Resumo: Estudos de associação baseados em desequilíbrio de ligação (DL) são importantes ferramentas para construção de mapas de ligação e utilização em programas de melhoramento assistidos por marcadores. Em geral, são utilizadas populações segregantes ou linhagens isogênicas para composição destes programas. Com o objetivo de comparar o desequilíbrio de ligação em linhagens duplo-haplóides (DH) e linhagens obtidas por meio de autofecundação, duzentas e quarenta e cinco linhagens - cento e setenta e cinco convencionais e setenta DHs - foram submetidas à análise de marcadores do tipo Single Nucleotide Polymorphism (SNP), utilizando-se mil duzentos e trinta e quatro marcadores distribuídos pelos dez cromossomos. O resultado da regressão entre as distâncias mostrou um R2 de 0,6546 para linhagens duplo-haplóides e uma equação de tendência logarítmica, sendo y= -0,024ln(x) + 0,159. Para as linhagens convencionais, o R2 foi de 0,5727, com a equação que explica a tendência, sendo y = -0,008ln(x) + 0,0659. Os dados de DL foram analisados individualmente, por cromossomo; e, assim como na análise conjunta, individualmente, todos os cromossomos tiveram o mesmo comportamento quando se comparam o DL de linhagens DH e os convencionais, sendo que os valores de DL nas linhagens DH foram em geral mais altos que nas convencionais. Os resultados indicam que, para a obtenção de linhagens DH, a recombinação ocorre em blocos maiores quando comparado com as linhagens convencionais. / Abstract: Association studies based on linkage disequilibrium (LD) are important tools for linkage maps construction and to use in marker-assisted breeding programs. Typically, segregating populations or isogenic lines are used to compose them. With objective of compare the linkage disequilibrium on double haploid lines (DH) and lines obtained by self pollination (Conventional), two hundred and forty five inbred lines, where one hundred seventy five conventional and seventy DHs where submitted to the analysis of Single Nucleotide Polymorphism (SNP) molecular markers, using one thousand two hundred and thirty four markers random distributed over the ten chromosomes. The regression output among the distances showed R2 of 0.6546 for double haploids lines and one logarithmic trend equation, being y = -0.024ln(x) + 0.159 For conventional lines, R2 was 0.5727, with an equation that explains the trend, being y = -0.008ln(x) + 0.0659. LD data were analyzed by chromosomes individually and as such in the joint analysis, all individual chromosomes showed the same patternr when comparing the LD of DH lines versus conventional lines, being the LD of DH lines generally higher that the conventional lines. Results show that to obtain DH lines the recombination occurs in larger blocks when compared against the conventional lines. / Orientador: José Roberto Moro / Coorientador: Heyder Diniz Silva / Banca: Ricardo Machado da Silva / Banca: Herberte Pereira da Silva / Banca: Antonio Carlos Silva / Banca: Sandra Helena Unêda Trevisoli / Doutor

Bei der routinemäßigen Anwendung der Mikrosporenkultur zur Herstellung doppelt-haploider Linien kommt es bis heute zu Engpässen in der praktischen Rapszüchtung. Die Hauptprobleme stellen eine unzureichende Colchizin-induzierte Diploidisierungsrate und eine niedrige direkte Regeneration von Pflanzen aus Mikrosporen-Embryonen dar. Ein hoher Prozentsatz an Rapsembryonen aus Mikrosporenkultur durchläuft den Prozess der sekundären Embryogenese, der eine zeitintensive Subkultivierung erfordert. Hierbei werden die direkten Sprossansätze wiederholt von undifferenziertem Gewebe freigeschnitten bis eine Überführung in Erde und die letztendliche Regeneration zu doppelt-haploiden Pflanzen möglich ist. Die vorliegende Doktorarbeit besteht aus zwei Studien, die sich mit dem Thema: „Methodische Verbesserungen der Mikrosporenkultur in Brassica napus L.