Les protéines PentatricoPeptide-Repeats (PPR) représentent la plus grande famille de protéines de liaison à l’ARN connue. Elles sont caractérisées par la présence de motifs répétés en tandem d’environ 35 résidus ayant une structure hélice-tour-hélice. Depuis les premières études sur l’organisme modèle Arabidopsis thaliana, les protéines PPR ont aussi été découvertes chez d’autres espèces non-plantes, incluant les levures et l’humain. Cependant, la détection des protéines PPR en dehors des plantes est compliquée par le fait que les outils de recherche sont tous conçus pour les protéines de plantes. Récemment, une étude réalisée chez les levures a rapporté une méthode itérative semi-automatisée d’identification de PPR utilisant des profils Hidden Markov Models (HMM). Inspirés par cette approche, nous visons ici à développer une méthode complètement automatisée plus généralisable et sensible qui ne dépend pas du protéome de départ. Comme preuve de concept, nous avons choisi une espèce non reliée aux plantes possédant le plus grand nombre de protéines PPR en-dehors des plantes – le protiste marin unicellulaire Diplonema papillatum. Il s’agit d’un modèle émergent ayant reçu beaucoup d’intérêt pour l’excentricité de l’expression de son génome mitochondrial, pour lequel il a été suggéré que les protéines PPR jouent un rôle clé. Nous avons ici développé une approche itérative pour identifier et cataloguer les protéines PPR chez D. papillatum. Les fonctionnalités particulières de notre algorithme incluent l’inspection des intervalles de 30 à 40 résidus entre les motifs classiques déjà identifiés et l’utilisation des structures secondaires caractéristiques des motifs PPR pour valider les motifs candidats nouvellement identifiés. Au final, nous avons identifié près de 800 motifs PPR chez D.papillatum, dont plusieurs motifs « déviants » identifiés dans les espaces entre les motifs. La validation expérimentale des motifs candidats les plus prometteurs est en attente. / PentatricoPeptide-Repeat (PPR) proteins represent the largest family of RNA-binding proteins known. They are defined by containing tandemly arranged, ~35-residue long motifs assuming a helix-turn-helix structure, which are referred to as PPR motifs. Since the seminal studies undertaken in the model organism Arabidopsis, a few PPR proteins have been also discovered outside plants, including yeast and human. However, the detection of PPR proteins in non-plant eukaryotes is complicated by the fact that current search tools are tailored toward plants. Recently, a semi-automated method has been reported for identifying PPR motifs in yeast using iterative searches with profile Hidden Markov models (HMMs). Inspired by this work, we aimed to develop a fully automated, sensitive approach that can be used for detecting PPR proteins in any species, when using the corresponding proteome as input. For a proof of concept, we used a species that contains the largest number of PPR genes outside the plant kingdom –the unicellular protist Diplonema papillatum. This emerging model system has garnered much interest for the eccentricities of its mitochondrial gene expression, in which PPR proteins are posited to play a key role. Here, we have developed an iterative HMM-search method that comprehensively catalogues and classifies PPR motifs in D. papillatum. Particular features of our algorithm are that it inspects closely 30 to 40 residue-long intervals between readily identified (classical) motifs, makes use of the characteristic secondary structure of PPR motifs to validate newly detected candidate motifs. In total, we have identified around 800 PPR motifs in D. papillatum. Including several deviant candidates detected in ”gaps”. High ranking representatives of both classical and deviant motifs await experimental validation.

