L’immunité humorale, que les lymphocytes B chapeautent via la production d’anticorps, fournit à l’organisme des armes solubles et spécifiques permettant de combattre une infection en cours, et d’en conserver une mémoire immunologique. Traditionnellement, on associe la réponse des lymphocytes B naïfs à la première apparition d’un antigène et celle des cellules mémoires à l’apparition subséquente d’un antigène déjà rencontré. Ces deux sous-populations, pouvant être distinguées par l’expression différentielle de la molécule CD27, circulent simultanément en périphérie chez l’humain. Au cours de ce projet de doctorat, la réponse in vitro des lymphocytes B naïfs (CD27) et mémoires (CD27+) isolés du sang a été étudiée, dans un système exploitant l’interaction CD40-CD154, normalement médiée par les lymphocytes T, en présence de facteurs solubles. Cette étude a mis en évidence la réponse distincte des cellules naïves et mémoires lorsque stimulées séparément, reflétant la disparité de leurs besoins. La comparaison de leur stimulation simultanée ou séparée a mis au jour une possible interaction entre les cellules B naïves et mémoires, suggérant une vision nouvelle de l’initiation de la réponse primaire in vivo. De plus, cette étude a permis l’identification d’une sous-population de cellules mémoires distinctes en périphérie, au phénotype CD27-IgG+, remettant en question l’utilisation du CD27 comme marqueur de cellules B mémoires chez l’humain. La comparaison des populations stimulées suggère qu’un rôle régulateur pourrait être associé à ces cellules mémoires, pouvant contribuer à contenir la réponse des cellules naïves une fois l’infection prise en charge. En bout de ligne, ce projet a permis de modéliser la réponse humorale primaire et secondaire en tenant compte de cette nouvelle sous-population mémoire, ainsi que des interactions entre cellules B pouvant intervenir in vivo. / Humoral immunity, managed by B lymphocytes and their antibody production, provides to the body soluble and specific weapons to clear current infections and to preserve an immunological memory. Traditionally, naive B cell response is associated with the first encounter with an antigen, while memory cell response is related to its subsequent appearance. Both populations, circulating in human peripheral blood, can be distinguished by the differential expression of the CD27 molecule. During this project, the in vitro response of peripheral naive (CD27) and memory B cells (CD27+) was studied, in a system exploiting CD40-CD154 interaction, normally provided by T cells, in the presence of soluble factors. This study highlighted a distinct response from naive and memory cells when separately stimulated, reflecting their different requirements. Comparison between their stimulation, together and separately, also underlined possible B-B cell interactions, suggesting a new vision of primary response initiation in vivo. Furthermore, this study conducted to the identification of a distinct memory cell subset in periphery, displaying a CD27IgG+ phenotype, which questions the use of CD27 as a memory B cell marker in humans. A potential regulatory role has also been suggested for the CD27-IgG+ memory subset, presumably aimed to suppress naive cell response once the infection is controlled. Overall, this project supports the elaboration of a model for primary and secondary humoral responses, taking into account the new memory subset identified and the interactions among B cells that likely occur in vivo.

Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Lorsque le lymphocyte B entre en contact avec son antigène, plusieurs interactions sont essentielles. Parmi celles-ci, l'engagement de son récepteur CD40 avec le ligand CD154 d'un lymphocyte T activé est primordial. Des études réalisées in vitro ont démontré que l'intensité et la durée de l'interaction CD40-CD154 entraînent différentiellement l'évolution des lymphocytes B matures naïfs et à mémoire. En conséquence, une source de CD 154 soluble pour stimuler les lymphocytes B a été utilisée dans le but de vérifier comment la modulation de l'interaction modifiait les caractéristiques des populations de lymphocytes B par la transmission intracellulaire du signal, de CD40 au noyau. Les résultats obtenus lors de cette étude suggèrent que certaines voies de signalisation, principalement de la famille des MAPK soit, ERK.1/2 et p38, pourraient être empruntées différemment lors de la liaison de CD40 avec CD154. L'activation modulée des voies de signalisation pourrait participer à la régulation de la réponse immunitaire.

