L'hématopoïèse est le processus de formation des cellules sanguines différenciées à partir de cellules souches hématopoïétiques. Ce processus est étroitement contrôlé par l'intégration de signaux de développementaux et homéostatiques pour assurer une production équilibrée des différents types de cellules sanguines. Au niveau moléculaire, la régulation de ce processus est médiée par un certain nombre de facteurs de transcription, en particulier par les membres de la famille RUNX. Ainsi, des mutations affectant les membres de cette famille peuvent entrainer une déréglementation du programme de différenciation hématopoïétique et causer des hémopathies, dont des leucémies. D'une manière intrigante, de nombreux régulateurs de la transcription et des voies de signalisation contrôlant le développement des cellules sanguines sont évolutivement conservés des humains à Drosophila melanogaster, qui est donc utilisée comme organisme modèle pour étudier les mécanismes sous-jacents à la spécification des lignages sanguins et au contrôle de l'homéostasie des cellules sanguines. Les membres de la famille Myeloid Leukemia Factor (MLF) ont été impliqués dans l'hématopoïèse et dans la transformation oncogénique des cellules sanguines, mais leur fonction et leur mécanisme d'action moléculaire restent insaisissables. Des travaux précédents chez la Drosophile ont montré que MLF stabilise le facteur de transcription de type RUNX Lozenge (LZ) et contrôle le nombre de cellules sanguines LZ+. Au cours de ma thèse, j'ai cherché à déchiffrer le mécanisme moléculaire d'action de MLF sur Lozenge dans les cellules sanguines. Par une approche protéomique puis par des expériences de co-immunoprécipitation dans les cellules de Drosophile Kc167, nous avons identifié le co-chaperon de type Hsp40 DnaJ-1, et son partenaire le chaperon Hsc70-4, comme deux partenaires de MLF. De façon importante, nous avons montré que l'inhibition de l'expression de DnaJ-1 ou de Hsc70-4 dans les cellules Kc167 induit une réduction du niveau de protéine Lozenge et une diminution de sa capacité à activer la transcription très semblable à celles observées suite à l'inhibition de l'expression de MLF. De plus, la sur-expression de mutants de DnaJ-1 incapables d'activer le chaperon Hsc70-4 entraîne aussi une réduction du niveau de Lozenge et de sa capacité de transactivation et des expériences de coimmunoprécipitation montrent que Lozenge interagit avec MLF, DnaJ-1 et Hsc70-4. Nos résultats suggèrent donc que MLF agit au sein d'un complexe chaperon composé de DnaJ-1 et Hsc70-4 pour contrôler le niveau de Lozenge. En utilisant différents mutants de MLF ou DnaJ-1, nous avons montré que MLF et DnaJ-1 interagissent ensemble et avec Lozenge via des domaines phylogénétiquement conservés. D'autre part, des expériences de GST " pull down " in vitro suggèrent que ces trois protéines peuvent interagir ensemble directement. Nous proposons donc que MLF et DnaJ-1 contrôlent le niveau de protéine Lozenge en interagissant avec elle et en favorisant son repliement et/ou sa solubilité via l'activité chaperon de Hsc70-4. En parallèle, nous avons étudié la fonction de DnaJ-1 in vivo dans le développement des cellules sanguines de la Drosophile. Nos résultats montrent que, comme mlf, la perte de dnaj-1 s'accompagne d'une augmentation de la taille et du nombre des cellules sanguines LZ+, ainsi que d'une hyperactivation de la voie de signalisation Notch dans ces cellules. Nos résultats suggèrent que des hauts niveaux de Lozenge sont nécessaires pour contrôler le nombre et la taille des cellules LZ+ et pour inhiber l'expression de Notch. Nous proposons que le complexe MLF/DnaJ-1 contrôle le développement du lignage LZ+ en régulant le niveau de protéine Lozenge, et ainsi le niveau d'activité de la voie Notch. En conclusion, nos résultats ont mis à jour un lien fonctionnel entre MLF, le co-chaperon de type Hsp40 DnaJ-1 et un facteur de transcription de type RUNX, qui pourrait être conservé dans d'autres espèces. / Hematopoiesis is the process of formation of fully differentiated blood cells from hematopoietic stem cells (HSCs). This process is tightly controlled by the integration of developmental and homeostatic signals to ensure the generation of an appropriate number of each blood cell type. At the molecular level, the regulation of this developmental process is mediated by a number of transcription factors, especially by members of the RUNX family, and mutations affecting these factors