L’infection congénitale à cytomégalovirus (CMV) représente l’infection congénitale la plus fréquente et est la cause principale de retard mental acquis et de déficience auditive neurosensorielle d’origine infectieuse chez le nouveau-né. Le risque de transmission au fœtus en cas de primo-infection maternelle est de 30 à 40%, et d’environ 1.4% chez les femmes séropositives pour le CMV avant la grossesse. L’analyse de la littérature montre que de nombreuses questions subsistent dans le domaine du CMV congénital. Le screening sérologique des femmes enceintes n’est pas systématique, entre autres à cause des difficultés fréquentes d’interprétation sérologique et des possibilités limitées de prévention et de traitement de l’infection fœtale. L’amélioration du diagnostic sérologique de l’infection à CMV est donc une étape importante dans la prise en charge des femmes enceintes. Dans la première partie de notre travail, nous avons montré les bonnes performances des tests automatisés LIAISON®CMV IgG II, LIAISON®CMV IgM II and LIAISON®CMV IgG Avidity II tant en prospectif sur des échantillons de routine que sur des sérums sélectionnés avec date de primo-infection connue. Ces nouveaux tests sont donc utiles pour le diagnostic de la primo-infection à CMV et la détermination du statut immunitaire, avec l’avantage d’une automatisation complète. Cependant, dans 18% des cas, la mesure de l’avidité des IgG se situe dans une zone intermédiaire ne permettant pas de dater l’infection. Dans la deuxième partie de ce travail, nous avons évalué les capacités des immunoblots Mikrogen recomLine CMV IgG and IgG Avidity à dater une infection primaire en utilisant des sérums pour lesquels la date de primo-infection à CMV est précisément connue, et montré que ces tests donnent une interprétation correcte dans 83.1%, un résultat incorrect dans 4.5% et un résultat non concluant dans 12.4% des cas. En particulier, la combinaison des tests Mikrogen montre une meilleure sensibilité à diagnostiquer une infection <14 semaines comparé au test VIDAS IgG Avidity (85.96% vs 76.92%). Sur un second panel d’échantillons avec une avidité des IgG VIDAS intermédiaire, ces nouveaux tests ont apporté une information complémentaire quant à la datation de la primo-infection dans 79% (70/89) des cas. L’impact clinique direct est prometteur :une analyse préliminaire sur 10 femmes enceintes de moins de 14 semaines d’âge gestationnel avec une sérologie difficile à interpréter, montre que ces tests ont permis d’éviter une amniocentèse chez 5 d’entre elles.Enfin, lorsqu’un diagnostic de primo-infection maternelle à CMV est posé ou suspecté chez une femme enceinte, nous manquons de marqueurs prédictifs de transmission materno-fœtale non invasifs pour la grossesse. Dans la troisième partie de notre travail, sur une cohorte de 150 femmes enceintes présentant une primo-infection, nous avons montré que la présence de CMV dans le sang et les urines maternelles est corrélée avec la transmission verticale et que la charge virale urinaire est plus élevée chez les femmes transmetteuses. Ces marqueurs virologiques peuvent être utiles dans l’évaluation du risque de transmission en cas de primo-infection maternelle mais nécessitent des études sur de plus larges cohortes afin de confirmer ces résultats et d’établir un seuil quantitatif. / Doctorat en Sciences biomédicales et pharmaceutiques (Médecine) / info:eu-repo/semantics/nonPublished

Les flavivirus ayant un impact en médecine vétérinaire sont largement distribués dans le monde (à l’exemple de la fièvre West Nile (WNF) présente sur les cinq continents ou de l’Encéphalite japonaise (EJ) en Asie du Sud-Est) et sont responsables de maladies à dominante neurologique chez l’homme et/ou le cheval.La virémie étant généralement brève lors de ces infections virales, les méthodes de diagnostic utilisées sont essentiellement sérologiques. Or le chevauchement fréquent des aires de répartition des flavivirus complique le diagnostic sérologique. En effet, des réactions sérologiques croisées entre flavivirus sont observées lors de l’utilisation de méthodes de diagnostic usuelles telles que l’ELISA et l’immunofluorescence (IF). Les résultats sérologiques doivent donc être confirmés par la méthode fastidieuse de séroneutralisation (SNT) virale avec les différents flavivirus existants dans la région. De plus, le risque d’émergence sur un territoire donné de nouveaux flavivirus comme le virus Zika au Brésil ou en Amérique du Nord ne peut être exclu.Nous avons donc développé dans la première partie de ce travail une nouvelle stratégie de diagnostic sérologique multiplexe à l’aide de la méthode d’immuno-essai (MIA) sur billes. Sachant que la glycoprotéine d’enveloppe soluble (sE) des flavivirus est divisée en 3 domaines (D) structuraux, DI, DII et DIII et que les épitopes du DIII sont spécifiques de chaque flavivirus, des protéines EDIII recombinantes de différents flavivirus d’intérêt ont