Submitted by Nathália Faria da Silva (nathaliafsilva.ufv@gmail.com) on 2017-06-19T12:11:19Z No. of bitstreams: 1 resumo.pdf: 14708 bytes, checksum: ee6ebfef2e7d5008fceffdd053b1d02d (MD5) / Made available in DSpace on 2017-06-19T12:11:19Z (GMT). No. of bitstreams: 1 resumo.pdf: 14708 bytes, checksum: ee6ebfef2e7d5008fceffdd053b1d02d (MD5) Previous issue date: 2005-09-19 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / A remediação de áreas contaminadas com petróleo ou seus derivados pode ser realizada com a utilização de bactérias que apresentem características que possibilitem a degradação desses compostos ou sua transformação em formas menos tóxicas. Os processos de biorremediação requerem muitas vezes o transporte de microrganismos selecionados através de matrizes porosas com baixa condutividade hidráulica, o que pode ser alcançado pela técnica de eletrocinese. Esse processo pode resultar em condições de meio estressante para as bactérias, levando a modificações das características da superfície celular, da capacidade de adesão e, conseqüentemente, da eficiência de transporte. Este trabalho teve por objetivos estudar as propriedades da superfície celular que influenciam a adesão de isolados de bactérias a um solo franco argiloso; as alterações dessas características mediadas pela escassez de nitrogênio; e a aplicação da eletrocinese, no mesmo solo, como ferramenta para o transporte de esporos de Bacillus subtilis LBBMA 155 e de células desnutridas de Pseudomonas sp. LBBMA 81A. As bactérias com menores valores de hidrofobicidade e de cargas celulares superficiais positivas, caracterizadas como Stenotrophomonas maltophilia LBBMA 105A e isolados LBBMA F3 e 86 (não-identificados), apresentaram também as menores tendências de adesão às partículas de solo. As propriedades da superfície celular que afetam a adesão das bactérias às partículas de solo foram alteradas durante a manutenção das células em meio com escassez de nitrogênio. As modificações apresentaram um padrão diferenciado para cada um dos isolados testados. Portanto, o emprego da desnutrição requer criteriosa avaliação para vislumbrar se as alterações resultantes atendem aos requisitos necessários para a utilização das células desnutridas em uma dada aplicação biotecnológica. No ensaio de transporte mediado pela eletrocinese, as células vegetativas desnutridas de Pseudomonas sp. LBBMA 81A e os esporos de Bacillus subtilis LBBMA 155 foram distribuídos hiperbolicamente ao longo de todo o corpo-de-prova, constituído de cilindro de solo adensado. Os esporos de B. subtilis LBBMA 155 foram transportados com maior eficiência do que as células vegetativas desnutridas de Pseudomonas sp. A tendência de adesão ao solo não foi fator determinante no transporte das células. O maior transporte dos esporos de B. subtilis foi atribuído ao maior valor de cargas superficiais negativas nessa estrutura. Este trabalho demonstra que a eletrocinese pode ser utilizada para o transporte de bactérias em solos com baixa condutividade hidráulica. / The remediation of petroleum-contaminated sites can be accomplished by using bacterial strains able to degrade or to transform the compounds to less toxic forms. For some bioremediation designs, the transport of selected microorganism through porous matrix is required. The transport of bacterial cells through porous media with low hydraulic conductivity can be facilitated by electrokinesis. The change in cell surface properties in the presence of electric currents is of concern when the potential to manipulate bacterial movement with electric fields is conceived. Also, during transportation, the bacteria may be subjected to stress conditions, like nutrient limitation, which may change their physiological state. Consequently, the cell surface characteristics and adhesion capacity may be altered, affecting the transport efficiency. The aim of this work was to study the effects of cellular surface characteristics in adhesion properties and electrokinesis-facilitated transport of bacterial strains, isolated from petroleum-contaminated environment, in a silt-loam soil. Bacterial strains with low cell surface hydrophobicity and low positive charges, identified as Stenotrophomonas maltophilia LBBMA 105A and the strains LBBMA F3 and 86 (not xiiidentified), had the lowest adhesion to soil particles. The bacterial strains had different patterns of changes in cellular surface properties that affect the bacterial adhesion to soil particles during cultivation in nitrogen-limited medium. Nitrogen-starved vegetative cells of Pseudomonas sp. LBBMA 81A and endospores of Bacillus subtilis LBBMA 155 were hyperbolically distributed through the compacted soil cylinder during the electrokinetic transportation assay. The transportation efficiency of Bacillus subtilis LBBMA 155 spores was higher than of Pseudomonas sp. starved vegetative cells. The soil adhesion property was not the determining factor for cell transportation. The higher transport efficiency of endospores was attributed to their higher negative charges values. It is concluded that the electrokinesis technique can be used for bacteria transportation in soils characterized by low hydraulic conductivity.

