Submitted by Ana Maria Fiscina Sampaio (fiscina@bahia.fiocruz.br) on 2012-12-05T19:29:14Z No. of bitstreams: 1 Marco Antonio Araujo Silvany Avaliacao de antigenos... 2001.pdf: 74793034 bytes, checksum: af0b4fec858d7beea9f14722f79bec72 (MD5) / Made available in DSpace on 2012-12-05T19:29:14Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Marco Antonio Araujo Silvany Avaliacao de antigenos... 2001.pdf: 74793034 bytes, checksum: af0b4fec858d7beea9f14722f79bec72 (MD5) Previous issue date: 2001 / Fundação Oswaldo Cruz. Centro de Pesquisas Gonçalo Moniz. Salvador, Bahia, Brasil / Como a leishmaniose visceral (LV) ocorre principalmente em áreas onde os serviços de saúde são pouco desenvolvidos, o seu diagnóstico baseia-se principalmente no exame clínico, podendo ela ser confundida com outras doenças. Este estudo tem como objetivo a avaliação de antígenos recombinantes (rAg) visando o desenvolvimento e a validação de um “kit” para imunodiagnóstico da leishmaniose visceral, que seja simples, barato e possa ser aplicado em condições precárias. O sistema a ser desenvolvido baseia-se no uso concomitante de múltiplas proteínas recombinantes. [MATERIAL E MÉTODOS] Vários rAg foram clonados e alguns deles foram analisados para o uso em sorodiagnóstico em 93 soros de pacientes com leishmaniose visceral, selecionados clinicamente e com diagnóstico confirmado parasitológicamente. [RESULTADOS] Um total de oito rAgs foi avaliado. Todos os soros de LV reconheceram pelo menos um dos rAgs, sendo portanto a sensibilidade do teste para o conjunto de antígenos, testados isoladamente, de 100%. A especificidade do teste para o conjunto de antígenos, avaliada bem preliminarmente em um total de 36 soros controle (de indivíduos sem leishmaniose), foi também de 100%. Nesta dissertação é descrita também uma maneira simples de identificar em bibliotecas de DNA exatamente rAgs que vão aumentar a sensibilidade de um ensaio imunodiagnóstico. / Since visceral leishmaniasis (VL) occurs in areas where health services are scarce, its diagnosis is based mainly on clinical examination, making possible it to be confounded with other diseases. The objective of this study is to evaluate recombinant antigens (rAg) aiming at developing and validating a kit for immunodiagnosis of the visceral leishmaniasis that were simple, cheap and could be put into practice under precarious CQnditions. The system to be developed is based on the concomitant use of multiple recombinant proteins. [MATERIAL AND METHODS] Several recombinant antigens have been cloned and analysed in order to be used in serodiagnosis with reference to the antibody detection in 93 sera of patients with visceral leishmaniasis, clinically selected and with diagnosis parasitologically confirmed. [RESULTS] A total of eight rAgs were evaluated. All sera of VL were recognized at least by one rAg, so that the sensitivity for the group of antigens, isolated tested, was 100%. The specificity, preliminarily evaluated in a total of 36 control sera (of individuals without leishmaniasis) was also 100%. This dissertation describes also a simple way to identify, in genetic libraries, exactly the rAgs that will increase immunoassay sensibility.

Les pneumopathies d'hypersensibilité sont des maladies respiratoires liées à l'inhalation répétée de substances antigéniques. Le diagnostic nécessite la présence d'un ensemble d'arguments cliniques, radiologiques, fonctionnels et immunologiques car les symptômes sont peu spécifiques. La mise en évidence d'immunoglobulines G (IgG) spécifiques des agents étiologiques est un élément essentiel dans la prise en charge diagnostique et thérapeutique. L'objectif de ce travail de thèse était d'identifier des protéines bactériennes et fongiques reconnues par les IgG des patients atteints de la maladie du poumon de fermier (PDF) et du poumon de mécanicien (FDM), et de produire ces protéines de façon recombinante afin de développer des tests sérologiques standardisés de type ELISA. Deux micro-organismes impliqués dans le PDF (Saccharopolyspora rectivirgula et Eurotium amstelodami, un Aspergillus), et un micro-organisme impliqué dans le PDM (Mycobacterium immunogenum) ont été étudiés. L'approche immunoprotéomique développée a permis de sélectionner les protéines d'intérêt, puis de produire les antigènes recombinants correspondants par génie génétique. Des sérums de patients PDF, PDM et de témoins exposés ont été recueillis dans le cadre de protocoles cliniques multicentriques. Les performances (sensibilité, spécificité, aire sous la courbe) des tests ELISA-IgG utilisant les antigènes recombinants produits ont été évaluées par l'analyse en courbe ROV (Receiver operating characteristics). A partir des trois micro-organismes étudiés, 71 protéines immuno-réactives ont été identifiées et 28 protéines recombinantes ont été produites et testées en ELISA. Pour le diagnostic du PDM, deux antigènes recombinants, la dihydrolipoyl déshydrogénase and Facyl-CoA déshydrogénase, étaient particulièrement performants avec une sensibilité de 90% lorsqu'ils étaient utilisés en combinaison. Pour le diagnostic du PDF, deux antigènes recombinants à'Aspergillus, la Glu/Leu/Phe/Val déshydrogénase et la glucose-6-phosphate isomérase, ont permis d'obtenir une sensibilité de 89% et une spécificité de 84%. L'utilisation de trois antigènes recombinants de S. rectivirgula,SRl¥A (protéine de fonction inconnue), SRI? (catalase) et SR22 (kétol acide réducto-isomérase), ont permis d'obtenir une sensibilité et spécificité optimales de 83% et 77%. Les protéines identifiées étaient majoritairement des protéines enzymatiques, dont certaines ont été mis en évidence comme facteurs de virulence dans d'autres pathologies. Des études complémentaires, sur des modèles animaux et sur des modèles cellulaires, devront être mennées pour explorer l'implication de ces protéines dans l'induction de la maladie. Ce travail a permis d'améliorer les connaissances sur les protéines bactériennes et fongiques reconnues par les anticorps des patients atteints de PDF et de PDM, de développer des antigènes recombinants, et de mettre au point des tests sérologiques standardisés et performants. Ces tests pourront faire l'objet d'une valorisation vers l'industrie. En effet, les sérologies pour le diagnostic des PHS sont des demandes courantes dans les laboratoires d'analyse médicale. / The hypersensitivity pneumonitis is a pulmonary disease caused by repetitive inhalation of antigens. The diagnosis requires clinical, radiological, functional and immunological features because of unspecific symptoms. The identification of specifie antibodies to causative antigens is an essential way for the diagnosis and therapeutic management.The aims of this thesis work were to identify bacterial and fungal immunogenic proteins specifie to patient with farmer's lung (FL) and machine operator's lung (MOL) diseases, to synthesize specifie recombinant antigens for the