Issue de la troncature de la dextrane-saccharase DSR-E, l’alpha-(1→2) transglucosidase recombinante GBD-CD2 catalyse à partir de saccharose le branchement de molécules acceptrices tels que les dextranes, les isomalto-oligosaccharides ou les gluco-oligosaccharides (GOS ; [6)-alpha-D-Glcp-(1→]n-alpha-D-Glcp-(1→4)-D-Glcp, avec 1<n<9). L’objet de cette étude a porté sur la compréhension des relations structure-activité de GBD-CD2 afin d’investiguer les facteurs structuraux responsables de la synthèse des liaisons osidiques de type alpha-(1→2). La troncature rationnelle du domaine de liaison au glucane (GBD) de l’enzyme GBD-CD2 (192 kDa) a abouti à l’isolement de trois formes tronquées actives, de masses moléculaires égales à 180, 147 et 123 kDa. Après purification de GBD-CD2 et de delta N123-GBD-CD2 (123 kDa), des études cinétiques ont permis de mettre en évidence que les enzymes présentent la même régiospécificité. L’activité d’hydrolyse du saccharose peut être modélisée par le modèle de Michaelis – Menten (kcat respectifs de 109 et 76 s-1). En présence de dextrane accepteur, ces enzymes sont activées. L’activité d’alpha-(1→2) glucosylation suit un modèle Ping Pong Bi Bi (kcat respectifs de 970 et 947 s-1). En modulant le ratio molaire entre le donneur d’unités glucosyle et l’accepteur de ces unités ([saccharose]/[dextrane]), il est possible de synthétiser des dextranes dont le pourcentage de liaisons alpha-(1→2) est contrôlé et varie de 10% à 40%. La caractérisation des produits de la réaction menée en présence de saccharose et de GOS a permis d’isoler et de caractériser pour la première fois des GOS arborant des unités glucosyle branchées en alpha-(1→2) sur les unités glucosyle adjacentes de la chaîne principale. Enfin, la résolution de la structure de delta N123-GBD-CD2 à 3,2 Å révèle que cette enzyme adopte le repliement original « en U » similaire à celui décrit pour GTF180-delta N. La comparaison des gorges catalytiques des deux dextrane-saccharases cristallisées apporte des éléments pouvant expliquer la régiospécificité singulière de delta N123-GBD-CD2, et ouvre la voie à des travaux de mutagenèse visant à investiguer le rôle de résidus potentiellement clés / GBD-CD2 is a recombinant alpha-(1→2) transglucosidase constructed by truncation of the DSR-E dextransucrase from Leuconostoc mesenteroides NRRL B-1299. From sucrose, GBD-CD2 catalyses the alpha-(1→2) branching reaction onto acceptor molecules such as dextrans, isomalto-oligosaccharides or gluco-oligosaccharides (GOS; [6)-alpha-D-Glcp-(1→]n-alpha-D-Glcp-(1→4)-D-Glcp, 1<n<9). This work has been focused on structure activity relationship studies. Rational truncations of the glucan binding domain (GBD) led to the expression in E. coli of three active enzymes, showing molecular masses of 180, 147 and 123 kDa. After purification of the recombinant GBD-CD2 and delta N123-GBD-CD2, we showed that both enzymes display the same regiospecificity. Steady-state kinetics revealed that the activity of sucrose hydrolysis displays a Michaelis Menten type of kinetics (kcat 109 s-1 and 76 s-1, respectively). In the presence of dextran acceptor, these enzymes are activated. The alpha-(1→2) transglucosidase activity from sucrose onto dextrans was modelled by a Ping Pong Bi Bi mechanism (kcat 970 s-1 and 947 s-1, respectively). When varying the molar ratio between the glucosyl donor and the acceptor ([sucrose]/[dextran]), the percentage of alpha-(1→2) linkages in dextrans can be controlled from 10% to 40%. Additionally, from reactions in the presence of GOS and sucrose, we isolated and characterized new alpha-(1→2) branched GOS with contiguous alpha-(1→2) branchings along linear GOS chains. Finally, the X-ray structure of delta N123-GBD-CD2 at 3.2 Å resolution revealed that this enzyme has a very original “U folding” similar to that described for GTF180-delta N. Study of the residues lining the catalytic gorges of the two crystallized enzymes revealed the structural determinants possibly involved in the singular regiospecificity of delta N123-GBD-CD2. Our work opens the way to mutagenesis work for discovering key structural determinants of delta N123-GBD-CD2

Les glucane-saccharases (GS) de la famille GH70 sont des enzymes produites par certaines bactéries lactiques. A partir de saccharose, substrat renouvelable et peu coûteux, elles sont capables de catalyser la synthèse d’α-glucanes, homopolysaccharides dont les propriétés diffèrent suivant la spécificité de l’enzyme (taille, type de liaisons α-osidiques, degrés de branchement). Les glucanes contenant une très grande majorité de liaisons α-(1,6), appelés dextranes, présentent de nombreuses applications industrielles qui dépendent principalement de leur taille. Cependant, la synthèse directe de dextranes de taille contrôlée (de 1 à plusieurs millions de kg/mol) avec une faible polydispersité et en utilisant une seule enzyme n’est encore pas envisageable. En effet, les mécanismes moléculaires mis en jeu pour le contrôle de la taille des polymères