as garrafas foram lavadas três vezes com solução salina balanceada Hanks (HBSS) e foram cultivadas em quatro condicionamentos distintos. O meio condicionado foi colhido após 4 dias, centrifugado por 10 min/300 g, filtrado em um filtro 0,22 μm e congelado a -80 °C. Foram realizadas a extração e concentração proteica de to... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: It is now known that mesenchymal stem cells (MSCs) exert their therapeutic effects predominantly through their paracrine activity. Since the secretome plays a direct role in the biological activities of MSCs, the analysis of their protein components is a fundamental step in identifying the main responsible for the control and regulation of the many biological processes developed by these cells. The MSCs secretome can be modified and improved in vitro to stimulate specific cellular effects desired for therapeutic applications, and one way of modifying it is through modifications in the culture conditions. In the present study, in addition to describing for the first time the secretome of mesenchymal stem cells derived from adipose tissue (AD-MSCs) in feline species, we identified and compared the effects exerted by different culture modifications, such as the use of serum-free medium and hypoxia in the protein production by AD-MSCs in canines and felines. For the conditioned media production, the cells were thawed and cultured with DMEM/F12 medium with 20% fetal bovine serum (FBS), supplemented with antibiotics and antimycotics in controlled incubator ay 37.5 °C with 5% CO2. After reaching at least 70% confluency, the flasks were washed three times with Hanks balanced salt solution (HBSS) and were grown in four different conditions. Conditioned media were collected after 4 days, centrifuged for 10 min/300 g, filtered on a 0.22 μm filter and frozen at -80 °C. Protein extraction... (Complete abstract click electronic access below) / Mestre

Células multipotentes mesenquimais estromais (CTM) são células adultas multipotentes que podem ser isoladas a partir de diferentes tecidos e são capazes de atingir sítios danificados, exercer papéis na regeneração tecidual e modular a resposta imune. Estas células demonstraram resultados discrepantes em estudos in vivo dependentes de sua fonte de obtenção. Há na literatura hipóteses de que o mecanismo predominante pelo qual as CTMs atuam no reparo tecidual estaria relacionado à sua atividade parácrina, criando um microambiente com sinais tróficos. Nesse sentido, a avaliação do conteúdo do secretoma destas células é de grande interesse. Portanto, este projeto teve como objetivo analisar o meio condicionado de CTMs obtidas de diferentes fontes (tecido adiposo, músculo esquelético e tubas uterinas) de mesmos indivíduos. A abordagem experimental consistiu em proteômica shotgun (nanocromatografia líquida acoplada a espectrometria de massas em tandem) com o intuito de identificar alvos diferentemente expressos entre as culturas que possam sugerir funções específicas de cada linhagem celular. Os dados espectrais foram obtidos pelo modo de aquisição dependente de dados (Top15). Os dados adquiridos foram processados pelas plataformas MaxQuant e TPP (Trans-Proteomic Pipeline). Foi realizada análise qualitativa de vias enriquecidas por meio do programa Ingenuity utilizando as proteínas em comum nos secretoma de todas as CTMs analisadas. Essa análise permitiu observar vias enriquecidas de proliferação celular, migração celular e desenvolvimento do sistema cardiovascular, demonstrando que as proteínas secretadas por quaisquer das CTMs analisadas podem ser relacionadas a resultados encontrados na literatura utilizando estas células para terapias para patologias. As análises estatísticas para determinar se haveria dependência da composição do secretoma em função do indivíduo doador ou tecido fonte das CTMs revelaram proteínas diferencialmente expressas entre todos os grupos. Estas proteínas diferencialmente expressas são relacionadas à proliferação, sinalização e interação celular, além de modulação do sistema imune e da angiogênese. Neste contexto, podemos concluir que o secretoma das CTMs é muito semelhante, que as CTMs isoladas de quaisquer tecidos ou indivíduos são capazes de secretar moléculas que possivelmente exercem benefícios em determinado tratamento. Entretanto, estes benefícios podem ser exacerbados ou suprimidos pelas moléculas diferencialmente expressas, as quais são dependentes tanto dos tecidos quanto dos indivíduos dos quais as CTMs foram obtidas / Multipotent Mesenchymal Stromal Cells (MSCs) are multipotent adult cells that can be isolated from different tissues and are able to reach damaged sites, play a role in tissue regeneration and modulate immune response. These cells showed conflicting results in studies in vivo depending on their tissue origin. It is hypothesised that the predominant mechanism by which MSCs function could be related to its paracrine activity, creating a microenvironment with trophic signals. Accordingly, the evaluation of the content of the secretome of these cells is of great interest. Towards this end, this project analyzed the proteins of conditioned medium of MSCs obtained from different sources from the same donors (adipose tissue, uterine tubes and skeletal