development of a standardized ELISA. Two microorganisms involved in FL (Saccharopolyspora rectivirgula and Eurotium amstelodami (Aspergillus sp)), and one involved in MOL had been srudied. The immunoproteomics approach has permit to select interesting proteins and to synthesize recombinant antigens by genomics techniques. The sera from FL patients (n=52), MOL patients (n=16) and sera from exposed control subjects were recruited. ELISA-IgG using recombinant antigens efficacies were evaluated by Receiver operating characteristics analysis (sensitivity, specifïcity, area under the curve).From the three srudied microorganisms, 71 immunogenic proteins were identified and 28 recombinant antigens were produced and tested by ELISA. For the MOL diagnosis, the recombinants dihydrolipoyl dehydrogenase and acyl-CoA dehydrogenase were useful with a sensitivity of 90% when used in combination. For the FL diagnosis, two recombinant proteins from Aspergillus, Glu/Leu/Phe/Val dehydrogenase and glucose-6-phosphate isomerase had a sensitivity of 89% and a specifïcity of 84%. A combination of the three recombinant antigens from S. rectivirgula, SRI FA (unknown function), SRI 7 (catalase) and SR22 (ketol acid reductoisomerase) allowed to obtain a sensitivity of 83% and a specificity of 77%. The immunogenic proteins were mainly enzymes, and some of these have been implicated in important functions for survival or the virulence of others pathogens. Further studies are required to determine the role of these proteins in immunological or virulence processes by animal and cellular model application. This present work has improved our knowledge about bacterial and fungal proteins recognized by FL and MOL patient's antibodies, and to develop useful standardized serological tests with new recombinant antigens. These tests could be exported to the health management in industry. Indeed, hypersensitivity pneumonitis serodiagnosis tests are common requests in medical analysis laboratories

A doença de Chagas é uma zoonose causada pelo protozoário flagelado Trypanosoma cruzi. Estima-se que 8 milhões de pessoas estão infectadas com o T. cruzi em todo o mundo, principalmente na América Latina. Testes tradicionais de diagnóstico estão sendo gradualmente substituídos por métodos inovadores. A utilização de antígenos recombinantes foi proposta nos anos 90, e várias combinações foram testadas com soros de pacientes com diferentes formas clínicas de diferentes regiões da América Latina. Apesar do ganho em especificidade, estes testes apresentaram menor sensibilidade, frustrando expectativas. Este estudo objetivou analisar a variabilidade genética dos genes KMP11 e 1F8 que codificam antígenos comumente utilizados em diagnóstico experimental. Cepas de T. cruzi pertencentes a diferentes sub-grupos taxonômicos e de diferentes regiões foram analisadas para avaliar o impacto da variação antigênica em testes de diagnóstico. Maximizando a sensibilidade, evitar reatividade cruzada com epítopos de outros agentes patogênicos deve permitir a concepção de melhores testes rápidos. Num primeiro passo, DNA genômico foi extraído das seguintes cepas: Dm28c, Colombiana, Y, 3663, 4167, LL014 e CL Brener e foi realizada a amplificação dos genes 1F8 e KMP11 que codificam antígenos a partir destas cepas. Em seguida foram realizadas a clonagem, sequenciamento, expressão e detecção dos antígenos recombinantes. Na etapa final, análises de estruturas secundárias e terciárias, a última apenas para o antígeno 1F8, visualizaram as diferenças nas sequências de aminoácidos obtidas a partir de sequenciamento de DNA. Os resultados apresentados neste estudo mostram que o antígeno KMP11 de T. cruzi possui uma similaridade na sequência de aminoácidos muito elevada com o T. rangeli, mostrando a necessidade de um mapeamento antigênico desta proteína em todos os tripanosomatídeos que apresentaram alta similaridade com o antígeno de T. cruzi, como o T. rangeli, para verificar a presença de epítopos específicos de T. cruzi. O antígeno 1F8 pode ser uma ferramenta útil no diagnóstico da doença de Chagas e que será necessário aprofundar os conhecimentos sobre os determinantes antigênicos para futuramente elaborar poli-epítopos sintéticos adaptados de um maior número possível de antígenos, obtendo a maior especificidade e sensibilidade nos testes de diagnóstico sorológico e de teste rápido da doença de Chagas. Este estudo representa um passo crucial para a otimização de antígenos recombinantes para o diagnóstico da doença de Chagas. / Chagas disease is a zoonosis caused by the flagellate protozoan Trypanosoma cruzi. An estimated 8 million people are infected with T. cruzi worldwide, mostly in Latin America. Traditional diagnostic tests are gradually being replaced by more innovative methods, such as rapid tests and Real Time PCR. The use of recombinant antigens in serology or rapid tests has been proposed in the 90s, and several combinations were tested with sera from patients with different clinical forms in different regions in Latin America. Despite the gain in specificity, these tests showed lower sensitivity, frustrating expectations. This study aims to analyze the genetic variability of KMP11 and 1F8 genes coding for antigens commonly used in such experimental diagnostic. T. cruzi strains belonging to different taxonomic sub-groups and different regions were analyzed in order to assess the impact of antigenic variation in diagnostic tests. Maximizing sensitivity and avoiding cross-reactive epitopes for other pathogens should allow for the design of better rapid tests. In a first step, genomic DNA was extracted from the following strains: DM28c, Colombiana, Y, 3663, 4167, LL014 and CL Brener and we performed amplification of the 1F8 and KMP11 antigen encoding genes from these strains. Gene fragments were cloned, sequenced, and subcloned in expression vectors, followed by detection of the recombinant antigens. Using structural prediction and modeling, secondary and tertiary structures were analyzed the latter only for the 1F8 antigen, to visualize the differences in the amino acid sequences revealed from DNA sequencing. The results presented in this study show that the KMP11 T. cruzi antigen, has a very high similarity in amino acid sequence with T. rangeli, showing the need for antigenic mapping of this protein in all trypanosomatids that showed high similarity with the T. cruzi and T. rangeli, for the presence of specific epitopes of T. cruzi. The 1F8 antigen may be a useful tool in the diagnosis of Chagas disease and will need to know more about the antigenic determinants to further develop poly-epitope synthetic adapted from a larger number of possible antigens, obtaining the highest specificity and sensitivity in tests serological diagnosis and rapid test for Chagas disease.This study represents a crucial step for the optimization of recombinant antigens for the diagnosis of Chagas disease.