Les populations CD19+CD27+ et CD19+CD27+ de lymphocytes B cultivées dans le système CD40-CD154 évoluent différemment selon l'intensité de cette interaction. Les cellules CD27+ prolifèrent bien en présence d'une forte interaction CD40-CD154 lorsqu'elles sont cultivées seules, mais disparaissent lorsque les cellules CD27" sont présentes. Des facteurs solubles ou des interactions membranaires pourraient être la cause de l'évolution différente des populations. L'étude des facteurs solubles a démontré qu'ils n'étaient pas la cause du changement d'équilibre des populations. Ils avaient une certaine influence, mais ne pouvaient pas à eux seuls changer cette évolution. Ce qui suggérait que les interactions membranaires entre les cellules étaient impliquées. En effet, certains marqueurs de surface, comme CD54, CD38 et CD70, étaient différemment exprimés au sein des populations CD27" et CD27+ . Par conséquent, CD70, le ligand de CD27, devenait un acteur intéressant. Effectivement, lorsque l'interaction CD70-CD27 était bloquée, la prolifération était ralentie et les cellules CD27+ étaient maintenues en plus grande proportion. L'interaction CD27- CD70 pourrait donc avoir un rôle dans l'évolution des populations de lymphocytes B suite à leur activation via CD40.

Des anticorps monoclonaux, dirigés contre l'antigène de surface du virus de l'hépatite B (HBsAg) ont été obtenus par fusion de lymphocytes de souris immunisées avec de l'antigène purifié par chromatographie d'affinité et des cellules de myélome de souris (Sp2/0) maintenues en culture exponentielle. Le dépistage des clones sécréteurs a été effectué par RIA en phase liquide. Pour chaque fusion, nous avons obtenu entre 10 et 20% de clones sécréteurs. La sélection a été effectuée d'après le titre de l'anticorps sécrété dans le surnageant de culture. Les hydrides intéressants ont été clonés par dilution limite. Parmi le souches obtenues, deux ont été sélectionnées comme composantes d'une trousse de dépistage. Ces anticorps sont dirigés contre le déterminant commun "a" de l'HBsAg. Le seuil de sensibilité de cette trousse, indépendamment du sous- type ("ad" et "ay") est de 0.06 ng./ml de sérum. Tous les échantillons trouvés positifs lors de 1'utilisation de réactifs commerciaux l'ont été aussi avec cette trousse. Par contre, nous avons trouvé parmi 1114 donneurs de sang un faux positif dû à la présence d'anticorps anti-immunoglobulines de souris. Cette reaction a pu être neutralisée par addition d'immunoglobulines de souris a l'anticorps révélateur. Des essais complémentaires sur les échantillons du "College of American Pathologist", démontrent que la trousse, mise au point avec des anticorps monoclonaux, est supérieure à celles utilisées dans les laboratoires inscrits à ce service. / Montréal Trigonix inc. 2018

Les anticorps plasmatiques de type HTLA constituent un problème fréquemment rencontré dans les laboratoires d'immunologie érythrocytaire. Leurs caractéristiques particulières rendent d'autant plus difficile l'établissement de méthodes permettant de les éliminer, augmentant le risque de camoufler un anticorps d'importance clinique significative. Des études ont démontré que l'utilisation du récepteur du complément de type 1 sous forme soluble pourrait potentiellement neutraliser un certain nombre de ces anticorps. Certains auteurs associent également ces anticorps à la sous-classe 4 des IgG. Diverses méthodes de depletion des HTLA basées sur ces observations ont été testées dans le but d'améliorer le typage de ces échantillons. Ces travaux ont démontré que l'utilisation de peptides synthétiques de CRI représentait un bon potentiel pour y parvenir. Des analyses en biologie moléculaire ont également été réalisées dans le but d'établir le profil du CRI d'échantillons Yka-, un antigène associé aux HTLA dont la base moléculaire est inconnue.

