Introdução: Várias evidências em estudos de animais knockout sugerem a efetiva participação dos genes Fgf9-Fgfr2 no processo de determinação testicular. Animais XY knockout para os genes Fgf9 e Fgfr2 apresentam reversão sexual como consequência da alteração na cascata de eventos masculinizantes nas gônadas fetais. Até o momento, mutações inativadoras dos genes FGF9-FGFR2 não foram descritas em pacientes 46, XY portadores de disgenesia gonadal. Objetivos: Pesquisar a presença de mutações inativadoras nos genes FGF9 e FGFR2 em pacientes portadores de DDS 46,XY por anormalidades do desenvolvimento gonadal. Casuística e Métodos: Trinta e três pacientes com disgenesia gonadal 46, XY, 11 com a forma completa e 22 com a forma parcial. As regiões codificadoras dos genes FGF9 e FGFR2 de todos os pacientes foram amplificadas e sequenciadas. As investigações quanto a presença de deleções foram realizadas usando-se a técnica de MLPA (Multiplex ligation-dependent probe amplification). Resultados: Mutações ou deleções nos genes FGF9 não foram encontradas em nenhum dos pacientes estudados, apenas alguns polimorfismos previamente descritos. No gene FGFR2 não foram encontradas deleções. Uma nova variante não sinônima em heterozigose, c.1358 C>T (p.Ser453Leu), localizada no exon 10 do FGFR2 foi encontrada em duas irmãs com disgenesia gonadal parcial 46,XY. A mãe é portadora da variante alélica e o estudo de 147 indivíduos controles não identificou a presença desta variante. A análise da variante em sites de previsão, PolyPhen, SIFT e Mutation Taster indicou que a nova proteína FGFR2 é possivelmente danificada. Conclusões: Se esses resultados dos sites de previsão forem confirmados em estudos funcionais futuros a participação do gene FGFR2 na determinação gonadal masculina em humanos estará comprovada / Introduction: Several evidence in animal studies \"knockout\" suggest the effective participation of Fgf9-Fgfr2 genes in testicular determination process. Animals XY \"knockout\" for Fgf9 and Fgfr2 genes exhibit sex reversal as a result of the change in the cascade of masculinizing events in fetal gonads. To date, So far inactivating mutations of FGF9 and FGFR2 genes have not been described in 46,XY patients with gonadal dysgenesis. Objectives: To investigate the presence of inactivating mutations in the FGF9 and FGFR2 gene in patients with 46,XY DSD by gonadal abnormalities. Casuistic and Methods: Thirty-three patients with 46,XY gonadal dysgenesis, 11 with the full form and 22 with the partial form. The coding regions of FGF9 and FGFR2 genes of all patients were amplified and sequenced. Investigations on the presence of deletions were made using the MLPA technique (\"Multiplex ligation-dependent probe amplification\"). Results: Mutations or deletions in the FGF9 gene were not found in any of the patients studied, only a few polymorphisms previously described. FGFR2 gene deletions were not found. A new non-synonymous variant in heterozygosis, c.1358 C> T (p.Ser453Leu) located in exon 10 of FGFR2 was found in two sisters with 46,XY partial gonadal dysgenesis. The mother is a carrier of the variant allele and the study of 147 control subjects did not identify the presence of this variant. The analysis of the variant on prediction sites, \"PolyPhen\", \"SIFT\" and \"Mutation Taster\" indicated that the new FGFR2 protein is possibly damaged. Conclusions: If the results of the prediction sites are confirmed by future functional studies the participation of the FGFR2 gene in human male gonadal determination will be proven

Introdução: Pearlman e colaboradores relacionou a presença de mutações ativadoras no gene MAP3K1 com o desenvolvimento testicular anormal em pacientes com disgenesia gonadal 46,XY familial, embora os estudos em camundongos tenham demonstrado que o gene Map3k1 não é essencial para a determinação testicular. No desenvolvimento gonadal masculino, a ligação do MAP3K1 à proteína RHOA promove uma fosforilação normal de p38 e ERK1/2, o que determina um bloqueio da via da beta-catenina pela MAP3K4. Já no desenvolvimento feminino, ocorre uma hiper fosforilação de p38 e ERK1/2, o que determina a ativação da via da beta-catenina e o bloqueio da via de retroalimentação positiva do SOX9 e o desenvolvimento testicular. Objetivos: Pesquisar a presença de variantes alélicas do gene MAP3K1 em pacientes portadores de distúrbios do desenvolvimento sexual (1) 46,XY por anormalidades do desenvolvimento gonadal e avaliar a repercussão funcional das variantes identificadas. Casuística e Métodos: Quarenta e sete pacientes com disgenesia gonadal 46,XY (17 com a forma completa e 29 com a forma parcial) e uma paciente com DDS 46,XY de