Changes in extracellular matrix (ECM) deposition along with increases in airway smooth muscle (ASM) mass are characteristic features of airway remodeling which contribute to asthma pathophysiology. Modifications in ECM include increased collagen deposition and altered proteoglycans (PGs) levels. While biglycan, a small leucine-rich PG (SLRP), deposition is generally increased, changes in decorin, another SLRP, are more variable. The interaction between the cell and the surrounding ECM triggers numerous cellular responses, which modulate functions such as survival, proliferation and differentiation. Since decorin and biglycan are known to influence cell behaviour in various types of cells, we hypothesized that these molecules would affect human airway smooth muscle cell (HASMC) function. We sought to determine the effects of decorin and biglycan on HASMC proliferation, apoptosis and attachment, and to explore the putative mechanisms responsible for these effects. Collagen type I was used as a control.Culture on a decorin matrix caused a decrease in HASMC number, which was attributed to a decrease in proliferation and an increase in apoptosis. Culture on biglycan caused an initial decrease in cell number that was not sustained. Collagen caused a significant increase in cell number. Neither biglycan nor collagen caused changes in proliferation or apoptosis. Subsequent experiments showed that cell anchorage to decorin and biglycan matrices caused abnormal focal adhesion and cytoskeletal organization, as well as, increases in alpha2 integrin protein levels as compared to cells seeded on collagen or plastic. To assess integrin activation, focal adhesion kinase (FAK) protein levels and activation were measured. FAK levels were significantly decreased compared to cells cultured on plastic or collagen I, but activation levels were unchanged.These studies demonstrate that PGs have differential effects on HASMC growth. Whereas decorin reduces ASM proliferation and increases apoptosis, biglycan has no effect. Cell-matrix adhesions were irregular in HASMCs seeded on decorin or biglycan compared to cells on collagen I or plastic. Decreases in decorin in the asthmatic airway wall, as observed in fatal asthma cases, may permit more exuberant ASM hyperplasia, suggesting that decorin's presence could serve a protective role by modulating the increase in ASM mass in asthma. / Les changements de composition de la matrice extracellulaire (MEC) ainsi que l'augmentation de la masse du muscle lisse des voies aériennes sont des caractéristiques du remodelage des voies aériennes qui contribuent à la physiopathologie de l'asthme. Les modifications de la MEC comprennent une augmentation du dépôt de collagène et un changement du niveau des protéoglycanes (PGs). Le dépôt de biglycane, un petit PG riche en leucine, est généralement plus élevé. Les changements d'expression de la décorine, un autre petit PG riche en leucine, sont, par contre, plus variables. L'interaction entre la cellule et la MEC qui l'entoure, déclenche de nombreuses réponses cellulaires, telles que la survie, la prolifération et la différenciation. Étant donné que la décorine et le biglycane peuvent influencer le comportement de différents types de cellules, nous avons émis l'hypothèse que ces molécules auraient aussi un effet sur la fonction des cellules musculaires lisses des voies aériennes. Nous avons cherché à déterminer les effets de la décorine et du biglycane sur la prolifération, l'apoptose et l'attachement des cellules musculaires lisses des voies aériennes. Nous avons aussi exploré les mécanismes putatifs qui seraient responsables de ces effets en utilisant le collagène de type I sera comme traitement de référence. La culture des cellules sur une matrice de décorine a provoqué une diminution du nombre cellules musculaires lisses des voies aériennes due à une diminution de la prolifération et à une augmentation de l'apoptose. La culture sur le biglycane a causé initialement une diminution du nombre de cellules, mais cette baise n'a pas été maintenue. Le collagène a provoqué une augmentation significative du nombre de cellules. Ni le biglycane ni le collagène n'ont induit des changements au niveau de la prolifération ou de l'apoptose. Des expériences ultérieures ont démontré que l'ancrage des cellules musculaires lisses des voies aériennes sur des matrices de décorine et de biglycane était anormal, ainsi que la formation d'adhésions focales et l'organisation du cytosquelette, en comparaison avec les cellules ensemencées sur du collagène ou du plastique. De plus, l'augmentation d'expression protéique de la sous-unité alpha2 d'intégrine a également été observée. Pour évaluer l'activation des intégrines, le niveau de protéine, ainsi que l'activation de la kinase des adhésions focales (FAK) ont été mesurés. En présence de décorine, l'expression protéique de FAK était significativement diminuée comparativement aux niveaux produits par les cellules ensemencées sur du plastique ou du collagène bien que le niveau d'activation était inchangé. Ces études démontrent que les PGs ont des effets distincts sur la croissance des cellules musculaires lisses des voies aériennes: la décorine a réduit la prolifération et a augmenté l'apoptose des cellules, tandis que le biglycane n'a pas modifié ces paramètres. Les adhésions cellules-matrice des cellules musculaires lisses des voies aériennes ensemencées sur la décorine ou le biglycane étaient irrégulières par rapport aux cellules sur le collagène de type I ou le plastique. La diminution de la quantité de décorine dans la paroi des voies aériennes observée dans les cas d'asthme fatal pourrait entraîner une hyperplasie plus prononcée des cellules musculaires lisses des voies aériennes. Ceci suggère que la présence de la décorine pourrait jouer un rôle protectif dans l'asthme, en modulant l'augmentation de la masse du muscle lisse des voies aériennes.