Récemment, des spécialistes en cancérologie ont identifié au sein des tumeurs une sous-population cellulaire réfractaire aux traitements de chimio et de radiothérapie. Les caractéristiques cellulaires propres à cette population avoisinent celles des cellules souches. Il semblerait qu'aussi peu que 100 de ces cellules souches retrouvées dans les tumeurs soient capables de réinitier un cancer in vivo. Plusieurs arguments supportent un modèle de cellules souches cancéreuses (CSC) responsable de l'initiation tumorale. Dans les cancers cérébraux, ces CSC expriment le marqueur membranaire de cellules souches neuronales CD133. Les traitements ciblant les tumeurs cérébrales demeurent peu efficaces en partie à cause de la résistance des CSC CD133(+) face à ces traitements. Le ciblage de ces CSC serait donc porteur d'espoir. Le marqueur CD133 permet l'isolation et l'enrichissement de la population de CSC retrouvée au sein des lignées cellulaires ou des tumeurs primaires cérébrales. À l'aide du marqueur CD133, les caractéristiques propres aux CSC peuvent être mieux définies permettant un traitement ciblé. Les tumeurs cérébrales ayant des niveaux d'expression élevés de CD133 sont hautement malignes et un des joueurs clés de l'invasion tissulaire est la métalloprotéinase membranaire de type 1 (MT1-MMP). La protéine MT1-MMP est une protéase capable de dégrader la matrice extracellulaire et d'activer d'autres protéases. Une autre protéine qui est surexprimée dans les gliomes hautement malins est la cyclooxygénase de type 2 (COX-2). L'enzyme COX-2 joue des rôles clés dans la biosynthèse de prostaglandines impliquées entre autres dans des conditions pathologiques en encourageant l'inflammation, la sudation, la douleur et la fièvre. Cependant, une activité constitutive de COX-2 est associée au maintien de la prolifération cellulaire et à la résistance à l'apoptose dans les tumeurs. Nous avons étudié l'expression des protéines MT1-MMP et COX-2 dans les CSC CD133(+) issues de tumeurs cérébrales. Les résultats obtenus montrent que les protéines COX-2 et MT1-MMP sont surexprimées dans les cellules CD133(+) enrichies d'une lignée cellulaire de tumeur cérébrale. La surexpression de ces deux protéines semble être régulée par un axe MT1-MMP/COX-2 dans les CSC CD133(+). En effet, MT1-MMP induit la surexpression de COX-2 dans les CSC CD133(+). Ce rôle de MT1-MMP dans les cascades signalétiques cellulaires nécessite une signalisation initiée via son domaine cytoplasmique. Nous avons aussi étudié la voie de signalisation qui régule l'axe MT1-MMP/COX-2 et avons découvert un rôle critique pour les facteurs de transcription de la famille de NF-кB. Ce nouvel axe pourrait être exploité dans l'optique d'une thérapie anti-cancer afin de diminuer le potentiel invasif des CSC CD133(+) et leur résistance aux traitements actuels. ______________________________________________________________________________ MOTS-CLÉS DE L’AUTEUR : Cellules souches cancéreuses, CD133, COX-2, MT1-MMP, Glioblastome.

