La O-manosilación de proteínas es una modificación postraduccional de gran relevancia en eucariotas. El α−distroglicano (α-DG), componente principal del complejo distrofina-glicoproteína en el músculo y células nerviosas, se encuentra altamente O-manosilado. Existe un grupo de distrofias neuromusculares hereditarias cuya base molecular subyacente es un déficit en la glicosilación del α−DG. Son las llamadas distroglicanopatias (DGPs), las cuales ofrecen a los pacientes una corta esperanza de vida y cuyos síntomas se extienden al cerebro, al músculo y a la retina. Estas enfermedades engloban, de mayor a menor gravedad, el síndrome de Walker-Warburg (WWS), la enfermedad de músculo-ojo-cerebro (MEB) y la distrofia muscular congénita de Fukuyama (FCMD), además de las distrofias musculares congénitas moderadas (MDC) y las distrofias musculares de cinturas (LGMD). Se conocen actualmente 18 genes asociados a DGPs, la mayoría de los cuales codifican el DG y enzimas implicadas directa o indirectamente en su O-glicosilación. En esta tesis doctoral se ha tratado de mejorar nuestra comprensión acerca de los genes y proteínas asociados a las DGPs mediante el abordaje de su expresión y función en un tejido frecuentemente afectado en estas enfermedades: la retina. En el capítulo 1 se resumen el estado actual del conocimiento acerca de estas enfermedades, la glicosilación del α−DG, y su papel en la estructura de la retina. Los capítulos siguientes comienzan cada uno con un breve resumen, y se desglosan individualmente en Introducción, Materiales y Métodos, Resultados y Discusión. El capítulo 2, titulado “Expresión de genes y proteínas asociados a distroglicanopatías en la retina de mamíferos” se centra en la detección de la expresión de los genes POMT1, POMT2, POMGNT1, FKTN, FKRP y LARGE, tanto a nivel de ARNm como de proteína en la retina neural de distintas especies de mamíferos utilizando técnicas de RT-PCR y Western blotting, y su perfil de distribución mediante técnicas de inmunohistoquímica. En el capítulo 3, titulado “POMGnT1 y POMGnT2: Dos N-acetilglucosaminil-transferasas de proteínas que actúan sobre un mismo substrato, el α-distroglicano”, se presenta una revisión de la información obtenida a partir de la literatura y bases de datos públicas, así como de análisis bioinformáticos realizados en este trabajo, sobre las proteínas POMGnT1 y POMGnT2. El conjunto de datos obtenido revela la existencia de una elevada homología entre las secuencias de aminoácidos de las proteínas humanas y sus ortólogas en las distintas especies del filo Cordados. Los integrantes de este taxón constituyen, así, un grupo monofilético para ambas proteínas, cada una de las cuales presumiblemente posee un ancestro común separado. En el capítulo 4, titulado “Alteraciones estructurales en la retina de un ratón KO condicional en el gen Pomt1, modelo de distroglicanopatías”, se exponen los resultados de un trabajo multidisciplinar realizado en estrecha colaboración con grupos de la Universidad Autónoma de Madrid y la Universidad de Alcalá. En nuestro grupo se han estudiado los cambios morfológicos y estructurales que tienen lugar en la retina de un ratón modelo de DGPs en el que el gen Pomt1 ha sido “noqueado” de forma condicional en este tejido. Los análisis llevados a cabo revelaron importantes alteraciones en la organización de la retina externa, incluidas las sinapsis establecidas entre los fotorreceptores y sus células postsinápticas, así como una reactividad aumentada de las células gliales en la retina interna. Finalmente, en el último capítulo se presentan a modo de sumario las conclusiones obtenidas del trabajo desarrollado en esta tesis doctoral.

Las distroglicanopatías (DGPs) constituyen un grupo heterogéneo de distrofias neuromusculares congénitas con herencia autosómica recesiva que afectan al músculo, cerebro y retina, y están originadas por deficiencias en la O-glicosilación del α-distroglicano (α-DG). Esta modificación postraduccional es esencial para el anclaje de las células musculares y nerviosas a la matriz extracelular, así como para la formación de las sinapsis en ‘cinta’ entre los fotorreceptores y las células bipolares y horizontales en la retina. Mutaciones en los genes POMT1, POMT2, POMGnT1, FKTN, FKRP y LARGE están asociadas a DGPs, originando una pérdida de función de las glicosiltransferasas que codifican y causando así una hipoglicosilación del α-DG. En esta Tesis Doctoral se demuestra que los genes POMT1, POMT2, POMGnT1, FKTN, FKRP y LARGE se expresan a nivel de ARNm mediante RT-PCR, y a nivel de proteína mediante Western blotting, en la retina neural ratón adulto y en fotorreceptores 661W en cultivo. Las proteínas codificadas por estos seis genes se localizan tanto en el citoplasma como en el núcleo de esta línea celular. Mediante microscopía confocal de inmunofluorescencia se ha determinado que POMT1, POMT2 y fukutina se localizan parcialmente en el retículo endoplásmico, mientras que POMGnT1 y FKRP están presentes en el aparato de Golgi de células 661W. En cuanto a LARGE, hemos observado que se encuentra disperso por todo el citoplasma, sin acumulación en ningún orgánulo en particular. Todas las proteínas estudiadas se acumulan en el núcleo de fotorreceptores 661W, aunque únicamente POMT1 y POMT2 se encuentran asociadas a las regiones de eucromatina, colocalizándose entre sí tanto en dicha fracción nuclear como en el citoplasma de estas células. También se ha demostrado en este trabajo mediante Western blotting que el factor de transcripción epigenético p38IP/FAM48A se expresa en la retina neural de ratón adulto y en la línea celular de fotorreceptores 661W, localizándose en la fracción nuclear. Esta proteína posee un dominio funcional denominado Spt20 y múltiples sitios potenciales de glicosilación y fosforilación, los cuales se encuentran muy conservados en todos los vertebrados analizados. En la retina de ratón p38IP/FAM48A se localiza en el núcleo de conos, células horizontales, bipolares, amacrinas y ganglionares, mientras que en el núcleo de las células 661W se localiza en la porción de eucromatina, donde se colocaliza con las proteínas POMT1 y POMT2. Dicho activador transcripcional interacciona físicamente con el heterodímero POMT1-POMT2 mediante su unión a la proteína POMT2. Estos resultados sugieren que dicho heterodímero podría ejercer una función como regulador indirecto de la expresión génica mediante la O-glicosilación de factores de transcripción y/o reguladores epigenéticos como p38IP/FAM48A en fotorreceptores de la línea 661W.