Activin and TGFbeta, members of the TGFbeta superfamily, are pluripotent cytokines that are expressed in virtually every cell of the body. These factors play diverse roles in the body such as regulating early development of the embryo, differentiation, extracellular matrix formation, hematopoiesis, angiogenesis and immune functions. TGFbeta superfamily signaling is transduced by heteromeric serine/threonine kinase receptors at the cell surface and the intracellular mediator, the Smad complex. Following activation of the receptors, there is recruitment and phosphorylation the Smads. As a result the Smad proteins accumulate in the nucleus, bind co-activators or repressors and elicit or suppress transcription of target genes. / To date, the molecular signaling mechanisms for activin/TGFbeta in mammary gland growth and differentiation have not been fully elucidated. Our data identify a novel regulatory crosstalk mechanism by which activin/TGFbeta induced Smad signaling acts to antagonize Stat5 transactivation in mammary epithelial cells. We demonstrate an inhibitory effect of activin/TGFbeta on milk protein expression, specifically betacasein. We further show that activin/TGFbeta inhibitory effect upon betacasein expression is not due to changes in either Stat5 phosphorylation, translocation to the nucleus or binding on the Stat5 response element. We finally demonstrate that the Smads are required to block Stat5 transactivation by activin/TGFbeta and show that they are important mediators in activin/TGFbeta inhibitory response upon Stat5 target gene expression, in particular betacasein and cyclin D1. Finally, we unveil the mechanism by which these two signaling cascades antagonize their effects and find that activated Smads inhibit Stat5 association with its co-activator CBP, thus blocking Stat5 transactivation of its target genes. Thus, we define a novel crosstalk mechanism between two divergent signaling pathways that are involved in regulating mammary gland growth and differentiation. / Whereas the role of TGFbeta signaling in breast cancer has been well characterized, we sought out to study the role and mechanism of action of activin in the human breast cancer T47D cells. We found that activin treatment of T47D cells leads to a potent inhibition of cell growth. We further show that activin induces the Smad, the p38-mitogen activated kinase pathways and the p38 downstream target ATF2. Finally, using specific inhibitors to block p38 MAPK, activin-mediated cell growth inhibition is completely abolished. Together, these results define a novel signaling mechanism induced by activin in breast cancer cells. / Finally in an attempt to identify genes regulated by activin in breast cancer cells, we discover the death adaptor molecule RAIDD as a novel target of activin signaling. We show that RAIDD mRNA and protein levels are potently upregulated by activin. Using antisense-oligos directed against RAIDD, we show that RAIDD expression is necessary in mediating activin inhibition in breast cancer cells. Hence, we define the involvement of a new player in activin mediated cell growth inhibition. / Collectively, these studies reveal novel mechanisms of the activin/TGFbeta signaling cascade in normal mammary epithelial cells and breast cancer cells.

The development of the nervous system is highly dependent on the differentiation of various neuronal and glial cell populations, efficient targeting of axons, establishment of neuronal connections and continuous branching/pruning and establishment of new connections. These processes are possible through migration, adhesion and cytoskeletal rearrangement processes that are common in most organogenesis. The extracellular matrix and guidance molecules interact with cell surface receptors that transduce signaling mechanisms intracellularly allowing for these cellular responses to take place.Netrins are bifunctional chemotropic cues that attract or repel different classes of axons by signaling through the netrin receptors Deleted in Colorectal Cancer (DCC) and the UNC5 homologues (UNC5a, b, c and d) during the development of the nervous system. This family of chemotropic molecules is a member of the laminin superfamily. Similar to laminin-integrin signaling, netrin-1's interaction with its receptor DCC results in the activation of the Rho GTPases Rac and Cdc42 and the promotion of a signaling cascade that leads to growth cone cytoskeletal and membrane remodeling. This thesis focused on further identifying the signaling molecules and complexes downstream of DCC that are required for netrin-1 mediated commissural neuron axon chemoattraction.In the first part of this thesis we have used an unbiased mass spectrometry approach to identify signaling molecules complexed to DCC in commissural neurons isolated from E12/13 spinal cord. From the mass spectrometry data obtained we chose to characterize Arp2/3 and 14-3-3. Arp2/3 co-immunoprecipitated with DCC in commissural neuron in a netrin-1-dependent manner. We further established that netrin-1 mediated commissural growth cone expansion and filopodia remodeling is blocked by wiskostatin, a potent chemical inhibitor of N-WASP activity towards the Arp2/3 complex. The treatment of the neurons with wiskostatin also inhibited netrin-dependent externalization of DCC. These results suggest that actin polymerization resulting from N-WASP/Arp2/3 complexes may be required to maintain DCC cell surface recycling during netrin-1 mediated axon guidance. The 14-3-3 epsilon adaptor protein was also identified as a DCC associated protein. However, its association with