Leprosy is a chronic infectious disease caused by Mycobacterium leprae. It is estimated that less than 1% of the individuals infected with M. leprae develop the disease. Several authors suggest that the genetic pattern and variations in the mechanisms of the patient's immune response influence the susceptibility or resistance to disease. The most recent studies have established the role of Th1, Th2 and Treg cell responses in immunopathogenesis of leprosy. However, several mechanisms of the immune response that act in clinical evolution still lack clarification, such as the role of Th17 cells, and the innate immune response. The objective of this study was to evaluate the role of the immune response in the clinical presentation of leprosy and the use of M. leprae recombinant antigens as a perspective for the development of prognostic and immunoprophylaxis tools. To investigate the involvement of immune response in the pathogenesis of leprosy, we analyzed the cytokine profile in lesions, in serum, and peripheral blood mononuclear cells (PBMC) stimulated with M. leprae antigens in leprosy patients and household contactants (HHC). CD4+IL-17+ T cells expressing IL-17A, IFN-γ and IL-10 were evaluated by confocal microscopy in lesions from patients with tuberculoid (TT, n = 09) and lepromatous leprosy (LL, n = 08). Inflammatory cytokines were measured in serum samples from 23 paucibacillary (PB) patients, 28 multibacillary (MB) and 23 HHC, using the Luminex technique. The phenotype of lymphocytes producing IL-17A and IFN-γ was determined by flow cytometry. In addition, PBMC from leprosy patients and HHC were stimulated with crude M. leprae (MLCS) and M. tuberculosis (PPD) and a recombinant antigen of M. leprae (ML2028), and the cytokine profile and the CD4+ and CD8+ multifunctional T cells (producing IFN-γ, IL-2 or TNF-α) of effector and central memory were analyzed. We observed that TT lesions expressed more CD4+IL-17A+ cells than LL. Higher levels of IFN-γ were detected in PB patients, but also in MB patients who presented leprosy reactions (LR) at the time of evaluation (MB LR+). Significantly, higher concentrations of IL-17A and IL-1β were observed in serum from PB than in from MB patients. Ex vivo cell analysis by flow cytometry revealed higher frequency of Th17 cells in TT than LL patients, and it is not high in LL patients with LR. These results indicate that the Th17 cells are associated with an effective inflammatory response that occurs in PB presentation of leprosy but were not associated with the inflammatory response in LR. Th1 response was also associated with PB presentation. However, high levels of IFN-γ were also associated with LR. Multiparameter analyzes by flow cytometry revealed a higher frequency of multifunctional T cells specific for M. leprae antigens in HHC than in leprosy patients, and it might explain the absence of disease in these individuals. These data indicate that these antigens are capable of inducing a more effective immune response and multifunctional T cell memory against M. leprae infection, and open perspectives for the future development of immunoprophylaxis with M. leprae antigens. Additionally, this study suport the attempt to induce a Th1 and Th17 response in individuals at risk of acquiring the disease, even considering this could induce only a partial protection, because it would protect against the most severe MB forms of leprosy, and reduce the disease transmission. This Thesis includes one paper accepted for publication, about the role of Th1 and Th17 cells in subjects with different clinical forms of leprosy, and another paper submitted about the immune response to M. leprae crude and recombinant antigens. / A Hanseníase é uma doença infecciosa crônica e de evolução lenta causada pelo Mycobacterium leprae. A literatura sugere que menos de 1% dos indivíduos infectados pelo bacilo evolui com a doença. O padrão genético dos indivíduos e diferenças nos mecanismos da resposta imune do paciente influenciam na susceptibilidade ou resistência à infecção e apresentação clínica da doença. Os estudos mais recentes estabeleceram o papel das respostas de células Th1, Th2 e Treg na imunopatogênese da hanseníase. No entanto, diversos mecanismos das células Th17 e o papel da resposta imune inata na doença ainda não estão bem estabelecidos. Diante disso, este estudo teve como objetivo avaliar o papel da resposta imune na apresentação clínica da hanseníase e o uso de antígenos brutos e recombinante de M. leprae como perspectiva para o desenvolvimento de ferramentas de prognóstico e imunoprofilaxia. Para investigar o envolvimento das células da resposta imune na patogênese da hanseníase, analisamos o perfil de citocinas em lesões, nos soros, e em células mononucleares do sangue periférico (PBMC) estimuladas com antígenos de M. leprae em pacientes com hanseníase e controles contactantes sadios (CCS). As células T CD4+IL-17+ e que expressam IL-17A, IFN- e IL-10 foram avaliadas por microscopia confocal em biópsias de lesões de pacientes com hanseníase tuberculóide (HT, n = 9) e virchowiana (HV, n = 8). As citocinas inflamatórias foram dosadas em amostras de soro de 23 paucibacilares (PB), 28 multibacilares (MB) e em 23 CCS, pela técnica de Luminex. O fenótipo de linfócitos produtores de IL-17A e IFN-γ foi determinado por citometria de fluxo. Além disso, PBMC de pacientes com hanseníase e de CCS foram estimuladas com os antígenos brutos de M. leprae (MLCS), M. tuberculosis (PPD) e recombinante de M. leprae, (ML2028), e o perfil de citocinas e o fenótipo das células T CD4+ e CD8+ multifuncionais (produtoras de IFN-γ, IL-2 ou TNF-α) de memória efetora e central foram analisados. Observamos que as lesões de HT expressaram mais células CD4+IL-17A+ do que as de HV. Níveis mais elevados de IFN-γ sérico foram detectados em pacientes com as formas HT e em MB que apresentavam reações hansênicas (MB RH+). Concentrações mais elevadas de IL-17A e IL-1β foram observadas nos soros de pacientes PB do que em MB. As análises das células ex vivo por citometria de fluxo revelaram maior frequência de células Th17 nos pacientes com hanseníase tuberculóide (HT) em comparação com aqueles com hanseníase virchowiana (HV). Estes resultados indicam que a resposta Th17 está associada a uma resposta inflamatória efetiva que se apresenta nas formas PB, mas não estão associadas à resposta inflamatória durante as reações hansênicas. A resposta Th1 também está associada às formas PB, entretanto altos níveis de IFN-γ foram associados também aos episódios de reação hansênica. As análises multiparamétricas por citometria de fluxo revelaram maior frequência de células T multifuncionais antígeno-específicas em CCS, do que em pacientes com hanseníase. Nossos dados indicam que controles contactantes, quando estimulados com antígenos brutos e com o ML2028 recombinante, produziram mais células T multifuncionais e isto sugere que estas células proporcionam uma resposta imunológica mais eficaz contra a infecção por M. leprae, podendo explicar a ausência de doença nesses indivíduos. Estes dados sugerem que esses antígenos são capazes de induzir uma resposta protetora e indutora de células T multifuncionais de memória e abrem perspectivas para o desenvolvimento futuro de imunoprofilaxia com estes antígenos de M. leprae. Além disso, o estudo dá suporte à busca de induzir uma resposta Th1 e Th17 em indivíduos em risco de adquirir a doença, mesmo que haja uma proteção parcial, pois neste caso haveria uma proteção contra formas mais graves MB, e reduziria também a transmissão da doença. Esta tese é composta por um artigo aceito para publicação sobre a resposta de células Th17 e Th1 nas formas clínicas da hanseníase e outro submetido sobre a resposta a antígenos recombinantes de M. leprae na indução de células T multifuncionais.