are at the origin of numerous hemopathies, including leukemia. Intriguingly, many transcriptional regulators and signaling pathways controlling blood cell development are evolutionarily conserved from humans to Drosophila melanogaster. Hence, the fruit fly has become a potent and simplified model to study the mechanisms underlying the specification of blood cell lineages and the regulation of blood cell homeostasis. Members of the Myeloid Leukemia Factor (MLF) family have been implicated in hematopoiesis and in oncogenic blood cell transformation, but their function and molecular mechanism of action remain elusive. Previous work in Drosophila showed that MLF stabilizes the RUNX transcription factor Lozenge (LZ) and controls the number of LZ+ blood cells. During my PhD, I sought to further decipher the molecular mechanism of action of MLF on Lozenge during blood cell development. Using a proteomic approach in Drosophila Kc167 cells, we identified the Hsp40 co-chaperone family member DnaJ-1 and its chaperone partner Hsc70-4 as two partners of MLF. These interactions were confirmed by co-immunoprecipitations and in vitro pull-down assays. Importantly, we found that knocking down DnaJ-1 or Hsc70-4 expression in Kc167 cells caused a reduction in the level of Lozenge protein and a concomitant decrease in Lozenge transactivation activity, which were very similar to those caused by MLF knock-down. Similarly, over-expression of two DnaJ-1 mutants that are unable to stimulate the chaperone activity of Hsc70-4 also decreased Lozenge level and impaired its capacity to activate transcription. These results suggest that MLF could act within a chaperone complex composed of DnaJ-1 and Hsc70-4 to control Lozenge stability and activity. Along that line, we showed by co-immunoprecipitation that Lozenge interacts with MLF, DnaJ-1 and Hsc70-4, respectively. Using various truncated mutants of MLF or DnaJ-1, we showed that MLF and DnaJ-1 interact and together with Lozenge through their conserved MLF homology domain (MHD) and C-terminal region, respectively. Furthermore, in vitro GST pull-down assays suggested that the interactions between MLF, DnaJ-1 and Lozenge are direct. Thus, we propose that MLF and DnaJ-1 control Lozenge protein level by interacting with it and by promoting its folding and/or solubility via the Hsc70 chaperone machinery. In parallel, we assessed DnaJ-1 function in Drosophila blood cells in vivo using a null allele of dnaj-1 generated by CRISPR/Cas9 technique. We found that, like mlf, dnaj-1 mutation leads to an increase in the number and size of LZ+ blood cells, as well as to an over-activation of the Notch signaling pathway in these cells. Moreover, our data suggested that high levels of active Lozenge are required to control the number and size of LZ+ blood cells, and to down-regulate Notch expression. We propose that the MLF/DnaJ-1 complex controls LZ+ blood cell development in vivo by regulating Lozenge protein level/activity and thereby Notch pathway activation. In sum, our results establish a functional link between MLF, the Hsp40 co-chaperone DnaJ-1 and the RUNX transcription factor Lozenge, which could be conserved in other species.

Type IV pili (T4P) systems are widely utilized among bacteria to power and direct surface motility. The production and secretion of a viscous polysaccharide to provide friction and resistance to the extended pilus structure is seen in several species of cyanobacteria including Nostoc punctiforme. The complex coregulation of polysaccharide secretion and T4P motor activity is not fully understood, although studies indicate a consistent relationship between functional motility and intact pathways of polysaccharide secretion and pilus extension in cyanobacteria. Using a combination of protein-protein interaction analysis, cytological studies, and comparative genomics this study proposes a theoretical mechanism for T4P motor influenced regulation of hormogonium polysaccharide secretion by a heat-shock protein (HSP) DnaK-type chaperone system in N. punctiforme. The results of this study indicate a tripartite HSP system consisting of DnaK1, DnaJ3, and coregulator GrpE is influenced by the activation of certain motor proteins in the T4P complex and are required for the production and secretion of hormogonium polysaccharide. Conservation of this system in Synechocystis sp. also implies a potential system that is conserved among all motile cyanobacteria for regulation of T4P.