Made available in DSpace on 2015-07-22T20:50:45Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2008-02-27. Added 1 bitstream(s) on 2015-08-11T03:25:43Z : No. of bitstreams: 1 Publico-10767a.pdf: 1296672 bytes, checksum: 6f8ba558bac665a25fad4ca2e64a288c (MD5). Added 1 bitstream(s) on 2015-08-11T03:25:43Z : No. of bitstreams: 2 Publico-10767a.pdf: 1296672 bytes, checksum: 6f8ba558bac665a25fad4ca2e64a288c (MD5) Publico-10767b.pdf: 1513875 bytes, checksum: b0bbfd84ceaf858aad2bc6c9a3aaa160 (MD5) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / Introducao: O LPS induz a ativacao celular apos ligacao com CD14 e TLR4. A forma R de LPS (sem o polissacarideo O) pode ativar de forma independente de CD14. Neutrofilos e monocitos diferem de forma expressiva em sua expressao de CD14 na superficie. Objetivos: Comparar a acao biologica de formas R e S de LPS em neutrofilos e monocitos do sangue periferico de humanos. Metodos: A modulacao de receptores de superficie celular foi observada em monocitos e neutrofilos, e producao de especies reativas de oxigenios (EROs) e de oxido nitrico (NO), alem de ativacao de p38 e NFƒÈB foram avaliadas em neutrofilos por citometria de fluxo, apos incubacao com r e sLPS. Resultados: Houve uma pequena alteracao de TLR4 em monocitos com 6 h de incubacao, enquanto nenhuma modulacao foi vista para TLR2 em ambas as celulas. A modulacao de CD14 na superficie de monocitos mostrou-se bifasica, havendo incremento inicial na primeira hora seguida de queda com 6 h. Nao foi observada modulacao de CD14 na superficie de neutrofilos. Ambas as formas de LPS levaram a inducao de CD66b na superficie de neutrofilos, efeito que permanece pelo menos ate 24 h de incubacao. CD11b foi aumentado em neutrofilos e monocitos por r e sLPS, chegando ate 4 vezes a expressao depois de 3h, enquanto que a expressao CXCR2 cai em poucos minutos e permanece reduzida em neutrofilos. A expressao de HLADR foi aumentada nos monocitos no tempo de 3h. O efeito do sLPS na expressao de CD11b, CD66b e CXCR2 em neutrofilos mostrou-se um pouco mais precoce. Ambas as formas de LPS induziram pequena producao de NO e de EROs, quando comparadas com outros estimulos, assim como a translocacao de NFƒÈB p65 e p50 e ativacao de p38. Conclusoes: as formas R e S de LPS ativam similarmente os neutrofilos, apesar de sua baixa expressao de CD14 na superficie. Enquanto proteinas do soro podem otimizar a acao do LPS e sCD14 pode suprir a falta de CD14 em neutrofilos, e interacoes com monocitos podem ter seu papel na resposta dessas celulas ao LPS, e provavel que outros receptores estejam envolvidos na sinalizacao ao LPS em neutrofilos. Uma modulacao complexa de receptores de superficie foi vista em ambas as celulas com aumento ou decrescimo dependendo do receptor avaliado. / Objective: To compare the biological action of R form and S form LPS in human peripheral blood neutrophils and monocytes. Methods: Cell surface receptors modulation, ROS and NO production were evaluated on monocytes and neutrophils in whole blood, and NF-êB activation was evaluated in isolated neutrophils by flow cytometry after incubation with R and S-LPS. Results: A small enhancement of TLR4 expression was observed on monocytes with 6 h stimulation whereas no modulation of TLR2 was seen on either cell. Modulation of CD14 on monocytes was biphasic, with initial increment in the first hour followed by decreased expression at 6 h. Both LPS increased CD66b expression on neutrophils. Expression of CD11b was rapidly up-regulated on monocytes and neutrophils by both LPS, while down regulation of CXCR2 expression on neutrophils was observed after a few minutes, lasting for 6 h. S-LPS effect on neutrophils expression of CD11b, CD66b and CXCR2 receptors was a little earlier than the R-LPS effect. Both LPS induced low production of ROS and NO compared to other stimuli, as well as NF-êB translocation. Conclusions: A complex LPS-induced cell surface receptors modulation was seen on monocytes and neutrophils in human blood, with up and down regulation depending on the receptors evaluated. R for and S form LPS have similarly activated human neutrophils, despite the low expression of CD14 in those cells. While the presence of LBP and of sCD14 could provide the requirements for S-form LPS induction of neutrophils activity in whole blood, other receptors are also likely to be involved in LPS cell signaling in neutrophils. / FAPESP: 04/15584-2 / FAPESP: 05/58015-7 / TEDE / BV UNIFESP: Teses e dissertações