A doença de Chagas é uma zoonose causada pelo protozoário flagelado Trypanosoma cruzi. Estima-se que 8 milhões de pessoas estão infectadas com o T. cruzi em todo o mundo, principalmente na América Latina. Testes tradicionais de diagnóstico estão sendo gradualmente substituídos por métodos inovadores. A utilização de antígenos recombinantes foi proposta nos anos 90, e várias combinações foram testadas com soros de pacientes com diferentes formas clínicas de diferentes regiões da América Latina. Apesar do ganho em especificidade, estes testes apresentaram menor sensibilidade, frustrando expectativas. Este estudo objetivou analisar a variabilidade genética dos genes KMP11 e 1F8 que codificam antígenos comumente utilizados em diagnóstico experimental. Cepas de T. cruzi pertencentes a diferentes sub-grupos taxonômicos e de diferentes regiões foram analisadas para avaliar o impacto da variação antigênica em testes de diagnóstico. Maximizando a sensibilidade, evitar reatividade cruzada com epítopos de outros agentes patogênicos deve permitir a concepção de melhores testes rápidos. Num primeiro passo, DNA genômico foi extraído das seguintes cepas: Dm28c, Colombiana, Y, 3663, 4167, LL014 e CL Brener e foi realizada a amplificação dos genes 1F8 e KMP11 que codificam antígenos a partir destas cepas. Em seguida foram realizadas a clonagem, sequenciamento, expressão e detecção dos antígenos recombinantes. Na etapa final, análises de estruturas secundárias e terciárias, a última apenas para o antígeno 1F8, visualizaram as diferenças nas sequências de aminoácidos obtidas a partir de sequenciamento de DNA. Os resultados apresentados neste estudo mostram que o antígeno KMP11 de T. cruzi possui uma similaridade na sequência de aminoácidos muito elevada com o T. rangeli, mostrando a necessidade de um mapeamento antigênico desta proteína em todos os tripanosomatídeos que apresentaram alta similaridade com o antígeno de T. cruzi, como o T. rangeli, para verificar a presença de epítopos específicos de T. cruzi. O antígeno 1F8 pode ser uma ferramenta útil no diagnóstico da doença de Chagas e que será necessário aprofundar os conhecimentos sobre os determinantes antigênicos para futuramente elaborar poli-epítopos sintéticos adaptados de um maior número possível de antígenos, obtendo a maior especificidade e sensibilidade nos testes de diagnóstico sorológico e de teste rápido da doença de Chagas. Este estudo representa um passo crucial para a otimização de antígenos recombinantes para o diagnóstico da doença de Chagas. / Chagas disease is a zoonosis caused by the flagellate protozoan Trypanosoma cruzi. An estimated 8 million people are infected with T. cruzi worldwide, mostly in Latin America. Traditional diagnostic tests are gradually being replaced by more innovative methods, such as rapid tests and Real Time PCR. The use of recombinant antigens in serology or rapid tests has been proposed in the 90s, and several combinations were tested with sera from patients with different clinical forms in different regions in Latin America. Despite the gain in specificity, these tests showed lower sensitivity, frustrating expectations. This study aims to analyze the genetic variability of KMP11 and 1F8 genes coding for antigens commonly used in such experimental diagnostic. T. cruzi strains belonging to different taxonomic sub-groups and different regions were analyzed in order to assess the impact of antigenic variation in diagnostic tests. Maximizing sensitivity and avoiding cross-reactive epitopes for other pathogens should allow for the design of better rapid tests. In a first step, genomic DNA was extracted from the following strains: DM28c, Colombiana, Y, 3663, 4167, LL014 and CL Brener and we performed amplification of the 1F8 and KMP11 antigen encoding genes from these strains. Gene fragments were cloned, sequenced, and subcloned in expression vectors, followed by detection of the recombinant antigens. Using structural prediction and modeling, secondary and tertiary structures were analyzed the latter only for the 1F8 antigen, to visualize the differences in the amino acid sequences revealed from DNA sequencing. The results presented in this study show that the KMP11 T. cruzi antigen, has a very high similarity in amino acid sequence with T. rangeli, showing the need for antigenic mapping of this protein in all trypanosomatids that showed high similarity with the T. cruzi and T. rangeli, for the presence of specific epitopes of T. cruzi. The 1F8 antigen may be a useful tool in the diagnosis of Chagas disease and will need to know more about the antigenic determinants to further develop poly-epitope synthetic adapted from a larger number of possible antigens, obtaining the highest specificity and sensitivity in tests serological diagnosis and rapid test for Chagas disease.This study represents a crucial step for the optimization of recombinant antigens for the diagnosis of Chagas disease.