muscle). The MSCs were characterized by flow cytometry for the presence of membrane markers and by differentiation in vitro into adipocytes, chondrocytes, and osteoblasts. The conditioned media were obtained and the protein profile was analysed by liquid nanochromatography coupled to tandem mass spectrometry. Spectral data were obtained by full-acquisition mode MS / dd-MS2 (Top15). The acquired data were processed by MaxQuant software and TPP (Trans-Proteomic Pipeline). Qualitative analysis of enriched pathways through the Ingenuity program using the shared proteins between the cell lineages was performed.It showed enriched pathways related to cell proliferation, cell migration and development of the cardiovascular system. This allows considering that the secreted proteins from the analyzed MSCs might be related to findings in the literature using these cells for therapies. After this, the proteins were analyzed for differential expression by comparing the MSCs into groups of different sources or different donors. In which were observed differentially expressed proteins related to proliferation, cell signaling and interaction, modulation of the immune system and angiogenesis. In this context, we can conclude that MSC\'s secretome is very similar in the analyzed lineages, and that any MSCs are able to secrete molecules which potentially exert for certain treatment benefits. However, these benefits can be exacerbated or annulled by differentially expressed molecules, which are dependent both as the individual and tissues from which MSCs were obtained

Orientador: Robson Francisco Carvalho / Resumo: A caquexia é uma síndrome metabólica complexa que frequentemente acomete pacientes portadores de neoplasia maligna em estádio clínico avançado. Caracteriza-se pela perda de massa muscular (com ou sem perda de tecido adiposo), a qual não pode ser completamente revertida por suporte nutricional. As vias moleculares responsáveis pela caquexia não estão completamente esclarecidas, entretanto, os avanços em estudos genômicos, transcriptômicos e proteômicos no câncer tem auxiliado na compreensão da importante relação entre o secretoma tumoral com alterações em órgãos e tecidos adjacentes ou distantes do tumor. Evidências têm demonstrado que componentes do secretoma do ambiente tumoral, incluindo citocinas pró-inflamatórias, possuem um papel fundamental no desenvolvimento de alterações metabólicas que resultam em sarcopenia (perda de função e massa muscular) em pacientes caquéticos. A perda de massa muscular é considerada um importante fator prognóstico de caquexia para pacientes com carcinomas de pulmão de células não pequenas (CPCNP) e, portanto, a avaliação de área muscular utilizando-se de tomografias computadorizadas (CTs) tem sido utilizada com grande eficácia para determinar a sobrevida e a presença de caquexia e sarcopenia nesses pacientes. Portanto, a hipótese desse trabalho é que a integração de dados clínicos e prognósticos, área dos músculos peitorais obtidas por CTs e perfil transcricional tumoral permitirá identificar potenciais biomarcadores de caquexia no secretoma d... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Cachexia is a metabolic syndrome characterized by an ongoing loss of skeletal muscle mass (with or without loss of adipose tissue) that cannot be fully reversed by conventional nutritional support, most found in patients with advanced cancer. The molecular pathways of cancer cachexia are not completely known. The advances in genomic, transcriptomic and proteomic studies in cancer have helped in understanding the relationship of the tumor's secretome with changes in organs and tissues adjacent to or distant from the tumor. Evidences show that components of the tumor secretome, including pro-inflammatory cytokines, play a key role in metabolic alterations that result in sarcopenia (loss of muscle mass and function) of cachectic patients. Loss of skeletal muscle mass is important prognostic factor for cachexia in patients with non-small cell lung cancer (NSCLC), thus the evaluation of muscular area using computed tomography (CT) has been effective in determine survival and the presence of cachexia and sarcopenia in these patients. Therefore, our hypothesis is that the integration of clinical and prognostic data, pectoralis muscle area obtained by CTs, and tumor transcriptional profile will allow the identification of potential biomarkers of cachexia in the secretome of non-small cell lung carcinomas. To do this, 89 CTs from patients with NSCLC, available on the TCIA (The Cancer Imaging Archive) platform were used to measure the pectoralis muscle area, and to select patients with... (Complete abstract click electronic access below) / Mestre