Made available in DSpace on 2015-05-22T18:39:46Z (GMT). No. of bitstreams: 2 205.pdf: 9690781 bytes, checksum: bd62c9f01057cb9da28f662e58478715 (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2013 / Fundação Oswaldo Cruz. Centro de Pesquisas Aggeu Magalhães. Recife, PE, Brasil / A resistência de Culex quinquefasciatus à toxina inseticida (Bin) de Bacillus sphaericus (Bsp) pode estar associada a uma falha da ligação da toxina com os receptores Cqm1, localizados no microvilli intestinal das larvas através de uma âncora GPI. Mutações no gene cqm1 podem impedir a expressão de proteínas Cqm1 funcionais e gerar um alto nível de resistência. O objetivo deste trabalho foi caracterizar e avaliar a frequência de alelos de resistência (r) em populações e colônias de C. quinquefasciatus. Neste estudo, o alelo r cqm1REC, selecionado e identificado anteriormente na colônia R2362, foi detectado por PCR alelo-específica em quatro populações de Recife com frequências entre 0,001 e 0,017. Em duas populações foram identificados novos alelos r, o cqm1REC-D16 e o cqm1REC- D25, com frequência entre 0,002-0,006. Estes alelos são caracterizados por deleções de 16 e 25-nt, respectivamente, as quais geram códon de terminação da tradução prematuro (CTTP) e não codificam proteínas com âncora GPI. Um segundo alelo r (cqm1REC- 2) foi identificado na colônia R2362 e possui uma mutação nonsense (G1292A) que também gera um CTTP, impedindo a localização de receptores Cqm1 no epitélio. O alelo cqm1REC-2 foi co-selecionado com o cqm1REC na colônia R2362 e uma análise da competição entre eles mostrou que o cqm1REC-2 predomina sob pressão de seleção com Bsp, enquanto que o cqm1REC é majoritário na ausência de Bsp. A expressão relativa dos alelos cqm1REC e cqm1REC-2, avaliada por PCR em tempo real, mostrou que ambos possuem uma expressão significativamente menor em relação ao cqm1. Amostras de microvilli intestinal de larvas homozigotas para cada alelo apresentaram uma baixa capacidade de interação com a toxina Bin, corroborando os dados de expressão gênica e o fenótipo de resistência. Este estudo mostrou a detecção e caracterização de novos alelos de C. quinquefasciatus que conferem resistência a Bsp e estes dados são fundamentais para o diagnóstico e manejo da resistência em programas de controle

Made available in DSpace on 2015-06-08T13:58:12Z (GMT). No. of bitstreams: 2 35.pdf: 4189785 bytes, checksum: eff0f086b83e9099a7bd3e2495feb229 (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2014 / Fundação Oswaldo Cruz. Centro de Pesquisas Aggeu Magalhães. Recife, PE, Brasil / A toxina Binária (Bin) é o principal fator tóxico da bactéria entomopatógena Lysinibacillus sphaericus e sua ação em Culex quinquefasciatus depende da ligação com receptores no intestino das larvas. Os receptores são as a-glicosidases Cqm1, localizadas no epitélio, ligadas por uma âncora de glicosil-fosfatidilinositol. Larvas de Aedes aegypti são refratárias à toxina, pois, não apresentam receptores funcionais, apesar de apresentarem um gene que codifica a proteína Aam1, com alta similaridade à Cqm1. Devido às lacunas a respeito do espectro de ação da toxina Bin, o objetivo deste estudo foi identificar epitopos de ligação da toxina no receptor Cqm1 e determinar a base molecular da sua ação para estas espécies de vetores. Os resultados obtidos a partir da análise comparativa das proteínas Cqm1 e Aam1 levaram à identificação de um epitopo da toxina Bin no receptor Cqm1, situado uma alça na região N-terminal S129-A312. Este epitopo é composto pelos aminoácidos 155PATGGG160, não conservados em Aam1 (158AETGKL163), e os resíduos 159GG160 são críticos para a ligação com a Bin. A análise da proteína ortóloga Aam1 demonstrou que esta é expressa em larvas de Ae. aegypti, semelhante à Cqm1, porém ela não é capaz de ligar-se à toxina Bin. Uma diferença marcante da proteína Aam1 é sua glicosilação, entretanto, a remoção de carboidratos da proteína não afetou o padrão de ligação à toxina Bin. A análise da Cqm1 mostrou que os glicanos não são necessários para a interação com a toxina Bin e que possivelmente esta proteína não parece ser glicosilada. O estudo mostrou que um pequeno segmento de resíduos da região da proteína Cqm1, com baixa conservação em Aam1, é crítica para a ligação da toxina Bin e sugere que esta poderia ser a causa da refratariedade das larvas de Ae. aegypti. Os resultados deste estudo são relevantes para elucidar a base molecular do modo de ação de L. sphaericus e abrem perspectivas para a busca de outros determinantes moleculares envolvidos neste processo

Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / Aspergillus fumigatus é o principal agente etiológico da aspergilose invasiva, infecção fúngica oportunista com altas taxas de mortalidade afetando, principalmente, pacientes com neutropenia profunda e prolongada. Durante o processo de invasão e disseminação características desta infecção sistêmica, os conídios do fungo inalados e não eliminados pelas células do sistema imune inato diferenciam-se em hifas que, por sua vez, são angioinvasivas. Pouco se conhece sobre as moléculas da parede celular envolvidas na patogênese do A. fumigatus e/ou secretadas por este patógeno. Neste contexto, este trabalho procura ampliar o entendimento desta doença através do estudo de proteínas diferencialmente expressas na superfície de A. fumigatus durante a morfogênese. Foi utilizada uma abordagem proteômica e foram estudados extratos de superfície de células de A. fumigatus em diferentes estágios durante o processo de filamentação. Estas células foram denominadas, de acordo com o tempo de cultivo e a morfologia, como: TG6h (tubo germinativo), H12h ou