DCC decreased with the addition of netrin-1. The inhibition of 14-3-3 function using a function-blocking peptide resulted in the collapse of commissural growth cones which could not be recovered by the addition of netrin-1. In the second part of this thesis we identified β-Pix as a potential GEF downstream of DCC involved in the activation and propagation of Rac-1 and Cdc42 signaling. We found that a β-Pix/Git complex associates with DCC in commissural neurons. β-Pix is highly expressed in the developing spinal cord in various neuronal subpopulations. Additionally functional assays using the overexpression of β-Pix mutants showed that β-Pix complexes and association with Pak are important steps in the maintenance of netrin-1 induced changes in GC morphology, in commissural axon extension to the midline, and for cortical neuron branching. Using modified GTPase assays we further demonstrated that β-Pix is required for Cdc42 and Rac-1 activation downstream of netrin-1 and is associated with the GTP-bound GTPases. β-Pix may associate with the GTPases by binding to Pak, or alternatively, may bind directly, as has been demonstrated for the related protein α-Pix, resulting in allosteric activation of the GTPase. These results support a novel model, in which β-Pix/Git complexes play an integral part in the activation of Rac-1 and Cdc42 downstream of DCC.These findings provide novel insight into the signaling events activated by netrin-1 downstream of DCC during commissural axon guidance. They have also identified new questions related to how signal transduction mechanisms activated by netrin-1 regulate the cytoskeleton of the axonal growth cone. / Le développement du système nerveux dépend en grande proportion en la différentiation de différentes populations de cellules neuronales et gliales, du guidage efficace des axones, de l'établissement de connexions neuronales et de ramification et élagage de ces nouvelles connexions. Ces procès sont possibles grâce à la migration, adhésion et réarrangement du cytosquelette, des mécanismes communs à l'organogénèse. Les Netrines sont des signaux chimiotropiques qui attirent ou bien repoussent différentes classes d'axones, par l'intermédiaire du récepteur Deleted in Colorectal Cancer (DCC) et des récepteurs UNC5 (UNC5a, b, c et d) pendant le dévelopement du système nerveux. Cette famille de molécules chimiotropiques partage une haute homologie avec la famille des laminines. De façon analogue à la signalisation laminine-intégrine, l'intéraction de la Netrine avec son récepteur DCC mène à l'activation des Rho-GTPases Rac-1 et Cdc42 et d'une cascade de signalisation qui mène au remodèlement du cytosquelète et de la membrane du cône de croissance. Cette thèse se concentre sur l'identification plus approfondie des molécules et complexes de signalisation en aval du récepteur DCC qui sont requis pour la chimio-attraction des axones des neurones comissuraux médiée par la Netrine. Dans la première partie de cette thèse nous avons utilisé une approche de spectrométrie de masse non biaisée pour identifier des molécules de signalisation complexées au récepteur DCC lié à la Netrine dans des neurones commissuraux isolés de moelle épinière à E12/E13. A partir des données de spectrométrie de masse nous avons choisi de caractériser Arp2/3 et 14-3-3. Arp2/3 a co-immunoprécipité avec DCC de façon dépendante de la Netrine. De plus nous avons démontré que l'expansion du cône de croissance et le remodelage des filopodes commissuraux sont bloqués par la Wiskostatine, un puissant inhibiteur de l'activité de N-WASP envers le complexe Arp2/3. De plus, le traitement aves la wiskostatine a inhibé l'externalisation dépendante de la Netrine du récepteur DCC. Ces résultats suggèrent que la polymérisation de l'actine résultant de complexes N-WASP/Arp2/3 peut être requise pour le maintient du recyclage de DCC à la surface de la cellule pendant le guidage axonal généré par la Netrine. La proteine adaptateur 14-3-3 epsilon a aussi été identifiée comme étant associée à DCC. Néanmoins, son association à DCC décroit suite à l'addition de Netrine. L'inhibition de 14-3-3 par l'utilisation d'un peptide bloqueur a eu comme résultat le collapse des cônes de croissance commissuraux, qui n'ont pas pu être récupérés par l'addition de Netrine. Dans la deuxième partie de cette thèse nous avons identifié ß-Pix comme un potentiel GEF en aval de DCC, impliqué dans l'activation et la propagation de la signalisation par Rac-1 et Cdc42. Nous avons déterminé qu'un complexe ß-Pix/Git s'associe avec DCC dans les neurones commissuraux. De plus, des essais fonctionnels utilisant la surexpression de mutants ß-Pix a montré que les complexes ß-Pix et l'association avec Pak sont des pas importants dans le maintient et la morphologie des cônes de croissance, l'extension des axones commissuraux vers la ligne médiane et la ramification des neurones corticaux éllicités par la Netrine. En utilisant des essais de GTPase modifiés nous avons aussi démontré que ß-Pix est requis pour l'activation de Cdc42 et Rac-1 en aval de la Netrine et qu'il est associé avec les GTPases liées à GTP. ß-Pix peut s'associer aux GTPases par l'intermédiaire de Pak ou, en alternative, peut se lier directement, tel que démontré pour la protéine proche α-Pix, menant à l'activation allostérique de la GTPase. Ces résultats supportent un nouveau modèle où des complexes ß-Pix/Git pourraient jouer un rôle intégral dans l'activation de Rac-1 et Cdc42 en aval de DCC. Ces données apportent de nouvelles avenues dans la signalisation en aval de DCC pendant le guidage des axones commissuraux.

