Thesis (M.Sc.). / Written for the Division of Experimental Medicine. Title from title page of PDF (viewed 2009/06/30). Includes bibliographical references.

Infecções causadas por Candida tropicalis (C. tropicalis) são associados à elevada morbi-mortalidade, e foram consideradas como importantes causas de infecção de corrente sanguínea no Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo (HCFMUSP) de março de 1998 a março de 2001. Adicionalmente, são responsáveis pelo aumento do tempo e dos custos de hospitalização e necessidade de cuidados intensivos. Esse estudo tem como objetivo a caracterização molecular e perfil de sensibilidade de 61 isolados de C. tropicalis a partir de candidemias no HCFMUSP e Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP), através das técnicas de amplificação aleatória do DNA polimórfico (RAPD), eletroforese em campo pulsátil (PFGE), tipagem de sequências de múltiplos locus gênicos (MLST) e antifungigrama por microdiluição pelos métodos propostos, Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI) e European Committee on Antibiotic Susceptibility Testing (EUCAST). A análise filogenética por RAPD evidenciou que os iniciadores P1 e P2 mostraram maior capacidade de discriminação que P3. Na análise por PFGE com enzimas de restrição SfiI, SmaI, BssHII e NaeI, a enzima BssHII mostrou maior poder discriminatório. MLST contribuiu com 36 novas diploid sequence type (DSTs) e 23 novos alelos, de acordo com o banco de dados oficial do MLST (http://pubmlst.org/ctropicalis/), representando o primeiro estudo que caracterizaram isolados sequenciais na América do Sul. Entre os isolados sequenciais de um mesmo paciente, as microvariações foram mais frequentes no fragmento de gene XYR1 em 8 pacientes e macrovariações ocorreram em quatro pacientes com mais de um isolado, destacando-se três que apresentaram diferença nos seis alelos estudados. A análise comparativa entre os métodos evidenciou diferenças entre os isolados múltiplos dos pacientes 3, 7 e 11, considerados diferentes pelos três métodos. O poder discriminatório foi de 83,47% para RAPD, 82,18% para PFGE e 97,4 % para MLST. Os resultados do antifungigrana mostraram concordância entre os métodos CLSI e EUCAST de 73,8% para o fluconazol, 67,2% para o itraconazol e 80,3% para o voriconazol. Do total de 61 isolados estudados, 3 isolados de diferentes pacientes foram resistentes ao fluconazol, com MIC de 64 g/mL. O fenômeno de trailing foi observado em 50% das amostras testadas frente ao fluconazol, 23% ao voriconazol e 21,3% ao itraconazol. O uso de pH 5,0 para re-análise do CLSI frente ao fluconazol revelou-se como uma ferramenta útil para esclarecer o perfil de sensibilidade de isolados que apresentaram o fenômeno de trailing. Não houve correlação entre perfil genético gerado pelas técnicas de caracterização molecular estudadas e o perfil fenotípico através do teste de sensibilidade aos antifúngicos / Infections caused by Candida tropicalis (C. tropicalis) have been characterized as important causes of candidemia at the Hospital of the Medical school, University of São Paulo (HCFMUSP) from March 1998 to March 2001 and are associated with high morbidity and mortality. Additionally, they have been related to higher hospitalization costs because of longer hospitalization times and intensive care needs. This study aims to analyze the molecular typing and antifungal susceptibility profile of 61 isolates of C. tropicalis from 41 patients with candidemia in HCFMUSP and University of Campinas (UNICAMP), through Random Amplified Polymorphic DNA (RAPD), Pulsed Field Gel Electrophoresis (PFGE), Multilocus Sequence Typing (MLST) and broth microdilution antifungal susceptibility methodologies proposed by Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI) and European Committee on Antibiotic Susceptibility Testing (EUCAST). Phylogenetic analysis showed higher discriminatory power index of P1 and P2 primers than P3 by RAPD analysis. PFGE was performed with restriction enzymes SfiI, SmaI, NaeI and BssHII) and the enzyme BssHII presented the best performance. MLST analyses revealed 36 new diploid sequence type (DSTs) and 23 new alleles according to the C. tropicalis MLST database (http://pubmlst.org/ctropicalis/), representing the first study to characterize the sequential isolates of C. tropicalis candidemia in South America. Microvariation in a single gene was found in the sequential isolates from 8 patients. The main polymorphisms occurred in the alleles of the XYR1 gene. Macrovariation was detected in isolates from four patients, where 3 patients presented polimorphisms in six gene fragments. The comparative analysis revealed differences among sequential isolates from patients 3, 7 and 11, considered by three different methods. The discriminatory power was 83.47% for RAPD, 82.18% for PFGE and 97.4% for MLST. The agreement between the CLSI and EUCAST methods was 73.8% to fluconazole susceptibility, 67.2% to itraconazole and 80.3% to voriconazole. Of the 61 isolates tested, 3 isolates from different patients were resistant to fluconazole, MIC of 64 mg/mL. The trailing phenomenon was observed in 50% to fluconazole, 23% to voriconazole and 21.3% to itraconazole. Among the isolates studied, the use of pH 5.0 facilitated the determination of minimum inhibitory concentrations (MICs) for the re-analysis of fluconazole by CLSI, proving to be an important tool for the trailing phenomenon. No correlation was observed between genetic profile generated by the techniques of molecular characterization and phenotypic profile determined by susceptibility tests to antifungal drugs