H72h (hifas). As proteínas de superfície celular foram extraídas, a partir de células intactas, por tratamento brando com o agente redutor DTT (ditiotreitol). Observou-se que o perfil funcional das proteínas expressas por H12h e H72h foi similar, com exceção de proteínas relacionadas à resposta ao estresse, enquanto o perfil para TG6h apresentou diferenças significativas para vários grupos funcionais de proteínas quando comparado às hifas. Desta forma, foram realizados experimentos de proteômica diferencial entre tubo germinativo (TG6h) e a hifa madura (H72h), pela técnica de DIGE (differential gel electrophoresis). Os resultados revelaram que entre as proteínas diferencialmente expressas, aquelas relacionadas às vias de biossíntese e outras denominadas multifuncionais encontraram-se superexpressas em TG6h. Em relação às proteínas de resposta a estresse, observou-se que algumas HSPs eram mais expressas neste morfotipo, enquanto a MnSOD, relativa à resposta ao estresse oxidativo, era mais abundante na hifa. Com exceção da PhiA, integrante da parede celular, as proteínas identificadas como diferencialmente expressas na superfície do A. fumigatus não possuem sinal para secreção identificável, enquadrando-se nas proteínas atípicas de superfície. Foi verificada a integridade da membrana celular após tratamento com DTT, bem como a marcação por biotina das proteínas extraídas, o que comprovou sua localização superficial na célula fúngica. Hipóteses de que estas proteínas sejam endereçadas à parede celular por via secretória alternativa sustentam estes dados. Estas evidências foram confirmadas pelo fato de não terem sido encontradas as mesmas proteínas da superfície na análise do secretoma do A. fumigatus. Além disso, todas as proteínas caracterizadas no secretoma apresentavam sinal de secreção determinado pelo FunSecKB (www.proteomics.ysu.edu/secretomes/fungi.php). A análise do secretoma foi realizada utilizando-se a cepa selvagem AF293 e a mutante ∆prtT, mutante para um fator de transcrição que atua na regulação da secreção de proteases. Os resultados revelam a ALP1 como expressa na cepa selvagem, assim como outras proteases importantes para virulência e desenvolvimento da célula fúngica, estando suprimidas quando o gene prtT foi deletado. / Aspergillus fumigatus is the main etiologic agent of invasive aspergillosis (IA), a opportunistic a life-threatening disease for immunocompromised hosts, especially those with acute and prolonged neutropenia. During the invasion and dissemination, which occurs in this systemic infection, the A. fumigatus conidia, after its inhalation, germinates into angioinvasive hyphae in case the innate immune response fails in eliminate these cells. Little is known about the cell wall molecules and/or the secreted proteins involved on the A. fumigatus pathogenesis, at this context the present work aims to amplify the knowledge about the aspergillosis by studying the differentially surface proteins of A. fumigatus during the filamentation process. These cells were denominated according to their morphology and their growth time as: TG6h (germ tubes), H12h and H72h (hyphae). The surface proteins were mildly extracted from intact cells using the reducing agent DTT (dithiothreitol). The functional profile of the H12h and H72h were similar except for the stress response proteins, while the TG6h presented significant differences for several functional groups. On this base, the DIGE (differential gel electrophoresis) was performed using the surface extracted proteins of the germ tubes (TG6h) and mature hyphae (H72h) cells. The results indicate that multiple functional proteins and proteins related to the biosynthesis pathways were overexpressed at TG6h. Some stress response proteins as the HSPs were overexpressed on this morphotype while the MnSOD, oxidative stress responsive protein, was most abundant at the hyphae. PhiA, an integrant protein of the cell wall, was the only protein with a secretion signal sequence. All other proteins identified on the cell surface lack an identifiable secretion sign, and are denominated atypical proteins. The plasma membrane integrity was verified after the mild extraction using DTT, and also the biotinylation of the cell extracted proteins, which ensured these proteins surface localization on the fungal cell. There are hypothesis that some proteins can be transport to the cell wall by alternative pathways and support the results found for this work. These evidences were confirmed by the fact that the proteins identified at the surface were not the same identified on the A. fumigatus secretome. Besides, all proteins identified on the secretome presented secretion signal determinate by the FunSecKB (www.proteomics.ysu.edu/secretomes/fungi.php). The secretome analysis was performed using the wild type AF293 and the ∆prtT mutant, lacking a transcription factor that regulates proteases secretion. The results demonstrate ALP1 overexpressed on the wild type and also other proteases important to virulence and development of the fungal cell suppressed when prtT was deleted.

Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / Aspergillus fumigatus é o principal agente etiológico da aspergilose invasiva, infecção fúngica oportunista com altas taxas de mortalidade afetando, principalmente, pacientes com neutropenia profunda e prolongada. Durante o processo de invasão e disseminação características desta infecção sistêmica, os conídios do fungo inalados e não eliminados pelas células do sistema imune inato diferenciam-se em hifas que, por sua vez, são angioinvasivas. Pouco se conhece sobre as moléculas da parede celular envolvidas na patogênese do A. fumigatus e/ou secretadas por este patógeno. Neste contexto, este trabalho procura ampliar o entendimento desta doença através do estudo de proteínas diferencialmente expressas na superfície de A. fumigatus durante a morfogênese. Foi utilizada uma abordagem proteômica e foram estudados extratos de superfície de células de A. fumigatus em diferentes estágios durante o processo de filamentação. Estas células foram denominadas, de acordo com o tempo de cultivo e a morfologia, como: TG6h (tubo germinativo), H12h ou H72h (hifas). As proteínas de superfície celular foram extraídas, a partir de células intactas, por tratamento brando com o agente redutor DTT (ditiotreitol). Observou-se que o perfil funcional das proteínas expressas por H12h e H72h foi similar, com exceção de proteínas relacionadas à resposta ao estresse, enquanto o perfil para TG6h apresentou diferenças significativas para vários grupos funcionais de proteínas quando comparado às hifas. Desta forma, foram realizados experimentos de proteômica diferencial entre tubo germinativo (TG6h) e a hifa madura (H72h), pela técnica de DIGE (differential gel electrophoresis). Os resultados revelaram que entre as proteínas diferencialmente expressas, aquelas relacionadas às vias de biossíntese e outras denominadas multifuncionais encontraram-se superexpressas em TG6h. Em relação às proteínas de resposta a estresse, observou-se que algumas HSPs eram mais expressas neste morfotipo, enquanto a MnSOD, relativa à resposta ao estresse oxidativo, era mais abundante na hifa. Com exceção da PhiA, integrante da parede celular, as proteínas identificadas como diferencialmente expressas na superfície do A. fumigatus não possuem sinal para secreção identificável, enquadrando-se nas proteínas atípicas de superfície. Foi verificada a integridade da membrana celular após tratamento com DTT, bem como a marcação por biotina das proteínas extraídas, o que comprovou sua localização superficial na célula fúngica. Hipóteses de que estas proteínas sejam endereçadas à parede celular por via secretória alternativa sustentam estes dados. Estas evidências foram confirmadas pelo fato de não terem sido encontradas as mesmas proteínas da superfície na análise do secretoma do A. fumigatus. Além disso, todas as proteínas caracterizadas no secretoma apresentavam sinal de secreção determinado pelo FunSecKB (www.proteomics.ysu.edu/secretomes/fungi.php). A análise do secretoma foi realizada utilizando-se a cepa selvagem AF293 e a mutante ∆prtT, mutante para um fator de transcrição que atua na regulação da secreção de proteases. Os resultados revelam a ALP1 como expressa na cepa selvagem, assim como outras proteases importantes para virulência e desenvolvimento da célula fúngica, estando suprimidas quando o gene prtT foi deletado. / Aspergillus fumigatus is the main etiologic agent of invasive aspergillosis (IA), a opportunistic a life-threatening disease for immunocompromised hosts, especially those with acute and prolonged neutropenia. During the invasion and dissemination, which occurs in this systemic infection, the A. fumigatus conidia, after its inhalation, germinates into angioinvasive hyphae in case the innate immune response fails in eliminate these cells. Little is known about the cell wall molecules and/or the secreted proteins involved on the A. fumigatus pathogenesis, at this context the present work aims to amplify the knowledge about the aspergillosis by studying the differentially surface proteins of A. fumigatus during the filamentation process. These cells were denominated according to their morphology and their growth time as: TG6h (germ tubes), H12h and H72h (hyphae). The surface proteins were mildly extracted from intact cells using the reducing agent DTT (dithiothreitol). The functional profile of the H12h and H72h were similar except for the stress response proteins, while the TG6h presented significant differences for several functional groups. On this base, the DIGE (differential gel electrophoresis) was performed using the surface extracted proteins of the