Les pathologies intestinales sont des maladies multifactorielles dont l’incidence ne cesse d’augmenter. Les maladies organiques regroupent les maladies inflammatoires chroniques de l'intestin tel que la maladie de Crohn (MC) et les pathologies fonctionnelles digestives comprennent les différentes formes du syndrome de l'intestin irritable (SII). Ces pathologies présentes des caractéristiques communes comme des troubles du transit, des douleurs abdominales, un dysfonctionnement de la barrière intestinale et des modifications de la communication bidirectionnelle de l’axe intestin-cerveau et une altération de la composition du microbiote intestinal (dysbiose). Cette dernière peut être en partie associée à un déficit de production en peptides et protéines antimicrobiennes (PAMs) par les cellules de Paneth. Parmi les cibles thérapeutiques stratégiques, une réduction de la dysbiose dans le but de réduire l’état inflammatoire ou micro-inflammatoire de la muqueuse font aujourd’hui l’objet de différentes études. Ces traitements alternatifs montrent l’efficacité d’un régime nutritionnel adapté, d’un apport en probiotiques ou en prébiotiques sur le microbiote intestinal des patients MC et SII, et sur l’intégrité de leur barrière intestinale. Parmi les matrices alimentaires présentant une composition nutritionnelle intéressante proche du lait maternel humain, le lait d’ânesse (LA) contient également une forte teneur en PAMs (lysozyme). En parallèle, un observatoire économique et social de la filière asine commandité par l’Institut National Âne et Mulet fait le diagnostic d’une activité grandissante autour du LA chez les éleveurs français et montre, face à une concurrence italienne et chinoise importante, la nécessité d’une meilleure organisation de la filière via une meilleure valorisation du LA. L’objectif de cette thèse était d’évaluer un potentiel effet santé du LA et d’apporter des preuves scientifiques robustes pour permettre une meilleure valorisation de ce dernier. Ainsi, l’effet d’une consommation orale chronique de LA a été évalué sur deux modèles précliniques murins distincts : un modèle d’iléite expérimentale induite par une administration per os d’indométacine et un modèle de stress psychologique chronique (Water Avoidance Stress, WAS). Dans ce travail, le rôle clé de l’activité du lysozyme dans les effets observés a également été évalué. Des essais de traitements thermiques ont aussi été réalisés pour optimiser un barème de pasteurisation permettant de proposer un LA répondant aux normes réglementaires microbiologiques et sanitaires tout en conservant l’activité du lysozyme contenue dans le lait. Les travaux de cette thèse montrent que le LA possède des propriétés anti-inflammatoires se traduisant par une réduction significative des lésions inflammatoires macroscopiques et microscopiques de l’iléon. Cet effet est associé à une réduction de la dysbiose intestinale et normalise les niveaux de PAMs dans les cellules de Paneth drastiquement réduits lors de l’iléite. Dans le modèle WAS, le LA et la fraction contenant l’activité en lysozyme réduisent l’hypersensibilité viscérale, l’état micro-inflammatoire induites par le stress et restaurent les niveaux de PAMs dans les cellules de Paneth réduits par le stress. Un traitement thermique de 2 min/72°C permet d’augmenter la durée de vie du LA tout en conservant l’activité du lysozyme et ses propriétés santé sur la muqueuse intestinale chez la souris. / Gut pathologies are multifactorial with a constant increasing incidence. Organic diseases include inflammatory bowel diseases such as Crohn's disease (CD) and functional pathologies include various subtypes of irritable bowel syndrome (IBS). These pathologies present common features such as transit disorders, abdominal pain, dysfunction of the intestinal barrier associated with bidirectional gut-brain axis modifications and alterations of the gut microbiota composition (dysbiosis). Dysbiosis is generally associated with a lack of production of antimicrobial peptides and proteins (AMPs) by Paneth cells. Among the alternative treatment strategies, it has been proposed to reduce gut inflammation by correcting intestinal dysbiosis. Recent studies show the efficacy of a suitable diet, probiotics or prebiotics interventions on gut microbiota and on the integrity of their intestinal barrier in CD and IBS patients. Among interesting food matrices, donkey milk (DM) is a good candidate with a nutritional composition close to human breast milk and contains high levels of AMPs like lysozyme. An economic and social observatory of the donkey industry was ordered by the Institut National Âne et Mulet for a better support of growing French activity around DM against Italian and Chinese competitions. The objective of this thesis was to evaluate the potential beneficial healthy effect of DM and to provide robust scientific evidences for a better valorization of this product. Thus, the effect of chronic oral intake of DM was evaluated on two distinct murine preclinical models: a model of experimental ileitis induced by an oral administration of indomethacin and a model of chronic psychological stress (Water Avoidance Stress, WAS). In these studies, the key role of lysozyme activity in the observed effects was highlighted. In order to develop the DM market in France, thermal treatments have been carried out to optimize a pasteurization process to obtain a DM in accordance with the regulatory microbiological and sanitary standards while preserving the activity of the lysozyme contained in milk. The work of this thesis shows that DM exerts anti-inflammatory properties resulting in a significant reduction of the macroscopic and microscopic inflammatory lesions of the ileum. This effect is associated with a reduction of gut dysbiosis while normalizing the level of drastically reduced AMPs contained Paneth cells in the ileitis model. In the WAS model, DM and the fraction containing activity of lysozyme reduce visceral hypersensitivity, stress-induced gut microinflammatory status and also restore the level of AMPs in Paneth cells . A heat treatment at 2 min/72 °C allows to increase the shelf-life of DM while preserving the activity of lysozyme and its gut beneficial healthy properties in mouse.