causa etiológica não conhecida foram estudados. As regiões codificadoras do gene MAP3K1 foram amplificadas e sequenciadas pelo método de Sanger ou painel customizado de genes-alvo associados ao DDS. Estudo in vitro utilizando o método de detecção colorimétrica In-Cell ELISA com anticorpos específicos para detecção de ERK1/2 e AKT, fosforilado e não fosforilado foi realizado em fibroblastos obtidos por biópsia de pele e mantidos em cultura celular de 3 indivíduos portadores de variantes no MAP3K1. A quantificação da fosforilação de p38 e ERK por ensaio de citometria em células linfoblastóides mutadas foram realizados em amostras de 4 indivíduos portadores de variantes no MAP3K1 em estudo realizado em colaboração. Imunohistoquímica com anticorpos anti Caspase-3 foram realizadas em tecidos gonadais parafinados das pacientes portadoras de variantes alélicas nos genes MAP3K1 e FGFR2. Resultados: Vinte e uma variantes alélicas, sete das quais ainda não descritas na literatura, foram identificadas no gene MAP3K1. Quatro novas variantes alélicas exônicas e não sinônimas (p.Leu639Pro, p.Leu447Trp, p.Thr657Arg e p.Cys691Arg) foram identificadas em heterozigose; todas foram classificadas como deletérias para a proteína nos estudos de predição \"in silico\", não foram identificadas em indivíduos controles brasileiros estudados e não estão descritas nos bancos de dados populacionais. A variante p.Leu639Pro foi identificada em duas irmãs com disgenesia gonadal 46,XY portadoras da variante p.Ser453Leu no gene FGFR2 identificada previamente. A variante intrônica c.834+1G >T identificada em heterozigose foi classificada como deletéria à proteína na análise no site de predição para alteração de \"splicing\". Os ensaios colorimétricos para detecção de ERK1/2 e AKT, fosforilado e não fosforilado foram inconclusivos. Os estudos in vitro de avaliação dos níveis de fosforilação de p38 e ERK evidenciaram uma maior fosforilação nas culturas celulares mutantes para o MAP3K1 quando comparado com a linhagem celular selvagem, resultado estatisticamente significativo ( p < 0,001) e que corrobora com os dados publicados previamente. A imunohistoquímica com anticorpos anti Caspase-3 mostrou uma maior marcação em células germinativas nos tecidos gonadais das pacientes portadoras das variantes no MAP3K1 e FGFR2 do que no tecido testicular normal, porém marcações foram identificadas também em células germinativas de tecidos testiculares de indivíduos com DDS 46,XY de outras etiologias. Conclusões: Os achados sugerem fortemente a participação das mutações identificadas no MAP3K1 na etiologia dos distúrbios do desenvolvimento sexual dos pacientes estudados. Porém, uma melhor compreensão dos mecanismos de participação da via MAPK nas redes gênicas de regulação do processo de determinação testicular humano ainda é necessário / Introduction: Pearlman et al. associated the presence of activating mutations in MAP3K1 gene with abnormal testicular development in patients with familial 46,XY gonadal dysgenesis, although studies in mice have shown that the Map3k1 gene is not essential for testicular determination. In male gonadal development, the binding of MAP3K1 to the RHOA protein promotes a normal phosphorylation of p38 and ERK1/2, and a blockade of the beta- catenin pathway is determined by MAP3K4. In the female development, hyperphosphorylation of p38 and ERK1/2 occurs. p38 and ERK1/2 hyperphosphorylated determine the activation of the beta-catenin pathway, the blockade of the positive feedback pathway of SOX9 and the testicular development. Objectives: To investigate the presence of allelic variants of the MAP3K1 gene in patients with 46,XY disorders of sex development (DSD) due to abnormalities of gonadal development and to evaluate the functional repercussion of the identified variants. Patients and Methods: Forty-seven patients with 46,XY gonadal dysgenesis (17 patients with complete form and 29 with partial form) and one patient with 46,XY DSD of unknown cause were studied. The MAP3K1 coding regions were amplified and sequenced by Sanger method or by custom panel of target genes associated with DSD. In-Cell ELISA assay with specific antibodies for the detection of phosphorylated and non-phosphorylated ERK1/2 and AKT was performed on fibroblasts obtained by skin biopsy and kept in cell culture of 3 individuals with MAP3K1 variants. Quantification of p38 and ERK phosphorylation by cytometric assay on mutated lymphoblastoid cells were performed on samples from 4 subjects with MAP3K1 variants in a collaborative study. Immunohistochemistry with anti-Caspase-3 antibodies were performed on paraffinembedded gonadal tissues of patients with MAP3K1 