Notre laboratoire a récemment découvert un mode d’expression des gènes mitochondriaux inédit chez le protozoaire biflagellé Diplonema papillatum. Outre son ADNmt formé de centaines de chromosomes circulaires, ses gènes sont fragmentés. Le gène cox1 qui code pour la sous unité I de la cytochrome oxydase est formé de neuf modules portés par autant de chromosomes. L’ARNm de cox1 est obtenu par épissage en trans et il est également édité par insertion de six uridines entre deux modules. Notre projet de recherche a porté sur une étude globale des processus post-transcriptionnels du génome mitochondrial de diplonémides. Nous avons caractérisé la fragmentation de cox1 chez trois autres espèces appartenant aux deux genres du groupe de diplonémides à savoir : Diplonema ambulator, Diplonema sp. 2 et Rhynchopus euleeides. Le gène cox1 est fragmenté en neuf modules chez tous ces diplonémides mais les modules sont portés par des chromosomes de taille et de séquences différentes d’une espèce à l’autre. L’étude des différentes espèces a aussi montrée que l’édition par insertion de six uridines entre deux modules de l’ARNm de cox1 est commune aux diplonémides. Ainsi, la fragmentation des gènes et l’édition des ARN sont des caractères communs aux diplonémides. Une analyse des transcrits mitochondriaux de D. papillatum a permis de découvrir quatre autres gènes mitochondriaux édités, dont un code pour un ARN ribosomique. Donc, l'édition ne se limite pas aux ARNm. De plus, nous avons montré qu’il n’y a pas de motifs d’introns de groupe I, de groupe II, de type ARNt ou d’introns impliqués dans le splicéosome et pouvant être à l’origine de l’épissage des modules de cox1. Aucune complémentarité significative de séquence n’existe entre les régions flanquantes de deux modules voisins, ni de résidus conservés au sein d’une espèce ou à travers les espèces. Nous avons donc conclu que l’épissage en trans de cox1 chez les diplonémides fait intervenir un nouveau mécanisme impliquant des facteurs trans plutôt que cis. L’épissage et l’édition de cox1 sont dirigés probablement par des ARN guides, mais il est également possible que les facteurs trans soient des molécules protéiques ou d’ADN. Nous avons élucidé les processus de maturation des transcrits mitochondriaux de D. papillatum. Tous les transcrits subissent trois étapes coordonnées et précises, notamment la maturation des deux extrémités, l’épissage, la polyadénylation du module 3’ et dans certains cas l’édition. La maturation des extrémités 5’ et 3’ se fait parallèlement à l’épissage et donne lieu à trois types d’intermédiaires. Ainsi, un transcrit primaire avec une extrémité libre peut se lier à son voisin. Cet épissage se fait apparemment sans prioriser un certain ordre temporel alors que dans le cas des transcrits édités, l’édition précède l`épissage. Ces études donnant une vue globale de la maturation des transcrits mitochondriaux ouvrent la voie à des analyses fonctionnelles sur l’épissage et l’édition chez D. papillatum. Elles sont le fondement pour finalement élucider les mécanismes moléculaires de ces deux processus post-transcriptionnels de régulation dans ce système intriguant. / Our laboratory has recently discovered an unprecedented mode of expression of mitochondrial genes in D. papillatum, a biflagellate protozoan. In addition to its mtDNA formed of hundreds of circular chromosomes, genes are fragmented. For example, the cox1 gene which encodes the subunit one of the cytochrome oxidase complex, comprises nine modules carried by nine chromosomes. The cox1 mRNA is obtained by trans-splicing and is also edited by the insertion of six uridines between two modules. My thesis project focused on the study of post-transcriptional processes in diplonemid mitochondria. We characterized the fragmentation of cox1 in three other species belonging to two diplonemids genera: Diplonema ambulator, Diplonema sp. 2 and Rhynchopus euleeides. The cox1 gene is fragmented into nine modules in all species but the modules are carried by chromosomes of different size and sequences from one species to another. We have shown that there are no motifs for classical introns, including spliceosomal and archaeal introns, as well as introns of group I and II, that might be implicated in the trans-splicing of cox1 modules. No significant complementarity exists between the flanking regions of two neighboring modules, nor are any conserved residues within a species or across species. We therefore concluded that the trans-splicing of cox1 in diplonemids involves a novel mechanism implicating trans rather than cis-factors. Trans-splicing and editing of cox1 probably involve guide RNAs, but it is also possible that the trans-factors are proteins or DNA molecules. The study of different species has also shown that the insertion of six uridines between two cox1 modules in mRNA is a shared trait in these diplonemids. We discovered that four other mitochondrial genes are also edited in D. papillatum and that RNA editing is not limited to mRNA. So, fragmented genes and RNA editing are common characteristics of diplonemids. We elucidated D. papillatum’s mitochondrial transcript maturation steps. All transcripts undergo three coordinated and precise processes including end processing, trans-splicing and / or editing and polyadenylation. The processing of the 5 'and 3' ends gives rise to three kinds of maturation intermediates. A primary transcript with one free end can bind to its neighbor and trans-splicing occurs without directionality. In the case of edited transcripts, editing precedes trans-splicing. These studies have prepared the ground for functional studies of trans-splicing and RNA editing with the long term goal to elucidate the molecular mechanisms involved in post-transcriptional regulation in this intriguing system.