<p>Млеко магарице је тек последњих година доспело у фокус научних истраживања, иако су његова благотоворна терапеутска и козметичка својства позната још од античких времена. Упркос томе што знање о функционалности млека магарице константно расте, његов антимикробни потенцијал остаје најмање истражен. Литературни подаци о микробиологији и евентуалној антимикробној активности млека магарице балканске расе која егзистира на подручју Србије и околних балканских земаља су јако лимитирани. Ово млеко се традиционално конзумира без претходне топлотне обраде, што покреће низ питања која се односе на здравствену безбедност конзумирања млека у сировом стању. Предмети истраживања ове докторске дисертације били су утврђивање микробиолошког квалитета сировог млека магарице балканске расе, као и испитивање његове антибактеријске активности према одабраним сојевима Escherichia coli, Salmonella Enteritidis, Salmonella Typhimurium, Staphylococcus aureus, Listeria monocytogenes и Klebsiella pneumoniae. У циљу утврђивања главних носилаца антибактеријског дејства, као и самог модела антибактеријског деловања, у одабраним узорцима овог млека намењеним извођењу антибактеријских испитивања, извршено је одређивање садржаја антимикробних протеина - лизозима и лактоферина, као и садржаја калцијума. У узорцима млека магарице предвиђеним за испитивање антибактеријске активности према S. aureus и L. monocytogenes, одређен је садржај масних киселина са документованом антибактеријском активношћу према Грам<br />позитивним бактеријама. Присуство L. monocytogenes и Salmonella spp. није утврђено ни у једном од 137 испитаних узорака сировог млека магарице, док је број E. coli, колиформних бактерија, Enterobacteriaceae, квасаца и плесни и суспектног B. cereus био испод границе детекције методе. Према резултатима добијеним у овој докторској дисертацији сви испитани узорци сировог млека магарице балканске расе су задовољавали захтеве европских регулатива 92/46/ЕЕC и EC 853/2004 и са микробиолошког аспекта су у потпуности били безбедни за директно конзумирање без претходне топлотне обраде. Сирово млеко магарице балканске расе је показало различиту антибактеријску активност према Грам позитивним и Грам негативним бактеријским сојевима тестираним у оквиру ове докторске дисертације, чији интензитет је зависио од нивоа контаминације узорака млека тестираним патогеном и температуре инкубирања. Температура инкубирања од +15 &deg;C је у односу на +9 &deg;C била генерално повољнија за активност антибактеријских супстанци у млеку магарице према свим тестираним патогенима, али је антибактеријски потенцијал узорака млека магарице на +15 &deg;C био лимитиран бржим умножавањем испитаних бактерија на овој температури. То је посебно важило за узорке са већим нивоима контаминације (103 и 104 cfu/ml). Антибактеријска активност сировог млека магарице према L. monocytogenes и S. aureus се нa свим радним температурама састојала од продужeња лаг фазе и инхибирања бактеријског раста, док се у случају S. Enteritidis, S. Typhimurium, E. coli АTCC 8739, E. coli АTCC 10536 и K. pneumoniae она огледала у редукцији њиховог почетног броја и/или продужењу лаг фазе. Резултати ове докторске дисертације су указали на калцијум зависну природу антибактеријске активности сировог млека магарице према S. Enteritidis, S. Typhimurium и оба тестирана соја E. coli. Најснажнију антибактеријску активност према K. pneumoniae показали су узорци млека магарице, који су поред великог садржаја лизозима имали и велики садржај лактоферина, па би у овом случају основни механизам антибактеријског деловања млека магарице могао бити синергизам лизозима и лактоферина. Лизозим је највероватније главни носилац антибактеријске активности млека магарице балканске расе, обзиром да је у односу на други антимикробни агенс &ndash; лактоферин у тестираним узорцима млека магарице детектован у вишеструко већој концентрацији. Известан допринос антибактеријској активности млека<br />магарице балканске расе према L. monocytogenes и S. aureus могле би да дају и масне киселине са документованим антибактеријским дејством према Грам позитивним бактеријама (линолна, лауринска и олеинска киселина), које су у анализираним узорцима млека магарице у збиру чиниле од 40,3 до 54,7% од укупних масних киселина.