Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / Aspergillus fumigatus é o principal agente etiológico da aspergilose invasiva, infecção fúngica oportunista com altas taxas de mortalidade afetando, principalmente, pacientes com neutropenia profunda e prolongada. Durante o processo de invasão e disseminação características desta infecção sistêmica, os conídios do fungo inalados e não eliminados pelas células do sistema imune inato diferenciam-se em hifas que, por sua vez, são angioinvasivas. Pouco se conhece sobre as moléculas da parede celular envolvidas na patogênese do A. fumigatus e/ou secretadas por este patógeno. Neste contexto, este trabalho procura ampliar o entendimento desta doença através do estudo de proteínas diferencialmente expressas na superfície de A. fumigatus durante a morfogênese. Foi utilizada uma abordagem proteômica e foram estudados extratos de superfície de células de A. fumigatus em diferentes estágios durante o processo de filamentação. Estas células foram denominadas, de acordo com o tempo de cultivo e a morfologia, como: TG6h (tubo germinativo), H12h ou H72h (hifas). As proteínas de superfície celular foram extraídas, a partir de células intactas, por tratamento brando com o agente redutor DTT (ditiotreitol). Observou-se que o perfil funcional das proteínas expressas por H12h e H72h foi similar, com exceção de proteínas relacionadas à resposta ao estresse, enquanto o perfil para TG6h apresentou diferenças significativas para vários grupos funcionais de proteínas quando comparado às hifas. Desta forma, foram realizados experimentos de proteômica diferencial entre tubo germinativo (TG6h) e a hifa madura (H72h), pela técnica de DIGE (differential gel electrophoresis). Os resultados revelaram que entre as proteínas diferencialmente expressas, aquelas relacionadas às vias de biossíntese e outras denominadas multifuncionais encontraram-se superexpressas em TG6h. Em relação às proteínas de resposta a estresse, observou-se que algumas HSPs eram mais expressas neste morfotipo, enquanto a MnSOD, relativa à resposta ao estresse oxidativo, era mais abundante na hifa. Com exceção da PhiA, integrante da parede celular, as proteínas identificadas como diferencialmente expressas na superfície do A. fumigatus não possuem sinal para secreção identificável, enquadrando-se nas proteínas atípicas de superfície. Foi verificada a integridade da membrana celular após tratamento com DTT, bem como a marcação por biotina das proteínas extraídas, o que comprovou sua localização superficial na célula fúngica. Hipóteses de que estas proteínas sejam endereçadas à parede celular por via secretória alternativa sustentam estes dados. Estas evidências foram confirmadas pelo fato de não terem sido encontradas as mesmas proteínas da superfície na análise do secretoma do A. fumigatus. Além disso, todas as proteínas caracterizadas no secretoma apresentavam sinal de secreção determinado pelo FunSecKB (www.proteomics.ysu.edu/secretomes/fungi.php). A análise do secretoma foi realizada utilizando-se a cepa selvagem AF293 e a mutante ∆prtT, mutante para um fator de transcrição que atua na regulação da secreção de proteases. Os resultados revelam a ALP1 como expressa na cepa selvagem, assim como outras proteases importantes para virulência e desenvolvimento da célula fúngica, estando suprimidas quando o gene prtT foi deletado. / Aspergillus fumigatus is the main etiologic agent of invasive aspergillosis (IA), a opportunistic a life-threatening disease for immunocompromised hosts, especially those with acute and prolonged neutropenia. During the invasion and dissemination, which occurs in this systemic infection, the A. fumigatus conidia, after its inhalation, germinates into angioinvasive hyphae in case the innate immune response fails in eliminate these cells. Little is known about the cell wall molecules and/or the secreted proteins involved on the A. fumigatus pathogenesis, at this context the present work aims to amplify the knowledge about the aspergillosis by studying the differentially surface proteins of A. fumigatus during the filamentation process. These cells were denominated according to their morphology and their growth time as: TG6h (germ tubes), H12h and H72h (hyphae). The surface proteins were mildly extracted from intact cells using the reducing agent DTT (dithiothreitol). The functional profile of the H12h and H72h were similar except for the stress response proteins, while the TG6h presented significant differences for several functional groups. On this base, the DIGE (differential gel electrophoresis) was performed using the surface extracted proteins of the germ tubes (TG6h) and mature hyphae (H72h) cells. The results indicate that multiple functional proteins and proteins related to the biosynthesis pathways were overexpressed at TG6h. Some stress response proteins as the HSPs were overexpressed on this morphotype while the MnSOD, oxidative stress responsive protein, was most abundant at the hyphae. PhiA, an integrant protein of the cell wall, was the only protein with a secretion signal sequence. All other proteins identified on the cell surface lack an identifiable secretion sign, and are denominated atypical proteins. The plasma membrane integrity was verified after the mild extraction using DTT, and also the biotinylation of the cell extracted proteins, which ensured these proteins surface localization on the fungal cell. There are hypothesis that some proteins can be transport to the cell wall by alternative pathways and support the results found for this work. These evidences were confirmed by the fact that the proteins identified at the surface were not the same identified on the A. fumigatus secretome. Besides, all proteins identified on the secretome presented secretion signal determinate by the FunSecKB (www.proteomics.ysu.edu/secretomes/fungi.php). The secretome analysis was performed using the wild type AF293 and the ∆prtT mutant, lacking a transcription factor that regulates proteases secretion. The results demonstrate ALP1 overexpressed on the wild type and also other proteases important to virulence and development of the fungal cell suppressed when prtT was deleted.

Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / Aspergillus fumigatus é o principal agente etiológico da aspergilose invasiva, infecção fúngica oportunista com altas taxas de mortalidade afetando, principalmente, pacientes com neutropenia profunda e prolongada. Durante o processo de invasão e disseminação características desta infecção sistêmica, os conídios do fungo inalados e não eliminados pelas células do sistema imune inato diferenciam-se em hifas que, por sua vez, são angioinvasivas. Pouco se conhece sobre as moléculas da parede celular envolvidas na patogênese do A. fumigatus e/ou secretadas por este patógeno. Neste contexto, este trabalho procura ampliar o entendimento desta doença através do estudo de proteínas diferencialmente expressas na superfície de A. fumigatus durante a morfogênese. Foi utilizada uma abordagem proteômica e foram estudados extratos de superfície de células de A. fumigatus em diferentes estágios durante o processo de filamentação. Estas células foram denominadas, de acordo com o tempo de cultivo e a morfologia, como: TG6h (tubo germinativo), H12h ou H72h (hifas). As proteínas de superfície celular foram extraídas, a partir de células intactas, por tratamento brando com o agente redutor DTT (ditiotreitol). Observou-se que o perfil funcional das proteínas expressas por H12h e H72h foi similar, com exceção de proteínas relacionadas à resposta ao estresse, enquanto o perfil para TG6h apresentou diferenças significativas para vários grupos funcionais de proteínas quando comparado às hifas. Desta forma, foram realizados experimentos de proteômica diferencial entre tubo germinativo (TG6h) e a hifa madura (H72h), pela técnica de DIGE (differential gel electrophoresis). Os resultados revelaram que entre as proteínas diferencialmente expressas, aquelas relacionadas às vias de biossíntese e outras denominadas multifuncionais encontraram-se superexpressas em TG6h. Em relação às proteínas de resposta a estresse, observou-se que algumas HSPs eram mais expressas neste morfotipo, enquanto a MnSOD, relativa à resposta ao estresse oxidativo, era mais abundante na hifa. Com exceção da PhiA, integrante da parede celular, as proteínas identificadas como diferencialmente expressas na superfície do A. fumigatus não possuem sinal para secreção identificável, enquadrando-se nas proteínas atípicas de superfície. Foi verificada a integridade da membrana celular após tratamento com DTT, bem como a marcação por biotina das proteínas extraídas, o que comprovou sua localização superficial na célula fúngica. Hipóteses de que estas proteínas sejam endereçadas à parede celular por via secretória alternativa sustentam estes dados. Estas evidências foram confirmadas pelo fato de não terem sido encontradas as mesmas proteínas da superfície na análise do secretoma do A. fumigatus. Além disso, todas as proteínas caracterizadas no secretoma apresentavam sinal de secreção determinado pelo FunSecKB (www.proteomics.ysu.edu/secretomes/fungi.php). A análise do secretoma foi realizada utilizando-se a cepa selvagem AF293 e a mutante ∆prtT, mutante para um fator de transcrição que atua na regulação da secreção de proteases. Os resultados revelam a ALP1 como expressa na cepa selvagem, assim como outras proteases importantes para virulência e desenvolvimento da célula fúngica, estando suprimidas quando o gene prtT foi deletado. / Aspergillus fumigatus is the main etiologic agent of invasive aspergillosis (IA), a opportunistic a life-threatening disease for immunocompromised hosts, especially those with acute and prolonged neutropenia. During the invasion and dissemination, which occurs in this systemic infection, the A. fumigatus conidia, after its inhalation, germinates into angioinvasive hyphae in case the innate immune response fails in eliminate these cells. Little is known about the cell wall molecules and/or the secreted proteins involved on the A. fumigatus pathogenesis, at this context the present work aims to amplify the knowledge about the aspergillosis by studying the differentially surface proteins of A. fumigatus during the filamentation process. These cells were denominated according to their morphology and their growth time as: TG6h (germ tubes), H12h and H72h (hyphae). The surface proteins were mildly extracted from intact cells using the reducing agent DTT (dithiothreitol). The functional profile of the H12h and H72h were similar except for the stress response proteins, while the TG6h presented significant differences for several functional groups. On this base, the DIGE (differential gel electrophoresis) was performed using the surface extracted proteins of the germ tubes (TG6h) and mature hyphae (H72h) cells. The results indicate that multiple functional proteins and proteins related to the biosynthesis pathways were overexpressed at TG6h. Some stress response proteins as the HSPs were overexpressed on this morphotype while the MnSOD, oxidative stress responsive protein, was most abundant at the hyphae. PhiA, an integrant protein of the cell wall, was the only protein with a secretion signal sequence. All other proteins identified on the cell surface lack an identifiable secretion sign, and are denominated atypical proteins. The plasma membrane integrity was verified after the mild extraction using DTT, and also the biotinylation of the cell extracted proteins, which ensured these proteins surface localization on the fungal cell. There are hypothesis that some proteins can be transport to the cell wall by alternative pathways and support the results found for this work. These evidences were confirmed by the fact that the proteins identified at the surface were not the same identified on the A. fumigatus secretome. Besides, all proteins identified on the secretome presented secretion signal determinate by the FunSecKB (www.proteomics.ysu.edu/secretomes/fungi.php). The secretome analysis was performed using the wild type AF293 and the ∆prtT mutant, lacking a transcription factor that regulates proteases secretion. The results demonstrate ALP1 overexpressed on the wild type and also other proteases important to virulence and development of the fungal cell suppressed when prtT was deleted.