Heart failure is the leading cause of death in both men and women of Western countries. The pathophysiology of heart failure is associated with abnormalities in intracellular calcium control. Calsequestrin (CSQ2), a calcium storage protein in cardiomyocytes, is negatively regulated by the transcription factor Egr-1 thus altering calcium availability for cardiac contraction/relaxation. Here, we tested the hypothesis that the proteins complexed to Egr-1 and/or their post-translational modifications would affect regulation of CSQ2 expression. Egr-1 and Sp1 compete for binding at the CSQ2 promoter, but also bind one another. In fact, together they form a complex with another ubiquitous transcription factor YBX-1. This complex was identified in vivo and in vitro by a series of co-immunoprecipitations. To test the idea that complex formation and CSQ2 expression could be affected by acetylation, histone acetyltransferase (HAT) inhibitors and histone deacetylase (HDAC) inhibitors were used to respectively decrease or increase acetylation within cells. We found that acetylation did not impact the formation of the Egr-1: Sp1: YBX-1 complex thought to regulate CSQ2 expression. However, changes in CSQ2 expression were observed when acetylation was modified by HAT and HDAC inhibitors. We conclude that acetylation modifies CSQ2 expression although not by means of the Egr-1: Sp1: YBX-1 complex even though Egr-1 is known to be acetylated. / La maladie du coeur est la cause principale de mortalité chez les femmes et les hommes en Occident. L'arrêt cardiac est souvent associé à des anomalies en control de calcium intracellulaire. Le facteur de transcription Egr-1 est connu pour son contrôle négatif de l'expression de calsequestrine (CSQ2), une protéine réservoir de calcium. Un manque de CSQ2 impacte les quantités de calcium disponible pour un bon fonctionnement cardiaque. Ici nous avons examiné l'hypothèse que les protéines liées à Egr-1 et que ses modifications post-translationelles. Egr-1 et Sp1 sont en compétition pour le promoteur de CSQ2 mais sont aussi liés l'un à l'autre. En fait, ensemble ils forment un complexe avec le facteur de transcription universel YBX-1. Ce complexe a été identifié en vivo et en vitro par co-immunoprécipitations. Considérant que la formation de ce complexe ainsi que l'expression de CSQ2 peuvent être affectés par l'acétylation, des inhibiteurs d'acétyltransferase d'histone (ATH) et de déacétylase d'histone (DACH) ont été respectivement utilisés pour réduire et augmenter l'acétylation en cellules. Nous avons trouvés que la formation du complexe Egr-1: Sp1: YBX-1 qui est possiblement responsable de l'expression de CSQ2 n'est pas affecté par les changements en acétylation. Par contre, des changements ont été aperçus dans l'expression de CSQ2 quand l'acétylation a été modifiée par ATH ou par DACH. Nous croyons que l'acétylation impacte l'expression de CSQ2 mais pas par entremise du complexe Egr-1 : Sp1 : YBX-1 malgré l'acétylation de la protéine Egr-1 elle-même.

Post-translational modification is one crucial cellular mechanism through which proteins are altered in structure and function. A variety of proteins different in function and cellular localization is affected by such modification. With a wide range of influence within a cell, lysine acetylation has emerged as one major post-translational modification that rivals to phosphorylation. Indeed, recent proteomic studies have revealed that lysine acetylation affects 5-10 % of mammalian and bacterial proteins. This modification is catalyzed by the opposing actions of lysine acetyltransferases and deacetylases. One of the first acetylated proteins identified in the mid-1980s is α-tubulin, a subunit of microtubules that comprise the cytoskeletal network. Although deacetylation of α-tubulin is well known to be catalyzed by HDAC6, the responsible acetyltransferase remained elusive until recently. The recent discovery of Atat1 (α-tubulin acetyltransferase 1) has yielded important insights into the role of acetylated α-tubulin in lower organisms such as C. elegans, but it remains unclear whether this is also the case in vivo in higher organisms such as mammals. Here, using mice devoid of Atat1, I demonstrate that Atat1 is a major acetyltransferase of α-tubulin dispensable for mouse development. I also show that Atat1 is highly expressed in testis, renal pelvis, gastrointestinal tract, and hippocampus, but development of these tissues appears normal in the absence of Atat1. Moreover, in a set of molecular and cellular studies, I have identified ATAT1 as a potential interaction partner of several proteins. Together, these findings provide direct support of Atat1 as an authentic α-tubulin acetyltransferase, thereby setting up a solid foundation for additional studies of this enzyme and tubulin acetylation in mice and humans. / La modification post-traductionnelles des protéines est un mécanisme cellulaire essentiel par laquel la structure et la fonction des protéines peuvent-être affectées. Les modifications sont présentes dans la grande majorité de voie cellulaire et les protéines cibles possèdent une grande diversité de fonction et de localisation cellulaire. L'acétylation des lysines a émergé comme une modification de grande importance, ayant un impact majeur sur les cellules, à l'instar de la phosphorylation. Effet, des études récentes de protéomique ont révélées que de 5 à 10 % des protéines bactériennes et animales étaient affectées par l'acétylation des lysines. Cette mondification est catalysé par l'effet inverse de deux classes de protéines, les lysines acétyltransférase et les déactylases. L'une des premières protéines identifiées dans acétylés milieu des années 1980 est l'α-tubuline, une sous-unité des microtubules qui composent le réseau du cytosquelette. Malgré que l'enzyme responsable de la déacétylation de l'α-tubuline est connue sous le nom HDAC6, l'enzyme responsable de son acétylation est restée inconnue jusqu'à récemment. La découverte d'Atat1 (α-tubuline acétyltransférase1) a donné des informations importantes sur le rôle de l' aétylation sur l'α-tubuline dans les organismses inférieurs comme C. elegans, mais il reste difficile de savoir si c'est aussi le cas in vivo dans les organismes supérieurs commes les mammifères. En utilisant des modèles murin de Atat1, je démontre que Atat1 est une acétyltransférase majeur de l'α-tubuline dispensable pour le développement normal. De plus, je démontre que le niveau d'expression d'Atat1 est particulièrement élevé dans les testicules, le bassinet du rein, le tractus gastro-intestinal, et l'hippocampe, pourtant, le développement de ces tissus semble normal en l'absence de Atat1. En outre, dans une série d'études moléculaires et cellulaires, j'ai identifié ATAT1 comme un partenaire potentiel d'interaction de plusieurs autres protéines. Ces résultats non seulement apporter un soutien supplémentaire de la Atat1 comme une acétyltransférase authentique de l'α-tubuline, mais aussi mettre en place une bonne base pour des études supplémentaires de cette protéine chez les souris et les humains.