“ auseinandersetzen. Ziel der ersten Studie war die Erhöhung der Colchizin-induzierten Diploidisierungsrate von Mikrosporen ohne die Regeneration von Pflanzen aus den Mikrosporen-Embryonen zu verringern und damit die Entwicklung zu doppelt-haploiden Pflanzen zu verzögern. Aufgrund der hohen Toxizität von Colchizin wurden die weniger toxischen Mitosehemmstoffe Amiprophos-methyl (APM) und Pronamid, die eine höhere Affinität zu Pflanzentubulin als Colchizin besitzen, allein und in Kombination mit Colchizin untersucht. Eine Kombination dieser Mitosehemmstoffe führte zu keiner effizienten Diploidisierungsrate; demnach konnte ein synergistischer Effekt ausgeschlossen werden. Die acht untersuchten Winterrapsgenotypen erzielten eine Diploidisierungsrate von 40% bis 64%. Die Mitosehemmstoff-Behandlungen der isolierten Mikrosporen variierten hierbei zwischen 33% (3 µM APM, 72 Stunden) und 70% (25 µM Colchizin, 72 Stunden). Ein signifikanter Einfluss der Mitosehemmstoffe auf die Konversionsrate der Mikrosporen-Embryonen konnte nicht nachgewiesen werden. In Abhängigkeit der Genotypen konvertierten 14% bis 23% direkt. Unterschiedliche getestete Colchizinkonzentrationen (250, 150, 125, 25 µM) zeigten für 4 untersuchte Genotypen eine Colchizin-induzierte Diploidisierungsrate von 58% bis 66%, wobei die Behandlung 250 µM Colchizin für 48h die höchste Rate aufwies. Ein signifikanter Einfluss von Dimethylsulfoxid (DMSO), das oftmals als Lösungsmittel der angewendeten Mitosehemmstoffe verwendet wird, konnte jedoch nicht in den untersuchten Konzentrationen (0,3% und 3%) in Kombination mit der Colchizin-Behandlung (250 µM, 72 Stunden) auf die Diploidisierungsrate und die direkte Konversionsrate nachgewiesen werden. Weiterhin wurden 17 Winterrapsgenotypen bezüglich ihrer spontanen und ihrer Colchizin-induzierten Diploidisierungsrate untersucht und deren Konversionsrate der Mikrosporen-Embryonen zu Regeneraten mit direkten Sprossansätzen bestimmt. Die ausgewählten Genotypen enthielten sowohl Sorten als auch F1–Hybriden. Die spontan-induzierte Diploidisierungsrate zeigte eine große Variation von 15% bis 69%. Im Vergleich dazu erreichte die Colchizin-induzierte Diploidisierungsrate Werte von 40% bis 83%. Die Mikrosporen-Embryonen der getesteten Genotypen wiesen ebenfalls eine große Spannbreite bezüglich ihrer direkten Konversionsrate auf. Die Ergebnisse zeigten keinen signifikanten Einfluss der Mitosehemmstoff-Behandlung auf den Regenerationserfolg der Mikrosporen-Embryonen zu Pflanzen. Sowohl die beobachtete spontane und die Mitosehemmstoff-induzierte Diploidisierung als auch die Konversionsrate der Mikrosporen-Embryonen zu Regeneraten mit direkten Sprossansätzen waren stark Genotyp-abhängig. Ziel der zweiten Studie war die Erhöhung der direkten Regeneration der Mikrosporen-Embryonen zu Pflanzen trotz der starken Abhängigkeit der Genotypen. Zunächst wurde der Einfluss von zehn unterschiedlichen Sprossregenerationsmedien mit und ohne Phytohormone (Gibberellinsäure, 6-Benzylaminopurin, 3-Indolylbuttersäure) und eine 14-tägige Kältebehandlung bei 4 °C (Lichtthermostat) auf die direkte Konversionsrate der Mikrosporen-Embryonen von 5 Winterrapsgenotypen untersucht. Die 14-tägige Kältebehandlung erfolgte sowohl unter acht Stunden Licht als auch in Dunkelheit. Die Standardkultivierung der Mikrosporen-Embryonen erfolgte im Kulturraum bei 26 °C und 12 Stunden Licht. 13% bis 39% der Mikrosporen-Embryonen konvertierten direkt, wobei die höchste Rate von 43% nach Kultivierung der Embryonen auf Gamborg B5-Medium mit 0.1 mg/L Gibberellinsäure resultierte. Die Mittelwerte der Konversionsrate der Mikrosporen-Embryonen zu Regeneraten mit direkten Sprossansätzen aller untersuchten Genotypen und Kulturmedien wurden durch die 14-tägige Kältebehandlung (28%) gegenüber der Standardkultivierung (14%) signifikant erhöht. Nachfolgend wurde der Einfluss der vier effizientesten Sprossregenerationsmedien und eine 14-tägige Kältebehandlung bei 1.5 °C und bei 4 °C (Lichtthermostat) auf die Konversionsrate von Mikrosporen-Embryonen von 13 Winterrapsgenotypen untersucht. Die Kältebehandlung bei 1.5 °C erfolgte unter Lichtabwesenheit als auch unter acht Stunden Licht. Die Kältebehandlung bei 4 °C erfolgte dagegen in Dauerlicht und Dauerdunkel. Zwischen 29% und 76% der Mikrosporen-Embryonen