Infecções causadas por Candida tropicalis (C. tropicalis) são associados à elevada morbi-mortalidade, e foram consideradas como importantes causas de infecção de corrente sanguínea no Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo (HCFMUSP) de março de 1998 a março de 2001. Adicionalmente, são responsáveis pelo aumento do tempo e dos custos de hospitalização e necessidade de cuidados intensivos. Esse estudo tem como objetivo a caracterização molecular e perfil de sensibilidade de 61 isolados de C. tropicalis a partir de candidemias no HCFMUSP e Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP), através das técnicas de amplificação aleatória do DNA polimórfico (RAPD), eletroforese em campo pulsátil (PFGE), tipagem de sequências de múltiplos locus gênicos (MLST) e antifungigrama por microdiluição pelos métodos propostos, Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI) e European Committee on Antibiotic Susceptibility Testing (EUCAST). A análise filogenética por RAPD evidenciou que os iniciadores P1 e P2 mostraram maior capacidade de discriminação que P3. Na análise por PFGE com enzimas de restrição SfiI, SmaI, BssHII e NaeI, a enzima BssHII mostrou maior poder discriminatório. MLST contribuiu com 36 novas diploid sequence type (DSTs) e 23 novos alelos, de acordo com o banco de dados oficial do MLST (http://pubmlst.org/ctropicalis/), representando o primeiro estudo que caracterizaram isolados sequenciais na América do Sul. Entre os isolados sequenciais de um mesmo paciente, as microvariações foram mais frequentes no fragmento de gene XYR1 em 8 pacientes e macrovariações ocorreram em quatro pacientes com mais de um isolado, destacando-se três que apresentaram diferença nos seis alelos estudados. A análise comparativa entre os métodos evidenciou diferenças entre os isolados múltiplos dos pacientes 3, 7 e 11, considerados diferentes pelos três métodos. O poder discriminatório foi de 83,47% para RAPD, 82,18% para PFGE e 97,4 % para MLST. Os resultados do antifungigrana mostraram concordância entre os métodos CLSI e EUCAST de 73,8% para o fluconazol, 67,2% para o itraconazol e 80,3% para o voriconazol. Do total de 61 isolados estudados, 3 isolados de diferentes pacientes foram resistentes ao fluconazol, com MIC de 64 g/mL. O fenômeno de trailing foi observado em 50% das amostras testadas frente ao fluconazol, 23% ao voriconazol e 21,3% ao itraconazol. O uso de pH 5,0 para re-análise do CLSI frente ao fluconazol revelou-se como uma ferramenta útil para esclarecer o perfil de sensibilidade de isolados que apresentaram o fenômeno de trailing. Não houve correlação entre perfil genético gerado pelas técnicas de caracterização molecular estudadas e o perfil fenotípico através do teste de sensibilidade aos antifúngicos / Infections caused by Candida tropicalis (C. tropicalis) have been characterized as important causes of candidemia at the Hospital of the Medical school, University of São Paulo (HCFMUSP) from March 1998 to March 2001 and are associated with high morbidity and mortality. Additionally, they have been related to higher hospitalization costs because of longer hospitalization times and intensive care needs. This study aims to analyze the molecular typing and antifungal susceptibility profile of 61 isolates of C. tropicalis from 41 patients with candidemia in HCFMUSP and University of Campinas (UNICAMP), through Random Amplified Polymorphic DNA (RAPD), Pulsed Field Gel Electrophoresis (PFGE), Multilocus Sequence Typing (MLST) and broth microdilution antifungal susceptibility methodologies proposed by Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI) and European Committee on Antibiotic Susceptibility Testing (EUCAST). Phylogenetic analysis showed higher discriminatory power index of P1 and P2 primers than P3 by RAPD analysis. PFGE was performed with restriction enzymes SfiI, SmaI, NaeI and BssHII) and the enzyme BssHII presented the best performance. MLST analyses revealed 36 new diploid sequence type (DSTs) and 23 new alleles according to the C. tropicalis MLST database (http://pubmlst.org/ctropicalis/), representing the first study to characterize the sequential isolates of C. tropicalis candidemia in South America. Microvariation in a single gene was found in the sequential isolates from 8 patients. The main polymorphisms occurred in the alleles of the XYR1 gene. Macrovariation was detected in isolates from four patients, where 3 patients presented polimorphisms in six gene fragments. The comparative analysis revealed differences among sequential isolates from patients 3, 7 and 11, considered by three different methods. The discriminatory power was 83.47% for RAPD, 82.18% for PFGE and 97.4% for MLST. The agreement between the CLSI and EUCAST methods was 73.8% to fluconazole susceptibility, 67.2% to itraconazole and 80.3% to voriconazole. Of the 61 isolates tested, 3 isolates from different patients were resistant to fluconazole, MIC of 64 mg/mL. The trailing phenomenon was observed in 50% to fluconazole, 23% to voriconazole and 21.3% to itraconazole. Among the isolates studied, the use of pH 5.0 facilitated the determination of minimum inhibitory concentrations (MICs) for the re-analysis of fluconazole by CLSI, proving to be an important tool for the trailing phenomenon. No correlation was observed between genetic profile generated by the techniques of molecular characterization and phenotypic profile determined by susceptibility tests to antifungal drugs

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