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En 1977, Carl Woese sépare les procaryotes en deux grands groupes en proposant une nouvelle classification basée sur des critères phylogénétiques. Les Archaea deviennent ainsi un domaine à part entière aux cotés des Bacteria et des Eucarya. Depuis, la compréhension de ce nouveau groupe et de ses relations avec les deux autres domaines, essentielles pour comprendre l’évolution ancienne du vivant, est largement passée par l’étude de leur phylogénie. Presque 40 ans de recherche sur les archées ont permis de faire évoluer leur image : de bactéries vivant dans des milieux spécialisés, souvent extrêmes, on est passé à un domaine indépendant, très diversifié aussi bien génétiquement, métaboliquement ou encore écologiquement. Ces dernières années la barre symbolique de cent génomes complets d’archées séquencés a été franchie et, parallèlement, les projets génomiques et métagénomiques sur des groupes peu caractérisés ou de nouvelles lignées de haut rang taxonomique (e.g. Nanohaloarchaea, Thaumarchaeota, ARMAN, Aigarchaeota, groupe MGC, groupe II des Euryarchaeota, etc.) se sont multipliés. Tout ceci apporte un matériel sans précédent pour l’étude de l’histoire évolutive et de la diversité des Archaea. Les protéines ribosomiques ont été utilisées de façon courante pour inférer la position phylogénétique des nouvelles lignées d’Archaea. Néanmoins, les phylogénies résultantes ne sont pas complètement résolues, laissant des interrogations concernant d’importantes relations de parenté. La recherche de nouveaux marqueurs est donc cruciale et c’est dans ce contexte que mon projet de thèse s’inscrit. À partir de l’analyse des génomes de deux Thaumarchaeota et d’une Aigarchaeota, nous avons identifié 200 protéines conservées et bien représentées dans les différents phyla d’archées. Ces protéines sont impliquées dans de nombreux processus cellulaires, ce qui peut apporter un signal phylogénétique complémentaire à celui des marqueurs de type informationnel utilisés par le passé. En plus de confirmer la plupart des relations phylogénétiques inférées à partir de ces derniers (i.e., protéines ribosomiques et sous unités de l’ARN polymérase), l’analyse phylogénétique de ces nouveaux marqueurs apporte un signal permettant une meilleure résolution de la phylogénie des archées et la clarification de certaines relations jusqu’ici confuses. Un certain nombre de ces nouveaux marqueurs sont aussi présents chez les bactéries. Les relations entre les grands phyla d’archées restant encore non résolues, nous avons utilisé ces protéines pour essayer de placer la racine de l’arbre des Archaea en utilisant comme groupe extérieur les bactéries. Nous avons ainsi pu identifier 38 protéines, parmi les 200 sélectionnées précédemment, ayant un signal phylogénétique suffisamment fiable pour cette étude, auxquelles nous avons ajouté 32 protéines ribosomiques universelles. L’utilisation conjointe de ces données nous a permis de placer la racine entre les Euryarchaeota, d’une part, et un groupe rassemblant les Thaumarchaeota, les Aigarchaeota, les Korarchaeota et les Crenarchaeota, d’autre part. Ce nouvel éclairage sur l’évolution ancienne des archées nous a amené à proposer une révision de leur taxonomie avec, principalement, la création du nouveau phylum "Proteoarchaeota" contenant les quatre phyla actuels que nous proposons de rétrograder en classes : Thaumarchaea, Aigarchaea, Korarchaea et Crenarchaea.Finalement, l’analyse des protéines codées dans les trois génomes qui ont servi de point de départ de ma thèse nous a permis de générer une masse considérable de données qui ont révélé des traits particuliers ou encore des histoires évolutives inattendues. Un exemple est l’histoire du complexe formé par la chaperonne DnaK et de ses co-chaperonnes GrpE, DnaJ, et DnaJ-Fer chez les Thaumarchaeota, impliquant plusieurs transferts horizontaux entre les trois domaines du vivant. / In 1977, Carl Woese proposed a new classification of organisms based on phylogenetic criteria where he divided prokaryotes into two major groups. Thus, Archaea were defined as a new domain, together with Bacteria and Eucarya. Since then, the study of this group and its relationships with the two other domains, essential to understand the early evolution of Life, has been largely done through the investigation of its phylogeny. Almost 40 years of research on the archaea have led to a significant evolution of the knowledge on this group: from considering them as bacteria living in specialized environments, most often extreme ones, to defining them as an independent domain, highly diversified in genetic, metabolic and ecological terms. During the last years, the symbolic barrier of 100 complete archaeal genome sequences has been reached and, simultaneously, many genome projects from poorly-known groups or new high-rank lineages (e.g., Nanohaloarchaea, Thaumarchaeota, ARMAN, Aigarchaeota, MGC, group