Background: In the Current Model of Akt activation, a key event is its recruitment to the plasma membrane, where it is fully activated subsequent to sequential phosphorylation at positions Ser473 and Thr308. The distribution of Akt into various subcellular compartments may contribute to the different signaling pathways which it influences. There is evidence of compartment-specific regulators in plasma membrane (PM) and endosomes. Previous experiment in our laboratory showed that Akt achieved greater specific activity in PM compared to cytosol after insulin treatment. This raised the question whether Akt hyperactivity in PM is exclusively due to the high concentration in PM of activated Akt (theCurrent Model), or due to other factor (s) besides pSer473 and pThr308. Aim of study: The objective of our study was to assess the sequence and extent of the Akt activation state as a consequence of its subcellular localization. Therefore we compared the Akt activation state (Akt kinase activity / phosphorylation level, or Akt kinase activity/content) in two compartments (PM & cytosol) after insulin and EGF (Epidermal Growth Factor) administration. Results and conclusions: We found that Akt pThr308 correlates more closely to Akt kinase activity than pSer473; and concluded that Akt pThr308 is the important phosphorylation site determining Akt activity as stipulated in the Current Model. Second, Akt activity differed in PM vs cytosol with the activity in PM not fully explained by the levels of pSer473 and pThr308. We suggest that other regulator(s) exist in the plasma membrane which contributes to the up-regulation of Akt activity. Third, we found that the potential regulator(s) plays a comparable role to influence Akt activity in PM after both insulin and EGF administration. / Mise en contexte: Dans le modèle actuel d'activation de l'Akt, un événement clé est le recrutement de cette protéine à la membrane plasmique, où elle est complètement activée à la suite de la phosphorylation séquentielle des acides aminés aux positions Ser473 et Thr308. La distribution de l'Akt dans les divers compartiments subcellulaires pourrait contribuer aux différentes voies de signalisations. Il est rapporté que des régulateurs de compartiments spécifique dans la membrane plasmique (PM) et les endosomes contribuent à son recrutement. Des expériences précédentes dans notre laboratoire ont démontré que l'Akt a atteint un niveau d'hyperactivité dans la PM en comparaison avec le cytosol après avoir ajouté l'insuline. Ceci amène à la question de l'hyperactivité de l'Akt dans la PM est exclusivement dûe à la haute concentration d'Akt activés dans la PM (le modèle actuel) ou d'autre(s) facteur(s) additionnel (les) contribue (nt) à son activation. But de l'étude : L'objectif de cette étude est de déterminer la conséquence et l'ampleur du niveau d'activation de l'Akt en fonction de sa localisation subcellulaire. Ainsi, nous avons comparé le niveau d'activation de l'Akt (l'activité Akt kinase / niveau de phosphorylation, ou l'activité Akt kinase / contenu) dans deux compartiments (PM & cytosol) après l'administration d'insuline et d'EGF (Epidermal Growth Factor). Résultats et conclusions : Nous avons observé que l'Akt pThr308 est corrélée plus étroitement à l'activité de l'Akt kinase qu'à pSer473 et avons conclu que l'Akt pThr308 est le site significatif pour déterminer l'activité de l'Akt tel que défini dans le modèle actuel. De plus, l'activité de l'Akt est différente dans la PM versus cytosol. Également, l'activité de l'Akt dans la PM n'est pas complètementexpliquée par les niveaux de pSer473 et pThr308. Nous spéculons que d'autres facteurs régulateurs pourraient jouer un rôle comparable dans l'activité de l'Akt dans la PM après l'administration d'EGF et d'insuline.