Células multipotentes mesenquimais estromais (CTM) são células adultas multipotentes que podem ser isoladas a partir de diferentes tecidos e são capazes de atingir sítios danificados, exercer papéis na regeneração tecidual e modular a resposta imune. Estas células demonstraram resultados discrepantes em estudos in vivo dependentes de sua fonte de obtenção. Há na literatura hipóteses de que o mecanismo predominante pelo qual as CTMs atuam no reparo tecidual estaria relacionado à sua atividade parácrina, criando um microambiente com sinais tróficos. Nesse sentido, a avaliação do conteúdo do secretoma destas células é de grande interesse. Portanto, este projeto teve como objetivo analisar o meio condicionado de CTMs obtidas de diferentes fontes (tecido adiposo, músculo esquelético e tubas uterinas) de mesmos indivíduos. A abordagem experimental consistiu em proteômica shotgun (nanocromatografia líquida acoplada a espectrometria de massas em tandem) com o intuito de identificar alvos diferentemente expressos entre as culturas que possam sugerir funções específicas de cada linhagem celular. Os dados espectrais foram obtidos pelo modo de aquisição dependente de dados (Top15). Os dados adquiridos foram processados pelas plataformas MaxQuant e TPP (Trans-Proteomic Pipeline). Foi realizada análise qualitativa de vias enriquecidas por meio do programa Ingenuity utilizando as proteínas em comum nos secretoma de todas as CTMs analisadas. Essa análise permitiu observar vias enriquecidas de proliferação celular, migração celular e desenvolvimento do sistema cardiovascular, demonstrando que as proteínas secretadas por quaisquer das CTMs analisadas podem ser relacionadas a resultados encontrados na literatura utilizando estas células para terapias para patologias. As análises estatísticas para determinar se haveria dependência da composição do secretoma em função do indivíduo doador ou tecido fonte das CTMs revelaram proteínas diferencialmente expressas entre todos os grupos. Estas proteínas diferencialmente expressas são relacionadas à proliferação, sinalização e interação celular, além de modulação do sistema imune e da angiogênese. Neste contexto, podemos concluir que o secretoma das CTMs é muito semelhante, que as CTMs isoladas de quaisquer tecidos ou indivíduos são capazes de secretar moléculas que possivelmente exercem benefícios em determinado tratamento. Entretanto, estes benefícios podem ser exacerbados ou suprimidos pelas moléculas diferencialmente expressas, as quais são dependentes tanto dos tecidos quanto dos indivíduos dos quais as CTMs foram obtidas / Multipotent Mesenchymal Stromal Cells (MSCs) are multipotent adult cells that can be isolated from different tissues and are able to reach damaged sites, play a role in tissue regeneration and modulate immune response. These cells showed conflicting results in studies in vivo depending on their tissue origin. It is hypothesised that the predominant mechanism by which MSCs function could be related to its paracrine activity, creating a microenvironment with trophic signals. Accordingly, the evaluation of the content of the secretome of these cells is of great interest. Towards this end, this project analyzed the proteins of conditioned medium of MSCs obtained from different sources from the same donors (adipose tissue, uterine tubes and skeletal muscle). The MSCs were characterized by flow cytometry for the presence of membrane markers and by differentiation in vitro into adipocytes, chondrocytes, and osteoblasts. The conditioned media were obtained and the protein profile was analysed by liquid nanochromatography coupled to tandem mass spectrometry. Spectral data were obtained by full-acquisition mode MS / dd-MS2 (Top15). The acquired data were processed by MaxQuant software and TPP (Trans-Proteomic Pipeline). Qualitative analysis of enriched pathways through the Ingenuity program using the shared proteins between the cell lineages was performed.It showed enriched pathways related to cell proliferation, cell migration and development of the cardiovascular system. This allows considering that the secreted proteins from the analyzed MSCs might be related to findings in the literature using these cells for therapies. After this, the proteins were analyzed for differential expression by comparing the MSCs into groups of different sources or different donors. In which were observed differentially expressed proteins related to proliferation, cell signaling and interaction, modulation of the immune system and angiogenesis. In this context, we can conclude that MSC\'s secretome is very similar in the analyzed lineages, and that any MSCs are able to secrete molecules which potentially exert for certain treatment benefits. However, these benefits can be exacerbated or annulled by differentially expressed molecules, which are dependent both as the individual and tissues from which MSCs were obtained

Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / Aspergillus fumigatus é o principal agente etiológico da aspergilose invasiva, infecção fúngica oportunista com altas taxas de mortalidade afetando, principalmente, pacientes com neutropenia profunda e prolongada. Durante o processo de invasão e disseminação características desta infecção sistêmica, os conídios do fungo inalados e não eliminados pelas células do sistema imune inato diferenciam-se em hifas que, por sua vez, são angioinvasivas. Pouco se conhece sobre as moléculas da parede celular envolvidas na patogênese do A. fumigatus e/ou secretadas por este patógeno. Neste contexto, este trabalho procura ampliar o entendimento desta doença através do estudo de proteínas diferencialmente expressas na superfície de A. fumigatus durante a morfogênese. Foi utilizada uma abordagem proteômica e foram estudados extratos de superfície de células de