II Euryarchaeota, etc.) have been launched. All this provides unprecedented information to study the evolutionary history of Archaea. Ribosomal proteins have been used recurrently to infer the phylogenetic position of new archaeal lineages. Nevertheless, the resulting phylogenies are not fully resolved and several important nodes remain uncertain. The identification of new phylogenetic markers is therefore crucial. This represents the framework of my PhD thesis project. On the basis of the analysis of the genome sequences of two Thaumarchaeota and one Aigarchaeota, we have identified 200 conserved proteins well represented among the different archaeal phyla. These proteins are involved in a number of cellular functions, thus providing a phylogenetic signal complementary to the one obtained from the informational proteins (i.e., ribosomal proteins and RNA polymerase subunits). The phylogenetic analysis of these new markers has led to a better resolution of the archaeal phylogeny, including several relationships that remained unclear. Several of the new markers are also present in bacteria. Since the relationships among the different archaeal phyla are not yet resolved, we have used those markers to try to place the root of the archaeal phylogeny using the bacterial sequences as outgroup. We have identified 38 proteins among the 200 detected before containing a phylogenetic signal useful for that purpose, to which we have added 32 universal ribosomal proteins. The use of this complete dataset allowed us locating the root between the Euryarchaeota and a large group joining the Thaumarchaeota, Aigarchaeota, Korarchaeota and Crenarchaeota. This new result on the ancient evolutionary history of Archaea has led us to propose a taxonomic revision for this domain, in particular the erection of a new phylum "Proteoarchaeota", containing the current four phyla that we propose to retrograde into classes (Thaumarchaeales, Aigarchaeales, Korarchaeales and Crenarchaeales). Finally, the analysis of the proteins encoded by the three reference genomes at the origin of this work has generated a large amount of data, which reveals particular traits in certain organisms or unexpected evolutionary histories. One example concerns the evolution in Thaumarchaeota of the protein complex composed of the DnaK chaperon and its co-chaperons GrpE, DnaJ, and DnaJ-Fer, which involves several horizontal gene transfer events among the three domains of Life.

Mouse polyomavirus is a member and model virus of Polyomaviridae family. In order to infect cells and produce viral progeny, the viral chromosome must be transported to the nucleus. Several studies suggest that virions are transporeted to the endoplasmic reticulum, from which they are transferred to the cytosol with assistace of host proteins. Two of these proteins are the chaperon, BiP (binding immunoglobulin protein) and the cochaperone, DNAJ B14. Polyomaviruses probably enter the nucleus through nuclear pores with the assistence of importins. These processes were mainly studied with SV40. In this work, we show that MPyV infection induces a change in distribution of the DNAJ B14 protein, which became clustered into foci, where it co-localizes with the viral capsid protein, VP1. The occurrence of foci varies during infection. With use of proximity ligation assay, we have shown that during an early fase of MPyV infection, DNAJ B14 and BiP get in the close proximity with VP1. It is suggested that negatively charged amino acids at the N-terminus of the minor capsid protein, VP2, are required for targeting virions to translocon and proteins associated with ERAD. We created MPyV with VP2 mutated in these amino acids. The negatively charged amino acid at position 17 is not necessary for successful...

En 1977, Carl Woese sépare les procaryotes en deux grands groupes en proposant une nouvelle classification basée sur des critères phylogénétiques. Les Archaea deviennent ainsi un domaine à part entière aux cotés des Bacteria et des Eucarya. Depuis, la compréhension de ce nouveau groupe et de ses relations avec les deux autres domaines, essentielles pour comprendre l'évolution ancienne du vivant, est largement passée par l'étude de leur phylogénie. Presque 40 ans de recherche sur les archées ont permis de faire évoluer leur image : de bactéries vivant dans des milieux spécialisés, souvent extrêmes, on est passé à un domaine indépendant, très diversifié aussi bien génétiquement, métaboliquement ou encore écologiquement. Ces dernières années la barre symbolique de cent génomes complets d'archées séquencés a été franchie et, parallèlement, les projets génomiques et métagénomiques sur des groupes peu caractérisés ou de nouvelles lignées de haut rang taxonomique (e.g. Nanohaloarchaea, Thaumarchaeota, ARMAN, Aigarchaeota, groupe MGC, groupe II des Euryarchaeota, etc.) se sont multipliés. Tout ceci apporte un matériel sans