Leprosy is a chronic infectious disease caused by Mycobacterium leprae. It is estimated that less than 1% of the individuals infected with M. leprae develop the disease. Several authors suggest that the genetic pattern and variations in the mechanisms of the patient's immune response influence the susceptibility or resistance to disease. The most recent studies have established the role of Th1, Th2 and Treg cell responses in immunopathogenesis of leprosy. However, several mechanisms of the immune response that act in clinical evolution still lack clarification, such as the role of Th17 cells, and the innate immune response. The objective of this study was to evaluate the role of the immune response in the clinical presentation of leprosy and the use of M. leprae recombinant antigens as a perspective for the development of prognostic and immunoprophylaxis tools. To investigate the involvement of immune response in the pathogenesis of leprosy, we analyzed the cytokine profile in lesions, in serum, and peripheral blood mononuclear cells (PBMC) stimulated with M. leprae antigens in leprosy patients and household contactants (HHC). CD4+IL-17+ T cells expressing IL-17A, IFN-γ and IL-10 were evaluated by confocal microscopy in lesions from patients with tuberculoid (TT, n = 09) and lepromatous leprosy (LL, n = 08). Inflammatory cytokines were measured in serum samples from 23 paucibacillary (PB) patients, 28 multibacillary (MB) and 23 HHC, using the Luminex technique. The phenotype of lymphocytes producing IL-17A and IFN-γ was determined by flow cytometry. In addition, PBMC from leprosy patients and HHC were stimulated with crude M. leprae (MLCS) and M. tuberculosis (PPD) and a recombinant antigen of M. leprae (ML2028), and the cytokine profile and the CD4+ and CD8+ multifunctional T cells (producing IFN-γ, IL-2 or TNF-α) of effector and central memory were analyzed. We observed that TT lesions expressed more CD4+IL-17A+ cells than LL. Higher levels of IFN-γ were detected in PB patients, but also in MB patients who presented leprosy reactions (LR) at the time of evaluation (MB LR+). Significantly, higher concentrations of IL-17A and IL-1β were observed in serum from PB than in from MB patients. Ex vivo cell analysis by flow cytometry revealed higher frequency of Th17 cells in TT than LL patients, and it is not high in LL patients with LR. These results indicate that the Th17 cells are associated with an effective inflammatory response that occurs in PB presentation of leprosy but were not associated with the inflammatory response in LR. Th1 response was also associated with PB presentation. However, high levels of IFN-γ were also associated with LR. Multiparameter analyzes by flow cytometry revealed a higher frequency of multifunctional T cells specific for M. leprae antigens in HHC than in leprosy patients, and it might explain the absence of disease in these individuals. These data indicate that these antigens are capable of inducing a more effective immune response and multifunctional T cell memory against M. leprae infection, and open perspectives for the future development of immunoprophylaxis with M. leprae antigens. Additionally, this study suport the attempt to induce a Th1 and Th17 response in individuals at risk of acquiring the disease, even considering this could induce only a partial protection, because it would protect against the most severe MB forms of leprosy, and reduce the disease transmission. This Thesis includes one paper accepted for publication, about the role of Th1 and Th17 cells in subjects with different clinical forms of leprosy, and another paper submitted about the immune response to M. leprae crude and recombinant antigens. / A Hanseníase é uma doença infecciosa crônica e de evolução lenta causada pelo Mycobacterium leprae. A literatura sugere que menos de 1% dos indivíduos infectados pelo bacilo evolui com a doença. O padrão genético dos indivíduos e diferenças nos mecanismos da resposta imune do paciente influenciam na susceptibilidade ou resistência à infecção e apresentação clínica da doença. Os estudos mais recentes estabeleceram o papel das respostas de células Th1, Th2 e Treg na imunopatogênese da hanseníase. No entanto, diversos mecanismos das células Th17 e o papel da resposta imune inata na doença ainda não estão bem estabelecidos. Diante disso, este estudo teve como objetivo avaliar o papel da resposta imune na apresentação clínica da hanseníase e o uso de antígenos brutos e recombinante de M. leprae como perspectiva para o desenvolvimento de ferramentas de prognóstico e imunoprofilaxia. Para investigar o envolvimento das células da resposta imune na patogênese da hanseníase, analisamos o perfil de citocinas em lesões, nos soros, e em células mononucleares do sangue periférico (PBMC) estimuladas com antígenos de M. leprae em pacientes com hanseníase e controles contactantes sadios (CCS). As células T CD4+IL-17+ e que expressam IL-17A, IFN- e IL-10 foram avaliadas por microscopia confocal em biópsias de lesões de pacientes com hanseníase tuberculóide (HT, n = 9) e virchowiana (HV, n = 8). As citocinas inflamatórias foram dosadas em amostras de soro de 23 paucibacilares (PB), 28 multibacilares (MB) e em 23 CCS, pela técnica de Luminex. O fenótipo de linfócitos produtores de IL-17A e IFN-γ foi determinado por citometria de fluxo. Além disso, PBMC de pacientes com hanseníase e de CCS foram estimuladas com os antígenos brutos de M. leprae (MLCS), M. tuberculosis (PPD) e recombinante de M. leprae, (ML2028), e o perfil de citocinas e o fenótipo das células T CD4+ e CD8+ multifuncionais (produtoras de IFN-γ, IL-2 ou TNF-α) de memória efetora e central foram analisados. Observamos que as lesões de HT expressaram mais células CD4+IL-17A+ do que as de HV. Níveis mais elevados de IFN-γ sérico foram detectados em pacientes com as formas HT e em MB que apresentavam reações hansênicas (MB RH+). Concentrações mais elevadas de IL-17A e IL-1β foram observadas nos soros de pacientes PB do que em MB. As análises das células ex vivo por citometria de fluxo revelaram maior frequência de células Th17 nos pacientes com hanseníase tuberculóide (HT) em comparação com aqueles com hanseníase virchowiana (HV). Estes resultados indicam que a resposta Th17 está associada a uma resposta inflamatória efetiva que se apresenta nas formas PB, mas não estão associadas à resposta inflamatória durante as reações hansênicas. A resposta Th1 também está associada às formas PB, entretanto altos níveis de IFN-γ foram associados também aos episódios de reação hansênica. As análises multiparamétricas por citometria de fluxo revelaram maior frequência de células T multifuncionais antígeno-específicas em CCS, do que em pacientes com hanseníase. Nossos dados indicam que controles contactantes, quando estimulados com antígenos brutos e com o ML2028 recombinante, produziram mais células T multifuncionais e isto sugere que estas células proporcionam uma resposta imunológica mais eficaz contra a infecção por M. leprae, podendo explicar a ausência de doença nesses indivíduos. Estes dados sugerem que esses antígenos são capazes de induzir uma resposta protetora e indutora de células T multifuncionais de memória e abrem perspectivas para o desenvolvimento futuro de imunoprofilaxia com estes antígenos de M. leprae. Além disso, o estudo dá suporte à busca de induzir uma resposta Th1 e Th17 em indivíduos em risco de adquirir a doença, mesmo que haja uma proteção parcial, pois neste caso haveria uma proteção contra formas mais graves MB, e reduziria também a transmissão da doença. Esta tese é composta por um artigo aceito para publicação sobre a resposta de células Th17 e Th1 nas formas clínicas da hanseníase e outro submetido sobre a resposta a antígenos recombinantes de M. leprae na indução de células T multifuncionais.