and FGFR2 allelic variants. Results: Twenty-one allelic variants, seven of them have not yet been described in the literature, were identified in the MAP3K1. Four novel exonic and non-synonymous allelic variants (p.Leu639Pro, p.Leu447Trp, p.Thr657Arg and p.Cys691Arg) were identified in heterozygous state; all of them were classified as deleterious in silico prediction sites; they were not identified in Brazilian control subjects and they were not described in the human genetic variation databases. The p.Leu639Pro variant was identified in two sisters with 46,XY gonadal dysgenesis carrying the previously identified FGFR2 variant (p Ser453Leu). The intronic c.834+1G > T variant identified in heterozygous state was classified as deleterious in the prediction sites. Colorimetric assays for the detection of phosphorylated and nonphosphorylated ERK1/2 and AKT were not significant. In vitro studies to evaluate p38 and ERK phosphorylation levels evidenced increased phosphorylation in the MAP3K1 mutant cells when compared to the wild type cells line; a statistically significant result (p < 0.001) that confirmed previously published data. The immunohistochemistry study with anti-Caspase-3 antibodies showed that the gonadal tissues of patients with MAP3K1 and FGFR2 variants exhibited more apoptotic germ ceIls than normal testicular tissue, but stained germ cells were also identified in the testicular tissues of the 46,XY DSD controls.Conclusions: These findings strongly suggest the participation of MAP3K1 mutations in the etiology of the testicular abnormalities of the 46,XY DSD patients of this study. However, a better understanding of the mechanisms of MAPK pathway in the gene regulatory networks of the human testicular determination process is still necessary

Introdução: Pearlman e colaboradores relacionou a presença de mutações ativadoras no gene MAP3K1 com o desenvolvimento testicular anormal em pacientes com disgenesia gonadal 46,XY familial, embora os estudos em camundongos tenham demonstrado que o gene Map3k1 não é essencial para a determinação testicular. No desenvolvimento gonadal masculino, a ligação do MAP3K1 à proteína RHOA promove uma fosforilação normal de p38 e ERK1/2, o que determina um bloqueio da via da beta-catenina pela MAP3K4. Já no desenvolvimento feminino, ocorre uma hiper fosforilação de p38 e ERK1/2, o que determina a ativação da via da beta-catenina e o bloqueio da via de retroalimentação positiva do SOX9 e o desenvolvimento testicular. Objetivos: Pesquisar a presença de variantes alélicas do gene MAP3K1 em pacientes portadores de distúrbios do desenvolvimento sexual (1) 46,XY por anormalidades do desenvolvimento gonadal e avaliar a repercussão funcional das variantes identificadas. Casuística e Métodos: Quarenta e sete pacientes com disgenesia gonadal 46,XY (17 com a forma completa e 29 com a forma parcial) e uma paciente com DDS 46,XY de causa etiológica não conhecida foram estudados. As regiões codificadoras do gene MAP3K1 foram amplificadas e sequenciadas pelo método de Sanger ou painel customizado de genes-alvo associados ao DDS. Estudo in vitro utilizando o método de detecção colorimétrica In-Cell ELISA com anticorpos específicos para detecção de ERK1/2 e AKT, fosforilado e não fosforilado foi realizado em fibroblastos obtidos por biópsia de pele e mantidos em cultura celular de 3 indivíduos portadores de variantes no MAP3K1. A quantificação da fosforilação de p38 e ERK por ensaio de citometria em células linfoblastóides mutadas foram realizados em amostras de 4 indivíduos portadores de variantes no MAP3K1 em estudo realizado em colaboração. Imunohistoquímica com anticorpos anti Caspase-3 foram realizadas em tecidos gonadais parafinados das pacientes portadoras de variantes alélicas nos genes MAP3K1 e FGFR2. Resultados: Vinte e uma variantes alélicas, sete das quais ainda não descritas na literatura, foram identificadas no gene MAP3K1. Quatro novas variantes alélicas exônicas e não sinônimas (p.Leu639Pro, p.Leu447Trp, p.Thr657Arg e p.Cys691Arg) foram identificadas em heterozigose; todas foram classificadas como deletérias para a proteína nos estudos de predição \"in silico\", não foram identificadas em indivíduos controles brasileiros estudados e não estão descritas nos bancos de dados populacionais. A variante p.Leu639Pro foi identificada em duas irmãs com disgenesia gonadal 46,XY portadoras da variante p.Ser453Leu no gene FGFR2 identificada previamente. A variante intrônica c.834+1G >T identificada em heterozigose foi classificada como deletéria à proteína na análise no site de predição para alteração de \"splicing\". Os ensaios colorimétricos para detecção de ERK1/2 e AKT, fosforilado