A. fumigatus em diferentes estágios durante o processo de filamentação. Estas células foram denominadas, de acordo com o tempo de cultivo e a morfologia, como: TG6h (tubo germinativo), H12h ou H72h (hifas). As proteínas de superfície celular foram extraídas, a partir de células intactas, por tratamento brando com o agente redutor DTT (ditiotreitol). Observou-se que o perfil funcional das proteínas expressas por H12h e H72h foi similar, com exceção de proteínas relacionadas à resposta ao estresse, enquanto o perfil para TG6h apresentou diferenças significativas para vários grupos funcionais de proteínas quando comparado às hifas. Desta forma, foram realizados experimentos de proteômica diferencial entre tubo germinativo (TG6h) e a hifa madura (H72h), pela técnica de DIGE (differential gel electrophoresis). Os resultados revelaram que entre as proteínas diferencialmente expressas, aquelas relacionadas às vias de biossíntese e outras denominadas multifuncionais encontraram-se superexpressas em TG6h. Em relação às proteínas de resposta a estresse, observou-se que algumas HSPs eram mais expressas neste morfotipo, enquanto a MnSOD, relativa à resposta ao estresse oxidativo, era mais abundante na hifa. Com exceção da PhiA, integrante da parede celular, as proteínas identificadas como diferencialmente expressas na superfície do A. fumigatus não possuem sinal para secreção identificável, enquadrando-se nas proteínas atípicas de superfície. Foi verificada a integridade da membrana celular após tratamento com DTT, bem como a marcação por biotina das proteínas extraídas, o que comprovou sua localização superficial na célula fúngica. Hipóteses de que estas proteínas sejam endereçadas à parede celular por via secretória alternativa sustentam estes dados. Estas evidências foram confirmadas pelo fato de não terem sido encontradas as mesmas proteínas da superfície na análise do secretoma do A. fumigatus. Além disso, todas as proteínas caracterizadas no secretoma apresentavam sinal de secreção determinado pelo FunSecKB (www.proteomics.ysu.edu/secretomes/fungi.php). A análise do secretoma foi realizada utilizando-se a cepa selvagem AF293 e a mutante ∆prtT, mutante para um fator de transcrição que atua na regulação da secreção de proteases. Os resultados revelam a ALP1 como expressa na cepa selvagem, assim como outras proteases importantes para virulência e desenvolvimento da célula fúngica, estando suprimidas quando o gene prtT foi deletado. / Aspergillus fumigatus is the main etiologic agent of invasive aspergillosis (IA), a opportunistic a life-threatening disease for immunocompromised hosts, especially those with acute and prolonged neutropenia. During the invasion and dissemination, which occurs in this systemic infection, the A. fumigatus conidia, after its inhalation, germinates into angioinvasive hyphae in case the innate immune response fails in eliminate these cells. Little is known about the cell wall molecules and/or the secreted proteins involved on the A. fumigatus pathogenesis, at this context the present work aims to amplify the knowledge about the aspergillosis by studying the differentially surface proteins of A. fumigatus during the filamentation process. These cells were denominated according to their morphology and their growth time as: TG6h (germ tubes), H12h and H72h (hyphae). The surface proteins were mildly extracted from intact cells using the reducing agent DTT (dithiothreitol). The functional profile of the H12h and H72h were similar except for the stress response proteins, while the TG6h presented significant differences for several functional groups. On this base, the DIGE (differential gel electrophoresis) was performed using the surface extracted proteins of the germ tubes (TG6h) and mature hyphae (H72h) cells. The results indicate that multiple functional proteins and proteins related to the biosynthesis pathways were overexpressed at TG6h. Some stress response proteins as the HSPs were overexpressed on this morphotype while the MnSOD, oxidative stress responsive protein, was most abundant at the hyphae. PhiA, an integrant protein of the cell wall, was the only protein with a secretion signal sequence. All other proteins identified on the cell surface lack an identifiable secretion sign, and are denominated atypical proteins. The plasma membrane integrity was verified after the mild extraction using DTT, and also the biotinylation of the cell extracted proteins, which ensured these proteins surface localization on the fungal cell. There are hypothesis that some proteins can be transport to the cell wall by alternative pathways and support the results found for this work. These evidences were confirmed by the fact that the proteins identified at the surface were not the same identified on the A. fumigatus secretome. Besides, all proteins identified on the secretome presented secretion signal determinate by the FunSecKB (www.proteomics.ysu.edu/secretomes/fungi.php). The secretome analysis was performed using the wild type AF293 and the ∆prtT mutant, lacking a transcription factor that regulates proteases secretion. The results demonstrate ALP1 overexpressed on the wild type and also other proteases important to virulence and development of the fungal cell suppressed when prtT was deleted.