Made available in DSpace on 2014-07-29T15:30:39Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Dissetacao Arioldo Vasconcelos Junior.pdf: 3999475 bytes, checksum: fcfb183b016528e836128fc94bae53f7 (MD5) Previous issue date: 2008-02-21 / This work characterized the specific cellular immune response of TCD4 and TCD8 lymphocytes against recombinant Mycobacterium tuberculosis at the Hospital Anuar Auad, Goiania Brazil, and constituted of two experimental groups: 1) 22 active TB patients with positive acid fast aputum, X-ray indicative of tuberculosis, smear culture positive for M. tuberculosis and HIV negative. 2) 15 sex and age matched healthy controls, tuberculin skin test and HIV negative. Venous blood was drawn and processed to obtain PBMC that were cultivated for 96 hours with the specific antigens (1mg/106 cells). TCD8 and TCD4 cells were analyzed by flow citometry for IL-10 and IFN-g production. In general, the percentage of positive TCD4 and TCD8 cells for IFN-g and IL-10 were superior among the TB patients. Additionally, TCD4+IFNg+ (5,63±2,43) and IL-10+ (5,83± 2,19) cells were significantly higher in TB patients than in healthy controls (TCD4+IFNg+ =1,75±0,71 and IL-10+ =1,47±0,90), (p<0,01). Regarding the percentage of TCD8 cells, a higher percentage of IFNg+ (4,33±1,45) and IL-10+ (4,01±1,14) among TB patients than controls (TCD8+IFNg+ = 1,49±0,42 and IL- 10+ 1,62±0,59) was observed (p<0,01). TB treatment did not alter the response to the tested antigens immediately after the treatment initiation. In conclusion, the recombinant antigens MPT-51, ESAT-6, GLcB, Ag85A were recognized by the specific immune response of active TB patients. Key words: Tuberculosis, Mycobacterium tuberculosis, Recombinant antigens, Cellular immune response. to the tested antigens immediately after the treatment initiation. In conclusion, the recombinant antigens MPT-51, ESAT-6, GLcB, Ag85A were recognized by the specific immune response of active TB patients. / Este trabalho avaliou a resposta imune celular dos linfócitos TCD4 e TCD8 de pacientes com tuberculose pulmonar ativa antes e após o tratamento, contra os antígenos recombinantes MPT-51, ESAT-6, GLcB, Ag85A e o Filtrado Protéico de Cultura (CFP) de Mycobacterium tuberculosis atendidos no Hospital de Doenças Tropicais Anuar Auad. A população de estudo, composta de 37 indivíduos, foi dividida em dois grupos experimentais. 1) 22 pacientes com tuberculose pulmonar, selecionados de acordo com idade, diagnóstico confirmado por baciloscopia (BAAR), radiografia evidente de tuberculose, HIV1/2 negativos. 2) 15 controles saudáveis negativos para prova tuberculinica (PT) e HIV1/2, pareados por faixa etária e sexo aos pacientes selecionados. Coletou-se aproximadamente 20 ml de sangue com heparina. O sangue total foi processado e cultivado por 96 horas na presença dos antígenos recombinantes e os linfócitos TCD4 e TCD8 foram analisados quanto à positividade para as citocinas IL-10 e IFN-g por citometria de fluxo. As porcentagens de linfócitos responsivos aos diversos antígenos de M. tuberculosis apresentaram-se em geral superiores aos controles. A porcentagem dos linfócitos TCD4+IFNg+ (5,63±2,43) e IL-10+ (5,83±2,19) foram maiores em pacientes com tuberculose pulmonar ativa em comparação com os linfócitos TCD4+IFNg+ (1,75±0,71) e IL-10+ (1,47±0,90) dos controles (p<0,01). Também, as porcentagens dos linfócitos TCD8+IFNg+ (4,33±1,45) e IL-10+ (4,01 ±1,14) dos pacientes foram maiores que os linfócitos TCD8+IFNg+ (1,49±0,42) e IL-10+ (1,62±0,59) dos controles (p<0,01). Não houve diferença significativa antes (5,63±2,43) e após (5,0±2,0) o tratamento nas populações celulares TCD4+ e TCD8+ positivas para IFN-g e IL-10 quando estimuladas com o painel de antígenos (p>0,05). Com estes resultados podemos considerar que todos os antígenos testados (MPT-51, ESAT-6, GLcB, Ag85A) são reconhecidos pelos linfócitos TCD4+ e TCD8+ de pacientes com tuberculose pulmonar ativa.