The binding of human Growth Hormone (GH) to its receptor (GHR) on target cells leads to activation of three major intracellular signaling pathways: JAK2/STAT5, PI3K/AKT and ERK/MAPK. However, in addition to the full length (FL) GHR, there exist two truncated (Tr) GHR isoforms, GHR1-279 and GHR1-277, that lack the majority of their intracellular domain as a result of alternative splicing of GHR mRNA. While both in vitro and in vivo studies suggest that the Tr GHR isoforms have a dominant negative effect on FL GHR by forming stable heterodimers, little is known about their normal physiological functions and their effects on the three major GH signaling pathways. We hypothesized that Tr GHR isoforms play a functionally significant role in human cells and tissues, fine-tuning the ability of GH to activate intracellular signaling and, thus, its biological effectiveness. In HEK293 cells, GH stimulation resulted in rapid and transient effects on pSTAT5b, pAKT and pERK1. Increasing the Tr/FL GHR ratios by transient transfection of a Tr GHR1-279 expression vector resulted in a significant dose-related inhibition of GH's ability to phosphorylate STAT5b, but with no significant inhibition of its ability to phosphorylate AKT and ERK1.These data suggest that Tr GHR can limit the target cell's STAT5b signaling in response to GH, while there is likely an alternative mechanism through which GH is able to activate AKT and ERK. This reveals a possible physiological role for Tr GHR in modulating GH's biological activity differentially in its target tissues. / La liaison de l'Hormone de Croissance humaine (GH) à son récepteur (GHR) sur les cellules cibles conduit à l'activation de trois voies de signalisation intracellulaires majeures: JAK2/STAT5, PI3K/AKT et ERK/MAPK. Cependant, en plus de la forme intégrale (FL) du GHR, il existe deux isoformes tronquées (Tr) du GHR, GHR1-279 et GHR1-277 qui ont perdu la majorité de leur domaine intracellulaire dû à l'épissage alternatif de l'ARNm du GHR. Alors que les études in vitro et in vivo suggèrent que les isoformes tronqués du GHR auraient un effet de dominant négatif sur le GHR FL en formant des hétérodimères stables, peu d'éléments sont connus au niveau de leurs fonctions physiologiques normales et de leurs effets sur les trois voies de signalisation majeure de GH. Nous avons émis l'hypothèse que les isoformes de GHR Tr auraient un rôle fonctionnel significatif dans les cellules et les tissus humains, en régulant de façon précise la capacité de GH à activer la signalisation intracellulaire et donc son efficacité biologique. Dans les cellules HEK293, la stimulation par GH a conduit à des effets rapides et transitoires sur pSTAT5b, pAKT and pERK1. L'augmentation des ratios Tr/FL du GHR par transfection transitoire du vecteur exprimant le GHR1-279 Tr a résulté en une inhibition significative et dépendante de la dose sur la capacité de GH à phosphoryler STAT5b, mais cependant sans inhibition significative sur sa capacité à phosphoryler AKT et ERK1. Ces données suggèrent que le GHR Tr peut limiter la signalisation par STAT5b dans la cellule cible en réponse à GH, tandis qu'il existerait probablement un mécanisme alternatif par lequel GH serait capable d'activer AKT et ERK. Cela révèle un possible rôle physiologique pour le GHR Tr dans la modulation de l'activité biologique de GH de façon différentielle dans ses tissus cibles.

The insulin-like growth factor (IGF) system is composed of two ligands (IGF-1 and IGF-2), two receptors (IGF-1R and IGF-2R) and six binding proteins (IGFBP-1 to -6). IGFs act as endocrine, paracrine and autocrine growth factors and stimulate cell growth, proliferation and metabolism. There is extensive evidence, both from in vitro and in vivo models as well as population studies, that IGF physiology is relevant to neoplasia. IGF-1R is the physiologic receptor for both ligands and its activation elicits a plethora of changes at the cellular level, such as activation of PI3K/AKT/mTOR and Ras/Raf/MAP kinase pathways. Given its role in the maintenance and promotion of neoplasia, the IGF system represents a potential target in the context of cancer therapy.Classically, IGFBPs have been described as carrier proteins for IGFs in the blood and other fluids. They can regulate IGF bioavailability both positively through increases in ligand half-life as well as negatively through competition with the IGF-1R for ligand binding. In addition to their classical roles, there is evidence suggesting that IGFBPs can act independently of IGFs by poorly characterized mechanisms. Additionally, epidemiologic studies have correlated overexpression of certain IGFBPs, in particular IGFBP-2, with poor prognosis in various cancers.Although the role of IGFBPs has been extensively studied in the context of both normal and malignant growth, this thesis describes several new aspects of IGFBPs in neoplasia. In the second chapter, we study the effect of the PI3K/AKT/mTOR cascade on IGFBP-2 gene expression in a breast cancer cell line in vitro. We demonstrate that activation of this pathway essentially leads to an Sp1-dependent increase in IGFBP-2 gene transcription. We further show that Sp-1 is phosphorylated upon PI3K/AKT/mTOR pathway activation and accumulates in the nucleus. In the third chapter, we study the effects of 2-deoxyglucose (2-DG) on IGF-1:IGFBP-3 complex formation. A recent publication suggested that 2-DG unexpectedly disrupted IGF-1:IGFBP-3 binding leading to increases in IGF-1R and AKT signaling in various cell lines. We show by three different techniques that neither 2-DG nor glucose affect IGF-1:IGFBP-3 complex formation. We additionally show that the 2-DG