germ tubes (TG6h) and mature hyphae (H72h) cells. The results indicate that multiple functional proteins and proteins related to the biosynthesis pathways were overexpressed at TG6h. Some stress response proteins as the HSPs were overexpressed on this morphotype while the MnSOD, oxidative stress responsive protein, was most abundant at the hyphae. PhiA, an integrant protein of the cell wall, was the only protein with a secretion signal sequence. All other proteins identified on the cell surface lack an identifiable secretion sign, and are denominated atypical proteins. The plasma membrane integrity was verified after the mild extraction using DTT, and also the biotinylation of the cell extracted proteins, which ensured these proteins surface localization on the fungal cell. There are hypothesis that some proteins can be transport to the cell wall by alternative pathways and support the results found for this work. These evidences were confirmed by the fact that the proteins identified at the surface were not the same identified on the A. fumigatus secretome. Besides, all proteins identified on the secretome presented secretion signal determinate by the FunSecKB (www.proteomics.ysu.edu/secretomes/fungi.php). The secretome analysis was performed using the wild type AF293 and the ∆prtT mutant, lacking a transcription factor that regulates proteases secretion. The results demonstrate ALP1 overexpressed on the wild type and also other proteases important to virulence and development of the fungal cell suppressed when prtT was deleted.

Submitted by Luciana Ferreira (lucgeral@gmail.com) on 2016-04-20T12:49:28Z No. of bitstreams: 2 Dissertação - Alex Jesus de Carvalho - 2014.pdf: 1685689 bytes, checksum: 5b4f38809e4a3fe6252bba20b25d949b (MD5) license_rdf: 23148 bytes, checksum: 9da0b6dfac957114c6a7714714b86306 (MD5) / Approved for entry into archive by Luciana Ferreira (lucgeral@gmail.com) on 2016-04-20T12:58:32Z (GMT) No. of bitstreams: 2 Dissertação - Alex Jesus de Carvalho - 2014.pdf: 1685689 bytes, checksum: 5b4f38809e4a3fe6252bba20b25d949b (MD5) license_rdf: 23148 bytes, checksum: 9da0b6dfac957114c6a7714714b86306 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-04-20T12:58:33Z (GMT). No. of bitstreams: 2 Dissertação - Alex Jesus de Carvalho - 2014.pdf: 1685689 bytes, checksum: 5b4f38809e4a3fe6252bba20b25d949b (MD5) license_rdf: 23148 bytes, checksum: 9da0b6dfac957114c6a7714714b86306 (MD5) Previous issue date: 2014-06-09 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES / The Gram-positive bacterium Staphylococcus saprophyticus, one of the coagulasenegative staphylococci, is the second most common causative agent of urinary tract infection, affecting mainly sexually active women. Staphylococcus saprophyticus can cause acute diseases as pyelonephritis, sepsis, nephrolithiasis, endocarditis, urethritis, epididymitis and prostatitis. This work aims to identify Staphylococcus saprophyticus surface proteins by using a proteolytic shaving approach, a methodology that was established to identify surface-exposed protein domains by tripsinization of intact cells. The peptides obtained were treated by trypsin, reduced, alkylated and identified by nano-chromatography using a nanoACQUITY UPLCTM system (Waters) coupled to a SYNAPT Q-TOF mass spectrometer (Waters). The homology analysis was performed using the software ProteinLynx 2.3 (Waters). Through the shaving, it was possible to identify 219 proteins, many of them, described as virulence factors. Of total, 01 is cell wall protein, 09 are extracelular proteins, 19 are membrane proteins and 190 are citoplasmatic proteins. Besides of the lysis process, the presence of cytoplasmic proteins on cell surface can be due to the activity of export pathways not yet identified and many of these proteins can be proteins with moonlighting function, in other words, proteins that plays more of one function, it can, in this case, plays functions on S. saprophyticus cell surface related to bacterial virulence. The main proteins with moonlighting function include metabolic enzymes of the glycolytic pathway; enzymes of other metabolic pathways, such as, glyoxalate cycle; chaperones and proteins related with the proteic folding. The prediction of cellular localization was performed through LocateP database. The results of this research help to elucidate the strategies and machineries used by proteins during the adhesion, infection and proliferation, leading us to understand the interaction between the pathogenic bacteria S. saprophyticus and the human host. The knowledge about the proteins present on the cell surface is of extreme