Die parasitische Milbe Sarcoptes scabiei, die im Stratum corneum ihres Wirtes lebt, ist weit verbreitet. Eine zuverlässige Diagnose mittels herkömmlicher Techniken ist unzulänglich. Serologische Tests unter Verwendung von Gesamtantigen sind aufwändig und teuer in der Herstellung, und Kreuzreaktionen mit freilebenden Milben können zu falsch positiven Ergebnissen führen. Von dem Einsatz spezifischer rekombinanter Antigene ist eine Verbesserung der Serodiagnostik zu erwarten. In dieser Arbeit wurde eine cDNA-Bank aller Entwicklungsstadien von S. scabiei var. suis erstellt. Unter Verwendung eines humanen Skabies-positiven Sammelserums wurden 61 rekombinante immunreaktive Klone von S. scabiei isoliert, und das Protein von sieben dieser Klone als Diagnostikkandidaten wurde aufgereinigt. Die identifizierten Sequenzen zeichnen sich z. T. durch das Vorhandensein repetitiver Bereiche aus. Die rekombinanten Proteine wurden im ELISA unter Verwendung von Human- und Schweineseren auf ihre Sensitivität geprüft. Die Antigene zeigten signifikante Differenzen zwischen den Reaktionen mit den humanen Positiv- bzw. Negativseren, während dies bezüglich der Reaktion mit den porzinen Seren, nur für vier der Antigene der Fall war. Unspezifische Reaktionen mit E. coli-Protein sowie GST bei einem als Fusionsprotein exprimierten Antigen erwiesen sich als störend. 42.6% der isolierten Klone enthalten eine repetitive zentrale Region, deren offener Leserahmen hauptsächlich für die Aminosäuren Glutamat und Lysin kodiert. Obwohl sie große Homologien aufweisen, unterscheiden sich die Transkripte sowohl im zentralen Bereich als auch am 3´-Ende voneinander. Mittels der Southern Blot-Analyse konnte in Sarcoptes nur eine Genkopie detektiert werden, während dieses Gen in Dermatophagoides-Milben nicht nachgewiesen werden konnte. Auf Grund der Spezifität des Antigens für die parasitischen Milben könnte dieses Antigen für die Serodiagnostik besonders geeignet sein. Anhand von immunhistochemischen Untersuchungen wurden entsprechende Proteine in einer Organstruktur, bei der es sich vermutlich um die Hoden der Milben handelt, detektiert. In dieser Arbeit wurden rekombinante Antigene für die Serodiagnostik der Sarcoptes-Infektion bereitgestellt. Es wurde gezeigt, dass das Expressionssystem E. coli als Produktionssystem rekombinanter Antigene für die Serodiagnostik von Sarcoptes-Infektionen möglicherweise ungeeignet ist. / The parasitic mite Sarcoptes scabiei, which lives in the Stratum corneum of the host, is prevalent worldwide. Reliable diagnosis using conventional methods is unsatisfying. Serological tests using the total antigen are labour intensive and expensive to produce, and moreover there exist unspecific crossreactions against house dust mites, which lead to false positive results. We expect an improvement of serological diagnosis using specific recombinant antigens of the Sarcoptes-mites. In this work, we constructed a cDNA-library of all stages from S. scabiei var. suis. Using scabies-positive pooled human sera, we isolated 61 recombinant immunoreactive clones and purified the protein of seven clones as potential candidates for diagnosis. The identified sequences are partially characterized by the presence of repetitive domains. The recombinant proteins were tested for their sensitivity in the ELISA, using positive and negative human- and porcine sera. There exist significant differences between the reactions of the positive and negative sera for all the seven antigens using human sera. In contrast, with the porcine sera, significant difference could be detected only in four antigens. Reactions against of E. coli-protein and the GST in the fusionprotein caused problems of unspecific background. 42.6% of the isolated clones contain a repetitive central region, and the ORF mainly encodes the aminoacids glutamate and lysine. Altough there exist high homologies, the sequences of the transcripts differ in the central region and at the 3´-end. By southern blot analysis we could show one copy of the gene, while it was not detected in the genome of the free-living Dermatophagoides-mites. As for the specificity for the parasitic mites, the antigens might be good candidates for immunodiagnosis. In immunohistochemical studies the proteins were detected in a paired structure in the posterior part of the mites opisthosoma, which might be the testis. In this study, recombinant antigens of S. scabiei were produced and tested for the use in immunodiagnosis. It was shown, that the E. coli-expression system might be unsuitable for the production of recombinant antigens for their use in immunodiagnosis of Sarcoptes-infections.

Made available in DSpace on 2014-12-17T15:01:21Z (GMT). No. of bitstreams: 1 RobertaVAC_DISSERT.pdf: 2111666 bytes, checksum: 5b317150d6db63bae04e852173ace9d2 (MD5) Previous issue date: 2009-12-14 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Cient?fico e Tecnol?gico / Visceral leishmaniosis caused by Leishmania chagasi, also known as calazar, presented, in the period from 1990 to 2005, tax of incidence in Brazil varying between 1 and 3 cases for 100 000 inhabitants. The Northeast region that up to the year of 2000 contributed with almost 90% of the registered cases is reducing his participation in the current decade, reaching 56% in 2005. Conventional leishmaniasis treatment is costly and it shows high toxicity, demanding more research for alternative treatments, with special interest in development of vaccines and diagnosis kits which include production of recombinant antigens by host cells. Escherichia coli has been the microorganism most studied and used as a host for recombinant protein production. Therefore, the aim of this work was to study the influence of induction on cellular growth and to verify the type of Leishmania chagasi antigens expression (intra or extracellular) during two recombinant E. coli clones (kmp11 and P36) cultivation in rotary incubator (shaker) using three different media (2xTY, TB, FASS+EL). For that, tests were carried out using conditions established in the literature for E. coli (37?C and 200 rpm) and media supplemented with antibiotics to guarantee that only competent cells grows. First, tests were carried out without induction in order to verify the two microorganisms kinetic behavior (growth and substrate consumption) in different media. Next, the induction was carried out through the addition of IPTG (1mM as final concentration), at the first hour of cultivation. It was observed that protein expression were intracellular for all clones and media tested, however the highest level of expression was clearly observed by the electrophoresis band density (intensity) for 2xTY medium and kmp11 protein. Although it contains the lowest substrate