Cette thèse présentait comme objectif mettre en évidence le potentiel apport de l’immuno-PCR dans le diagnostic des maladies infectieuses à travers 3 exemples. L’application de l’iPCR dans le diagnostic précoce de la fièvre Q aiguë via la détection des IgM Phase II anti Coxiella burnetii a permis de détecter 90% des sérums prélevés dans les 2 premières semaines après l’apparition des symptômes contre 55% détectés par PCR, 38% par ELISA et 35% par l’IF la technique de référence. De plus une spécificité de 92% a été retrouvée par iPCR, 100% par PCR et l’IF et 90% par ELISA. L’application de l’iPCR à la fièvre Q aiguë constitue un exemple d’application de la technique plus globalement pour tous types d’infections aiguës. D’autre part, dans le cadre de la mise au point d’un modèle expérimental murin d’infection à Tropheryma whipplei, l’iPCR a servi à mesurer la réponse immunitaire mucosale via la détection des IgA anti T. whipplei dans les selles de souris. Les résultats obtenus ont permis de confirmer le rôle de la bactérie comme agent de gastroentérite via entre autre la détection d’IgA anti T. whipplei dans les selles lorsque des atteintes intestinales étaient provoquées. Enfin l’’utilisation de l’iPCR pour la détection de l’antigène Y. pestis dans des dents anciennes a permis de confirmer Y. pestis comme agent étiologique de la peste noire dans 5 charniers à travers la France et l’Italie. Une sensibilité de 41% a été retrouvée par iPCR contre 32% par PCR et 10% par ELISA. Nos résultats suggèrent que la détection des antigènes et la détection de l’ADN du pathogène semblent être 2 approches complémentaires permettant de confirmer le rôle de Y. pestis dans les différentes pandémies de peste et de mettre fin aux controverses suscitées par la seule utilisation des techniques de biologie moléculaire.Globalement, les résultats que nous avons obtenus au cours de cette thèse démontrent le potentiel énorme de l’iPCR comme technique de détection des anticorps et d’antigènes dans le domaine des maladies infectieuses tant au niveau de la sensibilité de détection qu’au niveau de son adaptabilité à différentes applications. / The objective of this thesis was to highlight the potential contribution of immuno-PCR in the diagnosis of infectious disease through 3 examples of infection. The iPCR was adapted for the early diagnosis of acute Q fever by the detection of IgM anti phase II Coxiella burnetii in patient’s sera. The results that we obtained show that iPCR could allow an early diagnosis of acute Q fever since 90% of early sera of patients with acute Q fever collected during the 2 first weeks after the onset of symptoms are detected against 55% by PCR, 38% by ELISA and 35% by IFA the gold standard. In addition, a specificity of 92% was found by iPCR, 90% by ELISA and 100% by PCR and IF. Application of iPCR to the diagnosis of acute Q fever is an example of application of the technique more generally for all types of acute infections. In a second time, the use of iPCR for the detection of Yersinia pestis antigen in ancient teeth allowed a confirmation of its role as the etiologic agent of plague in five mass graves across France and Italy. A sensitivity of 41% was recovered by IPCR against 32% by PCR and 10% by ELISA. Our results suggest that antigen and DNA detection of pathogen in ancient samples are 2 complementary approaches allowing the confirmation of the role of Y. pestis in different plague pandemic. Finally, as part of the development of an experimental murine infection with Tropheryma whippleii, the iPCR was used to measure the mucosal immune response via the detection of IgA anti T. whippleii in mouse stools. The results have confirmed the role of the bacterium as an agent of gastroenteritis via the detection of IgA anti T. whipleii in the stool when intestinal damages were caused.Overall, the results that we obtained during my thesis demonstrate the enormous potential of iPCR as a diagnostic tool of infectious disease by the ultrasensitive detection of antigens and antibodies.