importance, because many of these proteins represent targets to new drugs, therapeutic antibodies or vaccines, since the pathogen cell surface is the first to contact with the host cells during the infection process. / A bactéria Gram-positiva Staphylococcus saprophyticus, uma das bactérias estafilococos coagulase negativa, é o segundo agente mais comum causador de infecções do trato urinário, afetando principalmente mulheres sexualmente ativas. S. saprophyticus pode causar doenças agudas como pielonefrite, sepse, nefrolitíase, endocardite, uretrite, epididimite e prostatite. Este trabalho teve como objetivo identificar proteínas de superfície de S. saprophyticus pela abordagem de shaving proteolítico, uma metodologia que foi estabelecida para identificar proteínas que possuem domínios proteicos na superfície celular utilizando a tripsinização de células intactas. Posteriormente, os peptídeos obtidos foram tripsinizados, reduzidos, alquilados e identificados através de nano-cromatografia utilizando um sistema nanoACQUITY UPLCTM (Waters) acoplado a um espectrômetro de massas SYNAPT Q-TOF (Waters). Com isso foi possível identificar 219 proteínas, muitas delas descritas como fatores de virulência. Do total, 01 proteína é de parede celular, 09 extracelulares, 19 de membrana e 190 citoplasmáticas. Além do processo de lise, a presença de proteínas citoplasmáticas na superfície celular pode ser devida à atividade de vias de exportação ainda não identificadas e muitas dessas proteínas podem ser proteínas com função moonlighting, ou seja, proteínas que desempenham mais de uma função, podendo, neste caso, desempenhar funções na superfície de S. saprophyticus relacionadas à virulência bacteriana. As principais proteínas com função moonlighting incluem enzimas metabólicas da via glicolítica; enzimas de outras vias metabólicas, tais como, ciclo do glioxalato; chaperonas e proteínas relacionadas com o dobramento proteico. A predição de localização celular foi realizada com o banco de dados LocateP. Os resultados desta pesquisa contribuíram na elucidação das estratégias e maquinarias utilizadas pelas proteínas durante a adesão, infecção e proliferação, levando-nos a compreender a interação entre a bactéria patogênica S. saprophyticus e o hospedeiro humano. O conhecimento acerca das proteínas presentes na superfície celular é de extrema importância, visto que muitas dessas proteínas representam alvos para novas drogas, anticorpos terapêuticos ou vacinas, uma vez que a superfície celular do patógeno é a primeira a entrar em contato com as células do hospedeiro durante o processo de infecção.

Sistemas do tipo cell surface display vêm sendo desenvolvidos para expressão de proteínas heterólogas ancoradas à superfície celular de microrganismos. Várias aplicações foram reportadas destes sistemas, incluindo o emprego como biocatalizador celular, desenvolvimento de vacinas e biosorventes celulares. Neste trabalho foi desenvolvido um sistema que permite ancoragem da proteína glicoamilase de Aspergillus awamori à superfície da parede celular da levedura Saccharomyces cerevisiae. O gene codificador da glicoamilase com sua seqüência sinal foi fusionado ao fragmento do gene codificador da região C-terminal da proteína Flo1p (Flo428), que foi utilizada como âncora (fragmento CG*FC). As células de levedura foram transformadas com o fragmento híbrido CG*FC e os transformantes foram capazes de degradar amido e liberar glicose. A atividade da glicoamilase não foi detectada no meio de cultura, porém está presente no sedimento celular. Estes resultados demonstram que a glicoamilase foi ancorada à parede celular da nova linhagem recombinante de levedura. / Cell surface display systems have being developed for expression of heterologous proteins anchored to the cell surface of microorganisms. Several applications of these systems have been reported, including employment as whole-cell biocatalysts, development of vaccines and cellular biosorvents. In this work it was developed a system that allows the anchoring of the Aspergillus awamori glucoamylase protein to the cell wall surface of the yeast Saccharomyces cerevisiae. The gene encoding glucoamylase with its secretion signal was fused to the gene fragment encoding the C-terminal region of Flo1 protein, used as an anchor (CG*FC fragment). Yeast cells were transformed with hybrid CG*FC fragment and transformants were able to degrade starch and release glucose. Glucoamylase activity was not detected in the culture medium, but only in sedimented cells. These results demonstrate that glucoamylase was anchored to the cell wall of the new yeast recombinant strain.