produits n’ont encore été que peu explorés. Dans ce contexte, deux GSs ont été sélectionnées. La première, DSR-M synthétise uniquement des dextranes de faible masse molaire (MM) (28 kg/mol) exclusivement composés de liaisons α-(1,6). A contrario, le second modèle, DSR-OK produit le plus long dextrane décrit à ce jour (>109 g/mol). La caractérisation biochimique et structurale ainsi que la construction de mutants ont permis l’exploration du mode d’action de ces deux candidats. Plusieurs structures 3D de DSR-M2 (forme tronquée de DSR-M) - sans ou en complexe avec son substrat ou ses produits (isomaltotetraose) - ont été résolues. C’est la première fois que de tels complexes sont décrits et l’une de ces structures présente le domaine V le plus complet décrit à ce jour. L’analyse de ces structures couplée au suivi cinétique de la synthèse du polymère ont montré que la spécificité de DSR-M pour la synthèse de dextranes courts s’explique par un mode d’élongation distributif dû à la faible affinité de deux poches à sucre de son domaine V envers la chaîne en cours de synthèse. Des analyses RMN (15N1H – HSQC) – jamais réalisées auparavant sur une protéine si grosse – ont également étayé l’importance de la présence de résidus aromatiques dans le domaine catalytique pour la synthèse de dextranes supérieurs à 2 kg/mol. En comparaison, la synthèse de dextranes de haute MM par DSR-OK est principalement due au plus grand nombre de poches à sucre de son domaine V, permettant d’assurer une meilleure interaction avec la chaîne en cours d’élongation. L’implication de ces poches dans la détermination de la taille du dextrane a été montrée pour les deux candidats. Leur fonctionnalité est fortement liée à la présence d’un résidu aromatique de stacking, et leur répartition le long du domaine V a aussi une influence. L’ensemble de ces résultats démontre la coopération du domaine V avec le domaine catalytique pour l’élongation des dextranes, tout en offrant de nouvelles perspectives pour approfondir la compréhension de ce mécanisme. Ils offrent également des stratégies prometteuses pour l’ingénierie d’enzyme de la famille des GH70 pour la modulation de la taille des glucanes. / Glucansucrases (GS) from glycoside hydrolase family 70 (GH70) are -transglucosylases produced by lactic acid bacteria. From sucrose, an economical and abundant agro resource, they catalyze the polymerization of glucosyl residues. Depending on the enzyme specificity, α-glucans vary in terms of size, types of glucosidic bonds and degree of branching and have found multiple industrial applications mainly related to their molar mass (MM). However synthesizing polymers of controlled size with average MM ranging from 1 kg/mol to several millions g/mol and low polydispersity using one single enzyme remains challenging. Indeed, the molecular mechanisms underpinning the control of polymer size have been scarcely explored. To tackle this question, two GSs producing dextran (glucan composed of a majority of α-(1,6) linkages) were selected, and their mode of action explored via biochemical and structural analyses coupled to mutagenesis. The first enzyme selected, called DSR-M synthesizes only low molar mass (LMM) dextran (28 kg/mol) exclusively composed of -(1→6) linkages without any trace of HMM dextran (105 to 108 g/mol). In contrast, DSR-OK (second model), produces the highest MM dextran (>109 g/mol) described to date. Several 3D crystallographic structures of a truncated form of DSR-M (DSR-M2), either free or in complex with its substrate or product (isomaltotetraose) in the domain V or in the active site were solved. Such complexes were never obtained before. Noteworthy, one structure encompassed the most complete domain V reported to date. Analyses of these structures coupled to dextran synthesis monitoring, showed that the LMM dextran specificity of DSR-M2 is explained by a distributive elongation mode due to the weak affinity of its two sugar binding pockets in the domain V which interact with the growing dextran chains and allow the synthesis of dextran longer than 16 kg/mol. 15N1H NMR analyses (HSQC), for the first time performed with such a big protein, further revealed the crucial role of aromatic residues in the catalytic domain for the production of dextran from 2 to 16 kg/mol. In comparison, synthesis of HMM dextran by DSR-OK was shown to be mainly due to the sugar binding pockets of its domain V, ensuring much stronger interactions with growing dextran chains. The role of these pockets was evidenced for both enzymes, their functionality proposed to be linked to the presence of one aromatic stacking residue. Their positioning along domain V relatively to the active site is also important to promote efficient binding. All these findings highlight the cooperation between domain V and the catalytic domain for dextran elongation, offer new perspectives to acquire a deeper knowledge on this interplay and open promising strategies for GH70 enzyme engineering aiming at modulating glucan size.