e não fosforilado foram inconclusivos. Os estudos in vitro de avaliação dos níveis de fosforilação de p38 e ERK evidenciaram uma maior fosforilação nas culturas celulares mutantes para o MAP3K1 quando comparado com a linhagem celular selvagem, resultado estatisticamente significativo ( p < 0,001) e que corrobora com os dados publicados previamente. A imunohistoquímica com anticorpos anti Caspase-3 mostrou uma maior marcação em células germinativas nos tecidos gonadais das pacientes portadoras das variantes no MAP3K1 e FGFR2 do que no tecido testicular normal, porém marcações foram identificadas também em células germinativas de tecidos testiculares de indivíduos com DDS 46,XY de outras etiologias. Conclusões: Os achados sugerem fortemente a participação das mutações identificadas no MAP3K1 na etiologia dos distúrbios do desenvolvimento sexual dos pacientes estudados. Porém, uma melhor compreensão dos mecanismos de participação da via MAPK nas redes gênicas de regulação do processo de determinação testicular humano ainda é necessário / Introduction: Pearlman et al. associated the presence of activating mutations in MAP3K1 gene with abnormal testicular development in patients with familial 46,XY gonadal dysgenesis, although studies in mice have shown that the Map3k1 gene is not essential for testicular determination. In male gonadal development, the binding of MAP3K1 to the RHOA protein promotes a normal phosphorylation of p38 and ERK1/2, and a blockade of the beta- catenin pathway is determined by MAP3K4. In the female development, hyperphosphorylation of p38 and ERK1/2 occurs. p38 and ERK1/2 hyperphosphorylated determine the activation of the beta-catenin pathway, the blockade of the positive feedback pathway of SOX9 and the testicular development. Objectives: To investigate the presence of allelic variants of the MAP3K1 gene in patients with 46,XY disorders of sex development (DSD) due to abnormalities of gonadal development and to evaluate the functional repercussion of the identified variants. Patients and Methods: Forty-seven patients with 46,XY gonadal dysgenesis (17 patients with complete form and 29 with partial form) and one patient with 46,XY DSD of unknown cause were studied. The MAP3K1 coding regions were amplified and sequenced by Sanger method or by custom panel of target genes associated with DSD. In-Cell ELISA assay with specific antibodies for the detection of phosphorylated and non-phosphorylated ERK1/2 and AKT was performed on fibroblasts obtained by skin biopsy and kept in cell culture of 3 individuals with MAP3K1 variants. Quantification of p38 and ERK phosphorylation by cytometric assay on mutated lymphoblastoid cells were performed on samples from 4 subjects with MAP3K1 variants in a collaborative study. Immunohistochemistry with anti-Caspase-3 antibodies were performed on paraffinembedded gonadal tissues of patients with MAP3K1 and FGFR2 allelic variants. Results: Twenty-one allelic variants, seven of them have not yet been described in the literature, were identified in the MAP3K1. Four novel exonic and non-synonymous allelic variants (p.Leu639Pro, p.Leu447Trp, p.Thr657Arg and p.Cys691Arg) were identified in heterozygous state; all of them were classified as deleterious in silico prediction sites; they were not identified in Brazilian control subjects and they were not described in the human genetic variation databases. The p.Leu639Pro variant was identified in two sisters with 46,XY gonadal dysgenesis carrying the previously identified FGFR2 variant (p Ser453Leu). The intronic c.834+1G > T variant identified in heterozygous state was classified as deleterious in the prediction sites. Colorimetric assays for the detection of phosphorylated and nonphosphorylated ERK1/2 and AKT were not significant. In vitro studies to evaluate p38 and ERK phosphorylation levels evidenced increased phosphorylation in the MAP3K1 mutant cells when compared to the wild type cells line; a statistically significant result (p < 0.001) that confirmed previously published data. The immunohistochemistry study with anti-Caspase-3 antibodies showed that the gonadal tissues of patients with MAP3K1 and FGFR2 variants exhibited more apoptotic germ ceIls than normal testicular tissue, but stained germ cells were also identified in the testicular tissues of the 46,XY DSD controls.Conclusions: These findings strongly suggest the participation of MAP3K1 mutations in the etiology of the testicular abnormalities of the 46,XY DSD patients of this study. However, a better understanding of the mechanisms of MAPK pathway in the gene regulatory networks of the human testicular determination process is still necessary