Les pneumopathies d'hypersensibilité sont des maladies respiratoires liées à l'inhalation répétée de substances antigéniques. Le diagnostic nécessite la présence d'un ensemble d'arguments cliniques, radiologiques, fonctionnels et immunologiques car les symptômes sont peu spécifiques. La mise en évidence d'immunoglobulines G (IgG) spécifiques des agents étiologiques est un élément essentiel dans la prise en charge diagnostique et thérapeutique. L'objectif de ce travail de thèse était d'identifier des protéines bactériennes et fongiques reconnues par les IgG des patients atteints de la maladie du poumon de fermier (PDF) et du poumon de mécanicien (FDM), et de produire ces protéines de façon recombinante afin de développer des tests sérologiques standardisés de type ELISA. Deux micro-organismes impliqués dans le PDF (Saccharopolyspora rectivirgula et Eurotium amstelodami, un Aspergillus), et un micro-organisme impliqué dans le PDM (Mycobacterium immunogenum) ont été étudiés. L'approche immunoprotéomique développée a permis de sélectionner les protéines d'intérêt, puis de produire les antigènes recombinants correspondants par génie génétique. Des sérums de patients PDF, PDM et de témoins exposés ont été recueillis dans le cadre de protocoles cliniques multicentriques. Les performances (sensibilité, spécificité, aire sous la courbe) des tests ELISA-IgG utilisant les antigènes recombinants produits ont été évaluées par l'analyse en courbe ROV (Receiver operating characteristics). A partir des trois micro-organismes étudiés, 71 protéines immuno-réactives ont été identifiées et 28 protéines recombinantes ont été produites et testées en ELISA. Pour le diagnostic du PDM, deux antigènes recombinants, la dihydrolipoyl déshydrogénase and Facyl-CoA déshydrogénase, étaient particulièrement performants avec une sensibilité de 90% lorsqu'ils étaient utilisés en combinaison. Pour le diagnostic du PDF, deux antigènes recombinants à'Aspergillus, la Glu/Leu/Phe/Val déshydrogénase et la glucose-6-phosphate isomérase, ont permis d'obtenir une sensibilité de 89% et une spécificité de 84%. L'utilisation de trois antigènes recombinants de S. rectivirgula,SRl¥A (protéine de fonction inconnue), SRI? (catalase) et SR22 (kétol acide réducto-isomérase), ont permis d'obtenir une sensibilité et spécificité optimales de 83% et 77%. Les protéines identifiées étaient majoritairement des protéines enzymatiques, dont certaines ont été mis en évidence comme facteurs de virulence dans d'autres pathologies. Des études complémentaires, sur des modèles animaux et sur des modèles cellulaires, devront être mennées pour explorer l'implication de ces protéines dans l'induction de la maladie. Ce travail a permis d'améliorer les connaissances sur les protéines bactériennes et fongiques reconnues par les anticorps des patients atteints de PDF et de PDM, de développer des antigènes recombinants, et de mettre au point des tests sérologiques standardisés et performants. Ces tests pourront faire l'objet d'une valorisation vers l'industrie. En effet, les sérologies pour le diagnostic des PHS sont des demandes courantes dans les laboratoires d'analyse médicale. / The hypersensitivity pneumonitis is a pulmonary disease caused by repetitive inhalation of antigens. The diagnosis requires clinical, radiological, functional and immunological features because of unspecific symptoms. The identification of specifie antibodies to causative antigens is an essential way for the diagnosis and therapeutic management.The aims of this thesis work were to identify bacterial and fungal immunogenic proteins specifie to patient with farmer's lung (FL) and machine operator's lung (MOL) diseases, to synthesize specifie recombinant antigens for the development of a standardized ELISA. Two microorganisms involved in FL (Saccharopolyspora rectivirgula and Eurotium amstelodami (Aspergillus sp)), and one involved in MOL had been srudied. The immunoproteomics approach has permit to select interesting proteins and to synthesize recombinant antigens by genomics techniques. The sera from FL patients (n=52), MOL patients (n=16) and sera from exposed control subjects were recruited. ELISA-IgG using recombinant antigens efficacies were evaluated by Receiver operating characteristics analysis (sensitivity, specifïcity, area under the curve).From the three srudied microorganisms, 71 immunogenic proteins were identified and 28 recombinant antigens were produced and tested by ELISA. For the MOL diagnosis, the recombinants dihydrolipoyl dehydrogenase and acyl-CoA dehydrogenase were useful with a sensitivity of 90% when used in combination. For the FL diagnosis, two recombinant proteins