</p> / <p>Mleko magarice je tek poslednjih godina dospelo u fokus naučnih istraživanja, iako su njegova blagotovorna terapeutska i kozmetička svojstva poznata još od antičkih vremena. Uprkos tome što znanje o funkcionalnosti mleka magarice konstantno raste, njegov antimikrobni potencijal ostaje najmanje istražen. Literaturni podaci o mikrobiologiji i eventualnoj antimikrobnoj aktivnosti mleka magarice balkanske rase koja egzistira na području Srbije i okolnih balkanskih zemalja su jako limitirani. Ovo mleko se tradicionalno konzumira bez prethodne toplotne obrade, što pokreće niz pitanja koja se odnose na zdravstvenu bezbednost konzumiranja mleka u sirovom stanju. Predmeti istraživanja ove doktorske disertacije bili su utvrđivanje mikrobiološkog kvaliteta sirovog mleka magarice balkanske rase, kao i ispitivanje njegove antibakterijske aktivnosti prema odabranim sojevima Escherichia coli, Salmonella Enteritidis, Salmonella Typhimurium, Staphylococcus aureus, Listeria monocytogenes i Klebsiella pneumoniae. U cilju utvrđivanja glavnih nosilaca antibakterijskog dejstva, kao i samog modela antibakterijskog delovanja, u odabranim uzorcima ovog mleka namenjenim izvođenju antibakterijskih ispitivanja, izvršeno je određivanje sadržaja antimikrobnih proteina - lizozima i laktoferina, kao i sadržaja kalcijuma. U uzorcima mleka magarice predviđenim za ispitivanje antibakterijske aktivnosti prema S. aureus i L. monocytogenes, određen je sadržaj masnih kiselina sa dokumentovanom antibakterijskom aktivnošću prema Gram<br />pozitivnim bakterijama. Prisustvo L. monocytogenes i Salmonella spp. nije utvrđeno ni u jednom od 137 ispitanih uzoraka sirovog mleka magarice, dok je broj E. coli, koliformnih bakterija, Enterobacteriaceae, kvasaca i plesni i suspektnog B. cereus bio ispod granice detekcije metode. Prema rezultatima dobijenim u ovoj doktorskoj disertaciji svi ispitani uzorci sirovog mleka magarice balkanske rase su zadovoljavali zahteve evropskih regulativa 92/46/EEC i EC 853/2004 i sa mikrobiološkog aspekta su u potpunosti bili bezbedni za direktno konzumiranje bez prethodne toplotne obrade. Sirovo mleko magarice balkanske rase je pokazalo različitu antibakterijsku aktivnost prema Gram pozitivnim i Gram negativnim bakterijskim sojevima testiranim u okviru ove doktorske disertacije, čiji intenzitet je zavisio od nivoa kontaminacije uzoraka mleka testiranim patogenom i temperature inkubiranja. Temperatura inkubiranja od +15 &deg;C je u odnosu na +9 &deg;C bila generalno povoljnija za aktivnost antibakterijskih supstanci u mleku magarice prema svim testiranim patogenima, ali je antibakterijski potencijal uzoraka mleka magarice na +15 &deg;C bio limitiran bržim umnožavanjem ispitanih bakterija na ovoj temperaturi. To je posebno važilo za uzorke sa većim nivoima kontaminacije (103 i 104 cfu/ml). Antibakterijska aktivnost sirovog mleka magarice prema L. monocytogenes i S. aureus se na svim radnim temperaturama sastojala od produženja lag faze i inhibiranja bakterijskog rasta, dok se u slučaju S. Enteritidis, S. Typhimurium, E. coli ATCC 8739, E. coli ATCC 10536 i K. pneumoniae ona ogledala u redukciji njihovog početnog broja i/ili produženju lag faze. Rezultati ove doktorske disertacije su ukazali na kalcijum zavisnu prirodu antibakterijske aktivnosti sirovog mleka magarice prema S. Enteritidis, S. Typhimurium i oba testirana soja E. coli. Najsnažniju antibakterijsku aktivnost prema K. pneumoniae pokazali su uzorci mleka magarice, koji su pored velikog sadržaja lizozima imali i veliki sadržaj laktoferina, pa bi u ovom slučaju osnovni mehanizam antibakterijskog delovanja mleka magarice mogao biti sinergizam lizozima i laktoferina. Lizozim je najverovatnije glavni nosilac antibakterijske aktivnosti mleka magarice balkanske rase, obzirom da je u odnosu na drugi antimikrobni agens &ndash; laktoferin u testiranim uzorcima mleka magarice detektovan u višestruko većoj koncentraciji. Izvestan doprinos antibakterijskoj aktivnosti mleka<br />magarice balkanske rase prema L. monocytogenes i S. aureus mogle bi da daju i masne kiseline sa dokumentovanim antibakterijskim dejstvom prema Gram pozitivnim bakterijama (linolna, laurinska i oleinska kiselina), koje su u analiziranim uzorcima mleka magarice u zbiru činile od 40,3 do 54,7% od ukupnih masnih kiselina.