concentration, consequently, a reduced cellular concentration when compared to other media, it appeared that this medium and clone combination is the most indicated for recombinant protein production. Therefore, the objective of this work was achieved, since the interested proteins were produced. Consequently, this result motivates new studies for production optimization using different cultivation strategies / A leishmaniose visceral, causada pela esp?cie Leishmania chagasi, tamb?m conhecida como calazar, apresentou, no per?odo de 1990 a 2005, taxa de incid?ncia no Brasil variando entre 1 e 3 casos por 100 mil habitantes. A regi?o Nordeste, que at? o ano de 2000 contribuiu com quase 90% dos casos registrados, est? reduzindo sua participa??o na d?cada atual, chegando a 56% em 2005. O alto custo e toxicidade das drogas usadas no tratamento convencional dessa leishmaniose levaram a busca de tratamentos alternativos, com interesse especial na pesquisa e produ??o de ant?genos por microrganismos recombinantes para desenvolvimento de vacinas e kits de diagn?stico. A bact?ria Escherichia coli tem sido o microrganismo mais estudado e usado como hospedeiro para produ??o de prote?nas recombinantes. Nesse contexto, este trabalho tem como objetivo estudar a influ?ncia da indu??o no crescimento celular e a verifica??o do tipo de express?o (intra ou extracelular) de ant?genos de Leishmania chagasi atrav?s de cultivo de dois clones de E. coli recombinante (kmp11 e P36) em incubador rotativo (shaker) usando tr?s meios diferentes (2xTY, TB, FASS+EL). Para isso, foram realizados ensaios em condi??es estabelecidas na literatura para E. coli (37?C ? 200 rpm) e os meios suplementados com antibi?ticos para garantir somente o crescimento de c?lulas competentes. Na primeira etapa, foram realizados ensaios sem indu??o a fim de se verificar o comportamento cin?tico dos dois clones (crescimento e consumo de substrato) nos diferentes meios. Na segunda etapa, a indu??o foi realizada atrav?s da adi??o de IPTG (concentra??o final de 1mM), na primeira hora de cultivo. Foi observada que a express?o das prote?nas foi intracelular para todos os clones e meios testados, entretanto o maior n?vel foi verificado nitidamente pela densidade (intensidade) da banda nos g?is de eletroforese para o meio 2xTY e prote?na kmp11. Apesar de o meio 2xTY conter uma menor concentra??o de substratos, conseq?entemente, uma concentra??o celular reduzida quando comparada aos outros meios, pareceu que esta combina??o de meio e clone ? mais indicada para produ??o das prote?nas recombinantes testadas neste trabalho. O objetivo desse trabalho foi alcan?ado j? que a prote?na de interesse foi produzida. Conseq?entemente, este resultado motiva novos estudos para otimiza??o da produ??o usando diferentes estrat?gias de cultivo

Made available in DSpace on 2014-07-29T15:13:53Z (GMT). No. of bitstreams: 1 TeseEdiane_Batista.pdf: 714564 bytes, checksum: 03efd3ac163525d9d401336bdd75356e (MD5) Previous issue date: 2008-08-05 / Several aspects of the bovine tuberculosis were analyzed in this study. The immunogenicity of recombinant MPT-51 (rMPT-51), Ag-85 and M. bovis-BCG were characterized in an immunosorbent assay, where 208 serum samples from positive intradermal tuberculin test (ITT) animals and 54 serum samples from ITT negative animals where analyzed. M. bovis-BCG and Ag-85 were strongly recognized by antibodies from naturally infected cattle. Additionally, the clinical status of the animals were correlated with the ITT positivity, with the specific production of IL-4 by TCD4 and TCD8 positive lymphocytes, and with nitric oxide (NO) production by macrophages from naturally tuberculosis infected bovine peripheral blood. ITT positive animals showed TCD4+IL4+ cells specific to M. bovis-BCG extract. High background levels of TCD8+IL-4+ lymphocytes were observed in ITT positive animals independent of the stimuli. When cell cultures where stimulated with M. bovis-BCG protein extract, there was no observed difference in NO production between the groups. Naturally tuberculosis infected bovine presented TCD4+IL4+ cells specific for M. bovis- BCG and a preserved NO production. Finnally, the immunogenicity of rMPT-51 use as a proteic sub-unit vaccine was evaluated in BALB/c mice, with two different adjuvants, incomplete Freund and CpG DNA. For this, mice were immunized and challenged with M. tuberculosis. Immunization with rMPT-51 antigen and either adjuvant induced, in the lungs, a migration increase of TCD5+IFN + cells specific for rMPT-51, when compared to controls (P<0.05). rMPT-51 plus CpG DNA presented a better performance among the different vaccination schemes tested, in part due to the ability of stiulate TCD5+IFN + cells and hampering the bacterial load, thus preserving the functional integrity of challenged mice lungs / Nesta tese foram avaliados vários aspectos da tuberculose bovina e do Mycobacterium bovis. Primeiro caracterizou-se a imunogenicidade do MPT-51, Ag 85 e BCG em ensaio imunoenzimático, onde foram utilizadas 208 amostras de soro de animais TTI positivo e 54 amostras de bovinos negativos. O BCG-M. bovis e o Ag 85 foram fortemente reconhecidos pelos anticorpos dos bovinos naturalmente infectados. Segundo correlaciounou-se o estado clínico do animal à positividade ao teste intradérmico, com a produção específica de IL-4 por linfócitos TCD4+ e TCD8+ e a produção de óxido nítrico por macrófagos do sangue periférico de bovinos naturalmente infectados com tuberculose. Foi observado que os bovinos TTI positivos apresentaram células CD4+IL-4+ específicas para extrato protéico de M. bovis-BCG. Observaram-se altos níveis basais de linfócitos TCD8+IL-4+ independente de estímulos nos animais reatores. Quando as culturas foram estimuladas com extrato protéico de BCG, não houve diferença quanto à produção de NO. Os bovinos tuberculosos, naturalmente infectados, apresentaram células TCD4+IL4+ específicas para M. bovis-BCG, preservando a produção de NO pelos macrófagos. Finalmente, a imunogenicidade do MPT-51 como vacina de sub-unidade protéica foi avaliada em camundongos BALB/c, testando o MPT-51 com dois adjuvantes, o incompleto de Freund e o CpG DNA. Os camundongos foram imunizados e posteriormente desafiados com M. tuberculosis. No pulmão, a imunização com antígeno rMPT-51 a 20&#956;g/ml + adjuvantes de Freund Incompleto e CpG DNA induziu aumento da migração de células TCD5+IFN- + específicas para o MPT-51 para o local da infecção, quando comparados com o controle (p<0,05). O MPT-51+CpG DNA, apresentou melhor desempenho dentre os esquemas de vacinação adotados, devido a capacidade de estimular a produção de células TCD5+IFN- + e a diminuição da carga bacteriana, preservando assim a integridade funcional do pulmão dos camundongos, quando desafiados