from Aspergillus, Glu/Leu/Phe/Val dehydrogenase and glucose-6-phosphate isomerase had a sensitivity of 89% and a specifïcity of 84%. A combination of the three recombinant antigens from S. rectivirgula, SRI FA (unknown function), SRI 7 (catalase) and SR22 (ketol acid reductoisomerase) allowed to obtain a sensitivity of 83% and a specificity of 77%. The immunogenic proteins were mainly enzymes, and some of these have been implicated in important functions for survival or the virulence of others pathogens. Further studies are required to determine the role of these proteins in immunological or virulence processes by animal and cellular model application. This present work has improved our knowledge about bacterial and fungal proteins recognized by FL and MOL patient's antibodies, and to develop useful standardized serological tests with new recombinant antigens. These tests could be exported to the health management in industry. Indeed, hypersensitivity pneumonitis serodiagnosis tests are common requests in medical analysis laboratories

La tuberculose (TB) est une maladie infectieuse causée par M. tuberculosis. En 2009, la mortalité était élevée avec 1,7 millions de décès enregistrés dans le monde. La co-infection par le VIH, notamment en Afrique, et les tuberculoses à bacilles multi-résistants aux antibiotiques, rendent la maîtrise de la pandémie encore plus complexe. Les tests actuels de diagnostic présentent des lacunes notamment en terme de sensibilité pour la microscopie qui est le test le plus utilisé, ou en terme de praticité, en ce qui concerne la culture qui est le test de référence. Le développement de nouveaux tests pour le diagnostic de la TB active représente un enjeu majeur de nos sociétés modernes. Les tests immunologiques, en particulier les tests sérologiques actuellement disponibles, présentent une alternative aux tests bactériologiques couramment utilisés mais leurs performances restent faibles. Pour cela, il est indispensable de cibler de nouveaux biomarqueurs pour développer un test efficace, sensible, rapide et peu onéreux. C'est dans de cadre que s'inscrit ce travail de thèse.Nous rapportons dans ce mémoire, la recherche de marqueurs innovants dans le cadre de la mise au point d'un test de diagnostic de la tuberculose. Nous avons ciblé plusieurs marqueurs protéiques (OmpATb, LipY, Rv0183, Rv1984c et Rv3452) et un marqueur glycolipide, le tréhalose-6,6'-dimycolate (TDM). Parmi ces candidats, plusieurs présentent de réelles performances sur le plan diagnostique. Parallèlement à cette étude, nous avons mis au point une technique de séparation des différentes formes de TDM. La séparation des différentes formes de TDM devrait permettre de déterminer de façon précise les fonctions de ces composants majeurs de la paroi de M. tuberculosis et d'évaluer leur potentiel en terme de diagnostic.Mots clés : tuberculose, sérodiagnostic, détection antigène, détection anticorps, enzymes lipolytiques, glycolipide. / Tuberculosis (TB) is an infectious disease caused by M. tuberculosis. In 2009, mortality was high with 1,7 million of recorded deaths in the world. The co-infection by the HIV, in particular in Africa, and tuberculosis with multi-resistant bacilli to antibiotics, make the control of pandemia more complex. The current tests of diagnosis present gaps, in particular, in term of sensitivity for microscopy, which is currently the used test, or in term of praticity, for the culture which is considered as the gold standard.The development of new tests for the diagnosis of TB active represents a major challenge of our modern societies. The immunological tests, in particular the serologic tests available, can present an alternative to the currently bacteriological tests. However, their performances are not sufficient. That's why, it is essential to target new biomarkers which permit to establish an effective, sensitive, fast and cheap test. It is in this context that my study takes place.We report in this memory, the research of innovating markers for the development of a diagnostic test of tuberculosis. We targeted several protenic markers (OmpATb, LipY, Rv0183, Rv1984c and for Rv3452) and a glycolipid marker, the trehalose-6,6'-dimycolate (TDM). Among these candidates, several shown good performances for active TB diagnosis. In parallel to this study, a technique of separation of the various forms of TDM was developed. The separation of the various forms of TDM will permit to study their role on the biological activities and evaluate their potential in term of diagnosis.Key words: tuberculosis, serodiagnostic, antigen detection, antibody detection, lipolytic enzymes, glycolipid.