konvertierten direkt. Im Vergleich zur Kultivierung unter Standardbedingungen konnte mit der Kältebehandlung eine signifikante Erhöhung erzielt werden (von 21% auf bis zu 71%). Nach vorheriger Kultivierung der Mikrosporen-Embryonen auf den unterschiedlichen Kulturmedien variierte die Konversionsrate zwischen 50% (MS) und 60% (B5 mit 0.1 mg/L Gibberellinsäure). Die Ergebnisse der Untersuchungen zeigten, dass trotz einer vorherrschenden starken Abhängigkeit vom Genotyp, die direkte Konversionsrate der Mikrosporen-Embryonen mit Kältebehandlung (1.5 °C im Dauerdunkel) signifikant erhöht werden konnte. Fast alle Genotypen zeigten Konversionsraten der Mikrosporen-Embryonen von über 70%. Es ist demnach möglich die sekundäre Embryogenese und die damit verbundene zeitintensive in vitro-Subkultivierung erheblich zu reduzieren, und dadurch den Entwicklungsprozess von doppelt-haploiden Linien zur Verwendung in der praktischen Rapszüchtung zu beschleunigen.

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:32:16Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2009-07-07Bitstream added on 2014-06-13T20:03:33Z : No. of bitstreams: 1 barbosa_mpm_dr_jabo.pdf: 358402 bytes, checksum: d85997fcfe0314483cdbbbf3d2c88ca2 (MD5) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Estudos de associação baseados em desequilíbrio de ligação (DL) são importantes ferramentas para construção de mapas de ligação e utilização em programas de melhoramento assistidos por marcadores. Em geral, são utilizadas populações segregantes ou linhagens isogênicas para composição destes programas. Com o objetivo de comparar o desequilíbrio de ligação em linhagens duplo-haplóides (DH) e linhagens obtidas por meio de autofecundação, duzentas e quarenta e cinco linhagens – cento e setenta e cinco convencionais e setenta DHs – foram submetidas à análise de marcadores do tipo Single Nucleotide Polymorphism (SNP), utilizando-se mil duzentos e trinta e quatro marcadores distribuídos pelos dez cromossomos. O resultado da regressão entre as distâncias mostrou um R2 de 0,6546 para linhagens duplo-haplóides e uma equação de tendência logarítmica, sendo y= -0,024ln(x) + 0,159. Para as linhagens convencionais, o R2 foi de 0,5727, com a equação que explica a tendência, sendo y = -0,008ln(x) + 0,0659. Os dados de DL foram analisados individualmente, por cromossomo; e, assim como na análise conjunta, individualmente, todos os cromossomos tiveram o mesmo comportamento quando se comparam o DL de linhagens DH e os convencionais, sendo que os valores de DL nas linhagens DH foram em geral mais altos que nas convencionais. Os resultados indicam que, para a obtenção de linhagens DH, a recombinação ocorre em blocos maiores quando comparado com as linhagens convencionais. / Association studies based on linkage disequilibrium (LD) are important tools for linkage maps construction and to use in marker-assisted breeding programs. Typically, segregating populations or isogenic lines are used to compose them. With objective of compare the linkage disequilibrium on double haploid lines (DH) and lines obtained by self pollination (Conventional), two hundred and forty five inbred lines, where one hundred seventy five conventional and seventy DHs where submitted to the analysis of Single Nucleotide Polymorphism (SNP) molecular markers, using one thousand two hundred and thirty four markers random distributed over the ten chromosomes. The regression output among the distances showed R2 of 0.6546 for double haploids lines and one logarithmic trend equation, being y = -0.024ln(x) + 0.159 For conventional lines, R2 was 0.5727, with an equation that explains the trend, being y = -0.008ln(x) + 0.0659. LD data were analyzed by chromosomes individually and as such in the joint analysis, all individual chromosomes showed the same patternr when comparing the LD of DH lines versus conventional lines, being the LD of DH lines generally higher that the conventional lines. Results show that to obtain DH lines the recombination occurs in larger blocks when compared against the conventional lines.