effects observed are not consistent between cell lines and likely the result of changes in intracellular signaling. In the fourth chapter, we study the effects of a novel therapeutic antibody (BI836845) with high affinity for both IGF-1 and IGF-2. In mouse serum samples ex vivo, we show that the addition of BI836845 leads to a shift of IGF-1 from the IGFBPs to the antibody. In vivo, we demonstrate that BI836845 binds the vast majority of IGF-1. Finally, we demonstrate that BI836845 induces a decrease in IGFBP-3 and an increase in growth hormone levels in C57 BL/6 mice. / L'ensemble du système de facteurs de croissance insulinomimétique (IGF) est composé de deux ligands (IGF-1 et IGF-2), de deux récepteurs (IGF- 1R et IGF-2R) et de six protéines de liaison (IGFBP-1 à 6). Les IGFs sont des hormones endocrines, paracrines et autocrines qui stimulent la croissance cellulaire, la prolifération et le métabolisme. Il existe un grand nombre d'études utilisant des approches épidémiologiques ou des modèles in vivo et in vitro qui démontrent l'importance des IGFs dans le contexte du cancer. Le IGF-1R est le récepteur physiologique des deux ligands et son activation mène à d'importants changements cellulaires tels que l'activation des voies de signalisation PI3K/AKT/mTOR et Ras/Raf/MAPK. Étant donné son rôle dans la promotion et dans la progression du cancer, le système des IGFs représente une cible potentielle pour le traitement du cancer. De façon classique, les protéines de liaison IGFBP ont été décrites comme de simples porteurs d'IGFs dans le sang et autres fluides. Les IGFBPs peuvent modifier la biodisponibilité des IGFs de façon positive en augmentant leur demi-vie ou de façon négative due à leur compétition avec le IGF-1R pour la liaison. En plus de leur rôle classique, il est de plus en plus évident que ces protéines peuvent agir de manière indépendante, mais les mécanismes impliqués restent flous. Également, il existe des études épidémiologiques qui ont corrélé la surexpression de IGFBPs, en particulier IGFBP-2, avec un pronostic défavorable dans plusieurs formes de cancer. Bien que le rôle des IGFBPs ait été largement étudié dans le contexte de la croissance normale et en néoplasie, la présente thèse révèle quelques nouveaux aspects de la physiologie des IGFBPs dans le contexte du cancer. En première partie, nous étudions l'effet de la voie de signalisation PI3K/AKT/mTOR sur l'expression du gène IGFBP-2 dans une lignée cellulaire de cancer du sein. Nous démontrons que l'activation de cette voie mène essentiellement à une augmentation de la transcription de ce gène de manière dépendante au facteur de transcription Sp-1. De plus, nous établissons que Sp-1 est phosphorylé par l'activation de la voie PI3K/AKT/mTOR et s'accumule dans le noyau. En deuxième partie, nous étudions les effets de la molécule 2-deoxyglucose (2-DG) sur la liaison entre IGF-1 et IGFBP-3. Un récent article avait suggéré un effet inhibitoire de cette molécule sur la formation de complexes IGF -1 :IGFBP-3. Nous démontrons par trois méthodes différentes que 2-DG ou la molécule apparentée glucose n'ont aucun effet sur la liaison entre IGF-1 et IGFBP-3. De plus, nous démontrons que les effets cellulaires de 2-DG sur l'activation de la voie PI3K/AKT/mTOR observées par les auteurs de l'article en question ne sont pas universels et sont probablement le résultat de signaux intracellulaires. Finalement, en dernière partie, nous étudions les effets d'un nouvel anticorps thérapeutique nommé BI836845 qui possède une grande affinité pour IGF-1 et IGF-2. Dans des échantillons de sérum de souris ex vivo, nous démontrons que l'ajout de BI836845 déplace IGF-1 des complexes naturels contenant les IGFBPs vers des complexes contenant l'anticorps. In vivo, nous démontrons que BI836845 lie la grande majorité d'IGF-1. Nous démontrons aussi que l'anticorps mène à une baisse de la concentration de IGFBP-3 et à une hausse de la concentration de l'hormone de croissance chez des souris C57 BL/6.

Tissue cohesion is achieved in part by a large family of plasma membrane-bound cell adhesion molecules (CAMs). During morphogenesis, CAM-mediated interactions provide adhesive forces required for cells to aggregate and form tissues. CAM-mediated adhesions in developing cells are highly dynamic, which provides the fluidity required for cellular movements that drive morphogenesis. Xenopus laevis gastrulation is an established model to study morphogenetic movements. During this phase of development, the mesoderm moves inside the embryo through involution, and migrates along the inner surface of the ectoderm while remaining separated from this tissue. Members of the Fagotto lab have identified the Xenopus orthologue of the Epithelial Cell Adhesion Molecule (EpCAM) in a gain-of-function screen to find gene products that cause aberrant ectoderm/mesoderm tissue mixing in the gastrula. EpCAM is a well known tumor-associated antigen that is specifically expressed in epithelial tissues, where its overexpression often correlates with malignancy. The initial aim of this thesis was to understand the molecular mechanism through which EpCAM promotes ectoderm/mesoderm tissue mixing. Overexpression of EpCAM in cells at the boundary increases their "invasive" behavior via a signaling property of its cytoplasmic domain (EpTAIL) that inhibits PKC signaling to promote cell motility. The most important findings of this thesis are that 1) EpTAIL inhibits PKC activity to promote cell motility and cell-cell adhesion by acting as a PKC pseudosubstrate domain that binds the enzyme on its catalytic site, and 2) this previously unknown mode of PKC inhibition is not specific to EpCAM as other