Sistemas do tipo cell surface display vêm sendo desenvolvidos para expressão de proteínas heterólogas ancoradas à superfície celular de microrganismos. Várias aplicações foram reportadas destes sistemas, incluindo o emprego como biocatalizador celular, desenvolvimento de vacinas e biosorventes celulares. Neste trabalho foi desenvolvido um sistema que permite ancoragem da proteína glicoamilase de Aspergillus awamori à superfície da parede celular da levedura Saccharomyces cerevisiae. O gene codificador da glicoamilase com sua seqüência sinal foi fusionado ao fragmento do gene codificador da região C-terminal da proteína Flo1p (Flo428), que foi utilizada como âncora (fragmento CG*FC). As células de levedura foram transformadas com o fragmento híbrido CG*FC e os transformantes foram capazes de degradar amido e liberar glicose. A atividade da glicoamilase não foi detectada no meio de cultura, porém está presente no sedimento celular. Estes resultados demonstram que a glicoamilase foi ancorada à parede celular da nova linhagem recombinante de levedura. / Cell surface display systems have being developed for expression of heterologous proteins anchored to the cell surface of microorganisms. Several applications of these systems have been reported, including employment as whole-cell biocatalysts, development of vaccines and cellular biosorvents. In this work it was developed a system that allows the anchoring of the Aspergillus awamori glucoamylase protein to the cell wall surface of the yeast Saccharomyces cerevisiae. The gene encoding glucoamylase with its secretion signal was fused to the gene fragment encoding the C-terminal region of Flo1 protein, used as an anchor (CG*FC fragment). Yeast cells were transformed with hybrid CG*FC fragment and transformants were able to degrade starch and release glucose. Glucoamylase activity was not detected in the culture medium, but only in sedimented cells. These results demonstrate that glucoamylase was anchored to the cell wall of the new yeast recombinant strain.

Made available in DSpace on 2016-06-21T13:43:14Z (GMT). No. of bitstreams: 2 830.pdf: 984013 bytes, checksum: 404aa18d3e40dad94e177518d24b5c02 (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2009 / Made available in DSpace on 2016-07-05T22:16:49Z (GMT). No. of bitstreams: 3 830.pdf.txt: 186951 bytes, checksum: c158594d1dae991c3436229e07b6cb30 (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) 830.pdf: 984013 bytes, checksum: 404aa18d3e40dad94e177518d24b5c02 (MD5) Previous issue date: 2009 / Fundação Oswaldo Cruz. Centro de Pesquisas Aggeu Magalhães. Recife, PE, Brasil / O principal fator larvicida do Bacillus sphaericus (Bsp) para culicídeos é a protoxina Bin, produzida sob a forma de um cristal, durante a esporulação. Quando ingerido pelas larvas o cristal é processado e a toxina Bin reconhece e liga-se a receptores específicos do epitélio intestinal. O receptor em Culex quinquefasciatus é uma alfa-glicosidase de 60 kDa, ligada à membrana intestinal por uma âncora GPI, denominado Cqm1. Larvas de Aedes aegypti são consideradas refratárias ao Bsp, pois a toxina Bin não reconhece receptores no microvilli intestinal. No entanto, a análise do genoma do Ae. aegypti, revelou a presença do gene aam1, que codificaria uma proteína ortóloga e com 83 por cento de similaridade ao receptor Cqm1. O principal objetivo deste estudo foi elucidar a base molecular da refratariedade do Ae. aegypti ao Bsp, determinada pela ausência de ligação da toxina Bin ao epitélio intestinal das larvas. Para tal, foi feita uma investigação da expressão da proteína Aam1 e do perfil de alfa-glicosidases de Ae. aegypti, tendo como referência o receptor Cqm1. Os resultados mostraram que larvas e adultos de Ae. aegypti expressam uma ?-glicosidase de membrana de 70 kDa, reconhecida pelo anticorpo anti-Cqm1, e que provavelmente trata-se da proteína Aam1. Tal proteína é expressa no microvilli intestinal das larvas em níveis superiores à Cqm1, no entanto, não apresenta capacidade de ligação à toxina Bin. Em uma segunda etapa, a avaliação de proteínas Aam1 e Cqm1 recombinantes, produzidas em lisado de reticulócitos de coelho, mostrou que ambas não foram capazes de se ligar específicamente à toxina Bin. A falha na ligação da proteína Cqm1 à toxina Bin pode ser decorrente da ausência do processamento pós-traducional adequado neste sistema de expressão, indicando que certas modificações podem ser críticas para a sua funcionalidade. O tratamento da proteína Cqm1 nativa à temperatura de 100 °C aboliu a sua capacidade de ligação à toxina Bin, indicando que a conformação da proteína pode ser essencial para a sua funcionalidade. Os resultados obtidos demonstram que, apesar dos altos níveis de expressão da Aam1 nas larvas de Ae. aegypti, a proteína não é capaz de ligar-se à toxina Bin. Tal fato estar relacionado a outros fatores críticos para sua funcionalidade, tais como diferenças conformacionais e/ou modificações pós-traducionais que determinem o status de refratariedade do Ae. aegypti