Tableau d’honneur de la Faculté des études supérieures et postdoctorales, 2010-2011 / En raison de leur mode de vie et de leurs habitudes alimentaires, les Inuit sont probablement parmi les populations les plus exposées aux risques infectieux associés à la faune et à l'environnement. L'objectif principal de cette étude consistait à déterminer la séroprévalence de huit infections zoonotiques parmi la population du Nunavik. Les informations ont été recueillies à l'automne 2004 dans le cadre de l'Enquête sur la santé des Inuit du Nunavik ± Qanuippitaa ¿. Des prélèvements sanguins (n=917) ont été réalisés et analysés afin de vérifier la présence d'anticorps contre les micro-organismes à l'étude, soit Trichinella sp., Toxoplasma gondii, Toxocara canis, Echinococcus granulosus, Brucella sp., Coxiella burnetii, Leptospira sp. et Francisella tularensis. La présence des anticorps IgG a été détectée à l'aide de méthodes immunoenzymatiques (ELISA), à l'exception de F. tularensis, pour lequel un test d'agglutination en tube à été effectué. Des informations sociodémographiques ainsi que sur la pratique d'activités traditionnelles, l'environnement domestique et la nutrition ont été colligées par questionnaires et analysées à l'aide du test de khi carré dans le but de vérifier leur association avec les sérologies positives. Nos résultats montrent que 59,8% de la population inuite a été exposée à T. gondii, 3,9% à T. canis et 8,3% à E. granulosus. Pour les infections bactériennes, la séroprévalence était estimée à 5,9% pour Leptospira sp. et 18,9% pour F. tularensis. En contrepartie, les taux pour Trichinella sp., Brucella sp. et C. burnetii étaient inférieurs ou équivalents à 1,0% (n < 5). De manière générale, la séropositivité tend à augmenter avec l'âge. Les analyses multivariées révèlent que la séroprévalence était associée avec : l'âge et la résidence dans la région de l'Ungava pour F. tularensis; l'âge et la résidence dans la région de l'Hudson pour T. canis; le genre (femme), la scolarité et le nettoyage fréquent du réservoir d'eau domestique pour E. granulosus; l'âge, le genre (femme), la scolarité, l'exposition à de l'eau potable considérée ± plus à risque ¿, le nettoyage fréquent du réservoir d'eau domestique ainsi que la consommation de viande de phoque et de gibier à plumes pour T. gondii. Aucun facteur de risque précis n'était associé à la séropositivité pour Leptospira sp. À l'exception de T. gondii, aucune autre association n'a été décelée lorsque les données de séroprévalence étaient croisées avec les variables reliées à l'alimentation et à l'exposition environnementale. Cette étude est complétée par des entrevues qualitatives, réalisées à l'été 2006 afin de mieux comprendre les mécanismes impliqués dans l'exposition aux facteurs de risque et dans la prévention des infections zoonotiques au Nunavik.

La mucoviscidose est la maladie génétique la plus fréquente dans la population caucasienne. Le genre Scedosporium se situe au deuxième rang parmi les champignons filamenteux isolés des expectorations dans ce contexte. Au niveau pulmonaire, les colonisations/infections entraînent le recrutement de phagocytes qui induisent un stress oxydatif normalement délétère pour les pathogènes. Pour se défendre, ceux-ci ont développé des systèmes antioxydants, notamment diverses enzymes. Ce travail de thèse visait à étudier la réponse au stress oxydatif chez Scedosporium. Tout d’abord, la capacité à germer en présence d’oxydants a été évaluée. Par la suite, trente-trois gènes potentiellement impliqués dans la défense contre le stress oxydatif ont été identifiés. Leur expression en présence d’oxydants et en co-cultures avec des phagocytes suggère un rôle majeur, notamment pour une catalase, une peroxyrédoxine et deux thiorédoxine réductases. Par ailleurs, un mutant défectif pour un gène codant une superoxyde dismutase (SOD) pariétale et spécifique des spores a été produit. L’auranofin, un inhibiteur des thiorédoxine réductases, présente une activité vis-à-vis des Scedosporium et un effet additif avec des triazolés. Un test ELISA a été développé pour le sérodiagnostic des scédosporioses, utilisant une catalase et une Cu/Zn-SOD recombinantes. Ce test sensible et spécifique permet de distinguer les infections à Scedosporium de celles à Aspergillus fumigatus et des colonisations à Scedosporium. Au final, ces résultats indiquent un rôle majeur des enzymes antioxydantes chez Scedosporium, qui pourraient être de véritables facteurs de virulence et donc de nouvelles cibles thérapeutiques. / Cystic fibrosis (CF) is the most common genetic disease in Caucasian populations. The Scedosporium genus ranks the second among the filamentous fungi colonizing the airways of CF patients. In the respiratory tract, colonizations/infections lead to the recruitment of phagocytes which produce an oxidative stress, usually deleterious for pathogens. To defend themselves, pathogens have developed protective antioxidant systems, especially various enzymes. This thesis aimed to study the oxidative stress response in Scedosporium species. First, capacity of several Scedosporium isolates to germinate upon oxidative stress conditions was evaluated. Then, thirty-three genes potentially involved in protection against the oxidative stress were identified. Their overexpression in response to oxidants and in co-cultures with phagocytes suggested a crucial role, especially for one catalase, one peroxiredoxin and the two thioredoxin reductases. A mutant defective for the gene encoding a superoxide dismutase (SOD) anchored to the cell wall and specific for the conidia was produced. Auranofin, a thioredoxin reductase inhibitor, exhibits little anti-Scedosporium activity and an additive effect with triazole drugs. An ELISA was developed for serodiagnosis of scedosporiosis, using recombinant proteins derived from one catalase and a Cu/Zn-SOD. This sensitive and specific assay allows to differentiate Scedosporium infections from Aspergillus fumigatus infections and Scedosporium colonizations. Finally, these results indicate a crucial role of antioxidant enzymes in Scedosporium species, which could therefore be considered as virulence factors and as possible new therapeutic targets.