Notre laboratoire a récemment découvert un mode d’expression des gènes mitochondriaux inédit chez le protozoaire biflagellé Diplonema papillatum. Outre son ADNmt formé de centaines de chromosomes circulaires, ses gènes sont fragmentés. Le gène cox1 qui code pour la sous unité I de la cytochrome oxydase est formé de neuf modules portés par autant de chromosomes. L’ARNm de cox1 est obtenu par épissage en trans et il est également édité par insertion de six uridines entre deux modules. Notre projet de recherche a porté sur une étude globale des processus post-transcriptionnels du génome mitochondrial de diplonémides. Nous avons caractérisé la fragmentation de cox1 chez trois autres espèces appartenant aux deux genres du groupe de diplonémides à savoir : Diplonema ambulator, Diplonema sp. 2 et Rhynchopus euleeides. Le gène cox1 est fragmenté en neuf modules chez tous ces diplonémides mais les modules sont portés par des chromosomes de taille et de séquences différentes d’une espèce à l’autre. L’étude des différentes espèces a aussi montrée que l’édition par insertion de six uridines entre deux modules de l’ARNm de cox1 est commune aux diplonémides. Ainsi, la fragmentation des gènes et l’édition des ARN sont des caractères communs aux diplonémides. Une analyse des transcrits mitochondriaux de D. papillatum a permis de découvrir quatre autres gènes mitochondriaux édités, dont un code pour un ARN ribosomique. Donc, l'édition ne se limite pas aux ARNm. De plus, nous avons montré qu’il n’y a pas de motifs d’introns de groupe I, de groupe II, de type ARNt ou d’introns impliqués dans le splicéosome et pouvant être à l’origine de l’épissage des modules de cox1. Aucune complémentarité significative de séquence n’existe entre les régions flanquantes de deux modules voisins, ni de résidus conservés au sein d’une espèce ou à travers les espèces. Nous avons donc conclu que l’épissage en trans de cox1 chez les diplonémides fait intervenir un nouveau mécanisme impliquant des facteurs trans plutôt que cis. L’épissage et l’édition de cox1 sont dirigés probablement par des ARN guides, mais il est également possible que les facteurs trans soient des molécules protéiques ou d’ADN. Nous avons élucidé les processus de maturation des transcrits mitochondriaux de D. papillatum. Tous les transcrits subissent trois étapes coordonnées et précises, notamment la maturation des deux extrémités, l’épissage, la polyadénylation du module 3’ et dans certains cas l’édition. La maturation des extrémités 5’ et 3’ se fait parallèlement à l’épissage et donne lieu à trois types d’intermédiaires. Ainsi, un transcrit primaire avec une extrémité libre peut se lier à son voisin. Cet épissage se fait apparemment sans prioriser un certain ordre temporel alors que dans le cas des transcrits édités, l’édition précède l`épissage. Ces études donnant une vue globale de la maturation des transcrits mitochondriaux ouvrent la voie à des analyses fonctionnelles sur l’épissage et l’édition chez D. papillatum. Elles sont le fondement pour finalement élucider les mécanismes moléculaires de ces deux processus post-transcriptionnels de régulation dans ce système intriguant. / Our laboratory has recently discovered an unprecedented mode of expression of mitochondrial genes in D. papillatum, a biflagellate protozoan. In addition to its mtDNA formed of hundreds of circular chromosomes, genes are fragmented. For example, the cox1 gene which encodes the subunit one of the cytochrome oxidase complex, comprises nine modules carried by nine chromosomes. The cox1 mRNA is obtained by trans-splicing and is also edited by the insertion of six uridines between two modules. My thesis project focused on the study of post-transcriptional processes in diplonemid mitochondria. We characterized the fragmentation of cox1 in three other species belonging to two diplonemids genera: Diplonema ambulator, Diplonema sp. 2 and Rhynchopus euleeides. The cox1 gene is fragmented into nine modules in all species but the modules are carried by chromosomes of different size and sequences from one species to another. We have shown that there are no motifs for classical introns, including spliceosomal and archaeal introns, as well as introns of group I and II, that might be implicated in the trans-splicing of cox1 modules. No significant complementarity exists between the flanking regions of two neighboring modules, nor are any conserved residues within a species or across species. We therefore concluded that the trans-splicing of cox1 in diplonemids involves a novel mechanism implicating trans rather than cis-factors. Trans-splicing and editing of cox1 probably involve guide RNAs, but it is also possible that the trans-factors are proteins or DNA molecules. The study of different species has also shown that the insertion of six uridines between two cox1 modules in mRNA is a shared trait in these diplonemids. We discovered that four other mitochondrial genes are also edited in D. papillatum and that RNA editing is not limited to mRNA. So, fragmented genes and RNA editing are common characteristics of diplonemids. We elucidated D. papillatum’s mitochondrial transcript maturation steps. All transcripts undergo three coordinated and precise processes including end processing, trans-splicing and / or editing and polyadenylation. The processing of the 5 'and 3' ends gives rise to three kinds of maturation intermediates. A primary transcript with one free end can bind to its neighbor and trans-splicing occurs without directionality. In the case of edited transcripts, editing precedes trans-splicing. These studies have prepared the ground for functional studies of trans-splicing and RNA editing with the long term goal to elucidate the molecular mechanisms involved in post-transcriptional regulation in this intriguing system.