L’asthme allergique est caractérisé par une inflammation, un remodelage bronchique et une hyperréactivité bronchique (HRB). L’infiltration de fibrocytes, précurseurs des cellules musculaires lisses (CML) et exprimant le CD34, participe à l’hyperplasie du muscle lisse, cause potentielle de l’HRB. Cependant, l’expression du CD34 sur les CML ainsi que son rôle dans leur contraction et la réactivité du système respiratoire (SR) n’ont jamais été étudiés. L’objectif principal de ce projet était d’étudier le rôle du CD34 sur la contractilité des CML et la réactivité du SR dans l’asthme. Une perte de réactivité a été observée chez les souris Cd34-/- dans un modèle d’asthme. Celle-ci n’est pas reliée à une différence de la capacité contractile des CML en l’absence du CD34. Elle semble plutôt influencée par une altération des éléments non-contractiles tels que la production de mucines. Bref, cette étude a permis d’étudier l’importance de l’expression du CD34 dans le développement de l’HRB. / Allergic asthma is a chronic pulmonary disorder characterized by airway inflammation, airway remodeling and airway hyperresponsiveness (AHR). Hyperplasia of smooth muscle cells (SMCs) (potential mechanism of AHR) is influenced by CD34+ fibrocytes, which are known as smooth muscle precursors. However, CD34 expression on SMCs and its role on SMCs contractility have never been studied. The principal aim of this thesis was to study the role of CD34 on SMCs contractility and airway reactivity in the context of allergic asthma. In a mouse model of allergic asthma, a loss of airway reactivity was observed in sensitized Cd34-/- mice, which was not caused by alterations in the contractile capacity of SMCs. Instead, non-contractile elements (such as mucin production) seemed to be involved in this phenotype. Briefly, this study shows the importance of CD34 expression in the development of AHR associated with asthma.

Des expériences préliminaires indiquent que le VIH-1 peut réduire la production virale d'une cellule infectée via l'attachement du virus a son récepteur cellulaire, le CD4. Afin de vérifier à un niveau plus moléculaire ces observations, nous avons introduit dans une variété de cellules T CD4+ un gène rapporteur, la luciférase. Ce dernier a été placé sous le contrôle des éléments régulateurs du VIH-1. Nous avons observé que la multimérisation du CD4 induit l'expression des gènes dépendants des éléments régulateurs du VIH-1. Cette multimérisation du récepteur CD4, obtenue par différentes méthodes (anti-CD4, VIH-1 inactifs et défectifs) induirait un signal qui serait médié par la protéine tyrosine kinase p56lck et éventuellement une protéine G. Ces résultats suggèrent que le VIH-1 aurait le potentiel de réguler de façon négative sa propre réplication. Ce phénomène favoriserait sa transmission en empêchant la mort prématurée de son hôte. / Québec Université Laval, Bibliothèque 2018 / Ottawa Bibliothèque nationale du Canada, Direction des acquisitions et des services bibliographiques 19 . --

Le système immunitaire est un des points clefs pour éradiquer le virus de l'immunodéficience humaine (VIH). Actuellement, la persistance du VIH dans les organes dits « réservoirs » reste un problème majeur de santé publique. Il a été montré que les centres germinatifs (GC) des organes lymphoïdes tels que la rate, les ganglions périphériques et mésentériques sont des lieux de réplication virale. La sous-population de LT CD8 qui exprime le récepteur de chimiokine CXCR5 est capable de migrer vers ces GC. Ainsi, cette population cellulaire requiert un intérêt majeur dans le contrôle du VIH au niveau des organes lymphoïdes tels que : la rate, les ganglions périphériques et mésentériques. Dans ce contexte, nos travaux ont pu montrer qu'au cours de l'infection par le virus de l'immunodéficience humaine (SIV) chez le modèle Rhésus macaque, les cellules T CD8 CXCR5+ sont capables de se localiser au niveau des organes lymphoïdes. Cependant, ces mêmes cellules ont une faible cytotoxicité (expression de granzymeB et perforine). Les LT CD8 CXCR5 ne sont donc pas capables d'éliminer efficacement le virus par la voie cytotoxique. / The immune system plays a key part in eradicating the human immunodeficiency virus (HIV). Nevertheless, the persistence of HIV in reservoir organs remains a major public health problem. The germinal centers (GCs) of lymphoid have been shown to be lusters of viral replication. Additionally, some CD8 T cells that express the chemokine receptor CXCR5 can migrate to GCs. Therefore, this specific cell population represents a major interest for the control of HIV in organs such as the spleen, peripheral and mesenteric lymph nodes. In this context, my work has shown that, in Macaque model, during SIV infection, the CD8 CXCR5+ T cells are indeed mainly localized in the lymphoid organs. However, these CD8 CXCR5+ T cells do not express high levels of cytotoxic molecules such as granzymB and perforin. Thus, there are not able to completely eliminate the virus.