</p> / <p>Donkey&#39;s milk has recently become a very popular topic among scientific community although it has been used for therapeutic and cosmetic purposes since ancient times. Even though the number of investigations concerning donkey&#39;s milk functionality has increased, the studies on its antimicrobial potential are limited. Especially, there is a lack in literature data on microbiological quality and antibacterial activity of donkey&#39;s milk obtained from Domestic Balkan breed originated in Serbia and other countries in Balkan region. The fact that this milk is traditionally consumed without heat treatment launches a series of issues concerning its safety.<br />The aim of this thesis was to determine microbiological quality of Domestic Balkan donkey&#39;s milk, as well as to investigate its antibacterial activity against the selected strains of Escherichia coli, Salmonella Enteritidis, Salmonella Typhimurium, Staphylococcus aureus, Listeria monocytogenes and Klebsiella pneumonia. In order to determine the major antibacterial substances, as well as the model of antibacterial activity, the content of antimicrobial proteins (lysozyme and lactoferrin) and calcium was determined. The amount of fatty acids which are known to be effective against Gram-positive bacteria was determined in milk samples tested for antibacterial activity against S. aureus и L. monocytogenes. The presence of L. monocytogenes and Salmonella spp. was not detected in any of the 137 raw donkey&#39;s milk samples, while the levels of E. coli, coliform bacteria, Enterobacteriaceae, yeast and molds and suspect Bacillus cereus were below the limit of detection of the assays. According to obtained results, all examined Domestic Balkan donkeys&#39; raw milk samples were<br />in accordance with the EU regulations 92/46/ЕЕC and EC 853/2004 in terms of their<br />microbiological quality, thus being completely safe for direct consumptions, without thermal treatment. Raw Domestic Balkan donkey&#39;s milk has expressed different antibacterial activities against Gram-positive and Gram-negative bacteria strains tested in this thesis, with the intensities which depended on contamination level and incubation temperature. In comparison to temperature of +9 &deg;C, the incubation temperature of +15 &deg;C was more favourable for activity of antibacterial substances in donkey&#39;s milk against all tested pathogens. However, the antibacterial potential of donkey&#39;s milk samples at +15 &deg;C was limited with rapid multiplication of bacteria at this temperature. This was especially pronounced in samples characterized with higher contamination levels (103 and 104 cfu/ml). Antibacterial activity of raw donkey&#39;s milk against L. monocytogenes and S. aureus at all tested temperatures reflected in prolonged lag phase and inhibition of bacterial growth, while the activity against S. Enteritidis, S. Typhimurium, E. coli АTCC 8739, E. coli АTCC 10536 and K. pneumonia comprised reduction of initial bacterial numbers and/or prolongation of lag phase.<br />Results obtained in this thesis have indicated on calcium dependent antibacterial activity of raw donkey&#39;s milk against S. Enteritidis, S. Typhimurium and both E. coli strains. The most pronounced antibacterial activity against K. pneumonia was found in donkey&#39;s milk samples which besides high content of lysozyme had high content of lactoferrin, thus indicating that the basic antibacterial mechanism of donkey&#39;s milk might be the synergism between lysozyme and lactoferrin. Lysozyme was probably the substance with the highest antimicrobial activity in Domestic Balkan donkey&#39;s milk, since it was detected in significantly higher concentrations than lactoferrin. The fatty acids which are known to be effective against Gram-positive bacteria (linoleic, lauric and oleic) and which comprised from 40.3 to 54.7% of total fatty acids in tested samples, may also contribute to antimicrobial activity of Domestic Balkan donkey&#39;s milk against L. monocytogenes and S. aureus.</p>