été synthétisées en système d’expression Drosophila S2 et leur antigénicité a été testée sur sérums équins et ovins. Nous avons obtenu des résultats très encourageants en démontrant que l’utilisation des EDIII associée avec la capacité de multiplexage de la méthode MIA apparaît comme une réponse adaptée au défi du diagnostic sérologique des infections à flavivirus.Nous avons en outre utilisé la même méthode de multiplexage mais avec des antigènes NS1 du WNV pour mettre en place un test DIVA (Differentiating Infected from Vaccinated Animals) permettant de différencier les chevaux infectés par le WNV des chevaux vaccinés avec un vaccin recombinant WNV.Un autre écueil en médecine vétérinaire est le traitement des affections à flavivirus. En effet l’arsenal thérapeutique est limité et le traitement est avant tout symptomatique. Nous avons dans la seconde partie de ce travail testé in vitro une molécule antivirale à large spectre, le sr1057 sur nos virus d’intérêt (WNV et JEV). Cette molécule qui provient d’une stratégie de criblage développée par l’Institut Pasteur a probablement pour cible la cellule de l’hôte car elle est capable d’inhiber des virus très différents, à génome à ARN de polarité positive ou négative et ADN.Les résultats que nous avons obtenus avec ce composé sont en demi-teinte pour les flavivirus testés avec une efficacité démontrée pour le JEV mais plus modeste pour le WNV. Ils n’excluent cependant pas une possible utilisation de cet antiviral en médecine vétérinaire équine car une activité inhibitrice in vitro sur les virus de l’Herpes équin de type I et de l’artérite virale a été confirmée par d’autres collaborateurs. / Flaviviruses with a major impact in veterinary medicine are widely distributed (e.g. West Nile fever (WNF) has spread across the five continents and Japanese Encephalitis (JE) is reported in South-East Asia) and are mainly responsible for neurological diseases in humans and/or horses.After flavivirus infection, viremia in mammal hosts is generally short and consequently indirect methods are mostly used to diagnose flavivirus infections. However, frequent spatial overlapping in their circulation areas renders the interpretation of serological assays difficult. Indeed, cross-reactions between flaviviruses are observed in rapid serological tests such as in ELISA and immunofluorescence assays (IFA). Serological assay results should thus be confirmed by the tedious comparative virus neutralization test (VNT) using a panel of viruses known to circulate in the area. Moreover, the risk of emergence of new flaviviruses such as reported recently with the Zika virus in Brazil or in North America should be considered when studying flavivirus epidemiology.In the first section, a new strategy aiming at improving the serological diagnosis of flavivirus infections was developed using the multiplexing capacity of microsphere immunoassays (MIA). The flavivirus soluble envelope (sE) glycoprotein ectodomain is composed of three domains (D), e.g. DI, DII and DIII, with EDIII containing virus-specific epitopes. Recombinant EDIIIs of different flaviviruses were synthesized in the Drosophila S2 expression system. The microspheres coupled with rEDIIIs were assayed with equine and ovine sera from natural and experimental flavivirus infections or non-immune samples. Very encouraging results have been obtained and this innovative multiplex immunoassay based on flavivirus rEDIIIs appears to be a powerful alternative to ELISAs and VNTs for veterinary diagnosis of flavivirus-related diseases.MIA with WNV nonstructural 1 protein were also implemented to differentiate Infected from Vaccinated Animals (DIVA). Such a DIVA approach was only successful when horses had been immunized with a recombinant canarypox vaccine, while horses receiving inactivated WNV vaccine developed immune responses close to the ones induced after natural infection.Another pitfall in veterinary medicine is the lack of therapeutics for viral diseases and specifically for flaviviruses. The therapeutic arsenal is indeed rather limited and animals are generally administered supportive treatments only. In the second part, the results of the in vitro testing of a broad spectrum antiviral named sr1057 on WNV and JEV replication are presented. This chemical, identified from a unique screening strategy developed by Pasteur Institute, is probably targeting the host cell and was found to inhibit the replication of varied RNA and DNA viruses belonging to different virus families. The sr1057 compound was not as efficient at inhibiting the replication of flaviviruses as for other RNA+ viruses, with a modest antiviral effect demonstrated for WNV and a higher efficacy on JEV. This antiviral presents however potentials for applications in equine veterinary medicine because it efficiently inhibited equine herpes virus-1 and equine arteritis virus in vitro, as clearly shown by other collaborators.