précédent pour l'étude de l'histoire évolutive et de la diversité des Archaea. Les protéines ribosomiques ont été utilisées de façon courante pour inférer la position phylogénétique des nouvelles lignées d'Archaea. Néanmoins, les phylogénies résultantes ne sont pas complètement résolues, laissant des interrogations concernant d'importantes relations de parenté. La recherche de nouveaux marqueurs est donc cruciale et c'est dans ce contexte que mon projet de thèse s'inscrit. À partir de l'analyse des génomes de deux Thaumarchaeota et d'une Aigarchaeota, nous avons identifié 200 protéines conservées et bien représentées dans les différents phyla d'archées. Ces protéines sont impliquées dans de nombreux processus cellulaires, ce qui peut apporter un signal phylogénétique complémentaire à celui des marqueurs de type informationnel utilisés par le passé. En plus de confirmer la plupart des relations phylogénétiques inférées à partir de ces derniers (i.e., protéines ribosomiques et sous unités de l'ARN polymérase), l'analyse phylogénétique de ces nouveaux marqueurs apporte un signal permettant une meilleure résolution de la phylogénie des archées et la clarification de certaines relations jusqu'ici confuses. Un certain nombre de ces nouveaux marqueurs sont aussi présents chez les bactéries. Les relations entre les grands phyla d'archées restant encore non résolues, nous avons utilisé ces protéines pour essayer de placer la racine de l'arbre des Archaea en utilisant comme groupe extérieur les bactéries. Nous avons ainsi pu identifier 38 protéines, parmi les 200 sélectionnées précédemment, ayant un signal phylogénétique suffisamment fiable pour cette étude, auxquelles nous avons ajouté 32 protéines ribosomiques universelles. L'utilisation conjointe de ces données nous a permis de placer la racine entre les Euryarchaeota, d'une part, et un groupe rassemblant les Thaumarchaeota, les Aigarchaeota, les Korarchaeota et les Crenarchaeota, d'autre part. Ce nouvel éclairage sur l'évolution ancienne des archées nous a amené à proposer une révision de leur taxonomie avec, principalement, la création du nouveau phylum "Proteoarchaeota" contenant les quatre phyla actuels que nous proposons de rétrograder en classes : Thaumarchaea, Aigarchaea, Korarchaea et Crenarchaea.Finalement, l'analyse des protéines codées dans les trois génomes qui ont servi de point de départ de ma thèse nous a permis de générer une masse considérable de données qui ont révélé des traits particuliers ou encore des histoires évolutives inattendues. Un exemple est l'histoire du complexe formé par la chaperonne DnaK et de ses co-chaperonnes GrpE, DnaJ, et DnaJ-Fer chez les Thaumarchaeota, impliquant plusieurs transferts horizontaux entre les trois domaines du vivant.

The antimicrobial peptide (AMP) ARV-1502 was designed based on naturally occurring short proline-rich AMPs, including pyrrhocoricin and drosocin. Identification of chaperone DnaK as a therapeutic target in Escherichia coli triggered intense research on the ligand- DnaK-interactions using fluorescence polarization and X-ray crystallography to reveal the binding motif and characterize the influence of the chaperone on protein refolding activity, especially in stress situations. In continuation of this research, 182 analogs of ARV-1502 were designed by substituting residues involved in antimicrobial activity against Gramnegative pathogens. The peptides synthesized on solid-phase were examined for their binding to E. coli and S. aureus DnaK providing 15 analogs with improved binding characteristics for at least one DnaK. These 15 analogs were distinguished from the original sequence by their increased hydrophobicity parameters. Additionally, the influence of the entire DnaK chaperone system, including co-chaperones DnaJ and GrpE on refolding and ATPase activity, was investigated. The increasingly hydrophobic peptides showed a stronger inhibitory effect on the refolding activity of E. coli chaperones, reducing protein refolding by up to 64%. However, these more hydrophobic peptides had only a minor effect on the ATPase activity. The most dramatic changes on the ATPase activity involved peptides with aspartate substitutions. Interestingly, these peptides resulted in a 59% reduction of the ATPase activity in the E. coli chaperone system whereas they stimulated the ATPase activity in the S. aureus system up to 220%. Of particular note is the improvement of the antimicrobial activity against S. aureus from originally >128 μg/mL to as low as 16 μg/mL. Only a single analog exhibited improved activity over the original value of 8 μg/mL against E. coli. Overall, the various moderate-throughput screenings established here allowed identifying (un)favored substitutions on 1) DnaK binding, 2) the ATPase activity of DnaK, 3) the refolding activity of DnaK alone or together with co-chaperones, and 4) the antimicrobial activity against both E. coli and S. aureus.