<p>U okviru doktorske disertacije ispitan je nutritivni kvalitet mleka magarice balkanske rase tokom laktacije. Prosečna suva materija mleka magarice balkanske rase iznosi 9,26%. Sadržaj proteina tokom laktacije kreće se od 1,40% do 1,92%. Prosečan sadržaj mlečne masti je 0,61%, a sadržaj laktoze iznosi 6,50%. Sadržaj analiziranih minerala: Ca, Na, K, Mg, P i Zn se povećava tokom laktacije i maksimalna vrednost utvrđena je 170. dana. Primenom kapilarne elektroforeze definisan je profil proteina mleka magarice balkanske rase. Identifikovane su sledeće proteinske frakcije: &alpha;s1-kazein, &alpha;s2-kazein, &beta;-kazein (A, F), &alpha;-laktalbumin (A, C), &beta;-laktoglobulin, lizozim, laktoferin, serum albumin i imunoglobulin čiji sadržaj opada tokom perioda laktacije. Sadržaj &alpha;-laktalbumina se kreće od 3090 mg/l do 1990 mg/l, a lizozima varira od 1040 mg/l do 2970 mg/l. Navedene frakcije proteina su najzastupljenije u mleku magarice balkanske rase. Laktoferin i imunoglobulin su frakcije sa najmanjim udelom u mleku magarice balkanske rase. Kori&scaron;ćenjem gasne hromatografije/masene spektrometrije utvrđen je sastav masnih kiselina mleka. Udeo esencijalne linolne kiseline (C18:2 n6) kreće se u opsegu od 7,08%, do 9,69%, a udeo &alpha;-linoleinske kiseline (C18:3 n3) varira od 5,85% do 7,83%.&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp; Sastav mleka magarice balkanske rase kompariran je sa nutritivnim karakteristikama humanog mleka tokom 40. i 90. dana laktacije. Utvrđene su značajne razlike u sadržaju proteina mleka, mlečne masti i minerala. Odnos kazeina i proteina surutke kreće se od 0,68 do 0,75 u mleku magarice, dok u humanom mleku varira od 0,59 do 0,70. Udeo -linoleinske kiseline (C18:3 n3) je oko 2,5 puta veći u mleku magarice u odnosu na humano mleko.<br />Generalno se može zaključiti da mleko magarice balkanske rase ima specifične nutritivne karakteristike koje variraju u zavisnosti od sastava hrane za životinje i analiziranog perioda laktacije.</p> / <p>Nutritional quality of Balkan donkey milk during lactation was investigated within this thesis. The mean content of dry matter, fat and lactose in the Balkan donkey milk was 9.26%, 0.61% and 6.50%, respectively. Protein content during lactation period ranged from 1.40% to 1.92%. Content of the analyzed minerals: Ca, Na, K, Mg, Zn and P increased during the lactation period and reached their maximum value at 170th day. The protein profile of Balkans donkey milk was defined by application of capillary electrophoresis when the following protein fractions: &alpha;s1-kazein, &alpha;s2-kazein, &beta;-kazein (A, F), &alpha;-laktalbumin (A, C), &beta;-laktoglobulin, lysozyme, lactoferrin, serum albumins and immunoglobulins, whose content decreases during lactation period,were identified. &alpha;-lactalbumin contents ranged from 3090 mg/l to 1990 mg/ and lysozyme varies between 1040 mg/l to 2970 mg/l. These two protein fractions were the most abundant in the Balkan donkey milk, while lactoferrin and immunoglobulin were at least represented. The fatty acid composition of Balkan donkey milk was determined using gas chromatography/mass spectrometry. The share of the essential linoleic (C18: 2 n6) and &alpha;&nbsp;- linolenic (C18: 3 n3) acid rangred from 7.08 % to 9.69% and from 5.85 % to 7.83 %.</p><p>Nutritional quality of Balkan donkey milk has been compared with the nutritional quality of human milk during the 40th and 90th day of lactation. Significant differences in the protein content of milk, fat and minerals were found. The ratio of casein and whey protein ranged from 0.68 to 0.75 in the Balkan donkey milk, while in human milk this value varies from 0.59 to 0.70. The share of &alpha;-linolenic acid (C18:3 n3) is around 2.5 times higher in donkey than in human milk.<br />The main conclusion is that Balkan donkey milk has specific and unique nutritional quality which depend on the feed composition and on the analyzed period of lactation.</p>