Les maladies allergiques constituent une part importante des préoccupations de santé publique. Parmi elles, la maladie du poumon d’éleveur d’oiseaux (PEO) est une pathologie respiratoire liée à l’inhalation répétée de protéines antigéniques, localisées dans les fientes, les plumes et les squames des oiseaux. Actuellement, on connait peu de chose sur la nature des antigènes impliqués dans la maladie.La mise en évidence d’immunoglobulines G (IgG) spécifiques des agents étiologiques est un élément important dans la prise en charge diagnostique et thérapeutique. L’objectif de la thèse est d’identifier les protéines antigéniques de pigeon et de les produire par génie génétique afin de développer un test sérologique efficace et standardisé de type ELISA. L’approche immuno-protéomique développée combine l’utilisation d’analyses sérologiques (western blot, ELISA) et l’identification par spectrométrie de masse des protéines antigéniques et des protéines totales (shotgun) des fientes, squames et sérum de pigeon. Ainsi, 14 protéines antigéniques principalement localisées dans les fientes et les squames de pigeon ont été identifiées et 2 protéines recombinantes ont été produites, puis testées en ELISA. Les protéines recombinantes Immunoglobulin-lambda-like polypeptide-1 et Proprotéinase E sont très performantes pour le diagnostic sérologique du PEO avec une spécificité et une sensibilité respectives de 100% et 84%. Des protéines orthologues, potentiellement impliquées dans les réactions antigéniques croisées ont été identifiées à partir des fientes de perruche et de poule. Ce travail a permis d’identifier les protéines antigéniques des fientes de pigeon, d’apporter des précisions sur leur localisation, et de développer des antigènes recombinants standardisés et performants pour améliorer le diagnostic sérologique du PEO. Des études complémentaires, sur des modèles animaux et cellulaires, devront être menées pour explorer l'implication de ces protéines dans l'induction de la maladie. / Allergic diseases represent one of the most important public health concerns. Among them, Bird Fancier’s Lung disease (BFL) is a respiratory illness associated with repeated inhalation of antigenic proteins, present in bird droppings, feathers and blooms. Currently, little is known about the nature of the antigens involved in the disease. The detection of immunoglobulin G (IgG) specific etiologic agents is an important factor in diagnostic and therapeutic management.The objective of this thesis is to identify the antigenic proteins of pigeons and to produce them by genetic engineering in order to develop an effective and standardized ELISA-type serological test. The immuno-proteomic approach created combines the use of serological analyses (western blot, ELISA) and the identification by mass spectrometry of antigenic proteins and total proteins (shotgun) of pigeon droppings, blooms and serum. Thus, 14 antigenic proteins mainly located in droppings and blooms were identified, and 2 recombinant proteins were produced and then tested with ELISA.The recombinant proteins Immunoglobulin-lambda-like polypeptide-1 and Proproteinase E are highly effective for the serological diagnosis of BFL,with specificity and sensitivity rates of 100% and 84%, respectively. Orthologous proteins potentially involved in cross-antigen reactions were identified from budgerigar and hen droppings. This work made it possible to identify the antigenic proteins of pigeon droppings, to provide further details on their location, and to develop standardized and efficient recombinant antigens to improve the serological diagnosis of BFL.Additional studies on animals and cell models will be needed to explore the role of these proteins in the induction of the disease.