PKC pseudosubstrate-mimicking plasma membrane proteins were identified and could potentially play important roles in the regulation of PKC activity. The data presented in this thesis further our understanding of EpCAM biology and unravel a new mode of PKC regulation that is valuable as PKCs are one of the major families of cytoplasmic kinases in cells. / Les mécanismes de liaison cellulaire sont établis en partie par une vaste famille de protéines d'adhésion cellulaire ou CAMs. Lors de la morphogenèse, les interactions induites par les CAMs créent des forces d'adhésion nécessaires afin que les cellules puissent s'agréger et former des tissues. Les adhésions induites par les CAMs dans les cellules en développement sont très dynamiques et offrent ainsi la fluidité nécessaire aux mouvements cellulaires qui régissent la morphogenèse. La gastrulation chez la grenouille Xenopus laevis sert de modèle d'étude des mouvements morphogéniques. Durant ce stade de développement, le mésoderme se déplace vers l'intérieur de l'embryon via un mouvement d'involution et migre le long de la paroi interne de l'ectoderme tout en maintenant une séparation des deux tissues. Des membres du laboratoire de Dr. Fagotto ont réussi à identifier un orthologue de la protéine «Epithelial Cell Adhesion Molecule (EpCAM) » chez Xenopus dans un tri de gain de fonction permettent d'identifier des protéines pouvant être à l'origine d'aberrations au niveau du maintien de la séparation de l'ectoderme et du mésoderme durant la gastrulation. EpCAM est un antigène associé aux tumeurs exprimé dans les cellules épithéliales et dont la surexpression corrèle avec des tumeurs malignes. L'objectif initial de cette thèse était de découvrir les mécanismes moléculaires pouvant expliquer l'effet de EpCAM sur les aberrations entre la séparation des tissues de l'ectoderme et du mésoderme. Une surexpression de EpCAM dans les cellules à la bordure de l'ectoderme et du mésoderme cause une augmentation du comportement « invasif » entre les deux tissues, via la fonction de transduction du signal de son domaine cytoplasmique (EpTAIL), qui inhibe le signal de la protéine PKC afin de promouvoir le mouvement cellulaire. Les principales contributions de cette thèse ont été 1) EpTAIL inhibe l'activité de PKC en jouant le rôle d'un pseudosubstrat de PKC en interagissant avec le site catalytique de l'enzyme, et 2) ce mécanisme d'inhibition jusqu'à présent inconnu pour PKC n'est pas seulement spécifique à EpCAM, car d'autres protéines membranaires possède également cette capacité à imiter le pseudosubstrat de PKC et pourraient potentiellement avoir un rôle important à jouer au niveau de la régulation de l'activité de PKC. Les donnée présentées dans cette thèse contribuent à approfondir davantage notre connaissance d'EpCAM et dévoilent un nouveau mécanisme de régulation de PKC qui pourrait être important puisque les molécules PKC forment l'une des plus importantes familles de kinases cytoplasmiques dans les cellules.

A major drawback of cartilage tissue engineering is that human mesenchymalStem cells (MSCs) from patients with osteoarthritis (OA) express high levels of type X collagen. Type X collagen is a marker of late stage chondrocyte hypertrophy, linked with endochondral ossification. Also, MSCs from OA patients express osteogenic marker genes such as alkaline phosphatase (ALK), bone sialoprotein (BSP), and osteocalcin (OC) as well as aggrecan (ACAN), a marker of chondrogenesis, but not type II collagen. OA patients, in an attempt to relieve pain and other symptoms, often take NSAIDs and pain relievers like acetaminophen. The aim of this present study was to determine how these drugs influence human MSC gene expression of different chondrogenic and osteogenic markers. MSCs isolated from the bone marrow of osteoarthritic patients or from normal donors were cultured in Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) supplemented with 10% fetal bovine serum (FBS) without or with Acetaminophen (Acet) or non-steroidal anti-inflammatory drugs (NSAIDs), Ibuprofen (Ibu), Diclofenac (Dic), Naproxen (Npx) and Celecoxib (Cele). After 3 days of culture, the cells were collected and gene expression was measured using quantitative PCR for type X collagen (COL10A1), aggrecan (ACAN) and type 1 collagen，as well as osteogenic marker genes such as alkaline phosphatase (ALP), bone sialoprotein (BSP), osteocalcin (OC) and Runt-related transcription factor 2 (RUNX2). Acet and Npx supplementation led to a significant increase in COL10A1 & RUNX2 expression when compared to control. Furthermore, with Ibu, Acet and Npx supplementation, aggrecan message levels were decreased. In contrast, addition of Cele significantly increased aggrecan gene expression. Finally, Ibu, Acet and Npx decreased type I collagen expression while Cele had a tendency to increase type I collagen expression. The present study showed that NSAIDs and Acet could affect Osteogenic and chondrogenic differentiation of human MSCs. These are features that could interfere with intervertebral disc (IVD) or cartilage repair. Thus, caution must be exercised when using MSCs from OA patients in biological repair of articular cartilage or disc. / Un des principaux problèmes de l'ingénierie tissulaire du cartilage réside dans le fait que les cellules souches mésenchymateuses humaines (hCSMs) de patients osteoarthritiques (OA) expriment fortement le collagène de type X (Col X) qui est un marqueur de l'hypertrophie des chondrocvytes, hypertrophie qui est associée à l'ossification. Les hCSMs de patients OA expriment également des marqueurs de l'ostéogénèse tels que la phosphatase alcaline (ALK), une sialoprotéine de l'os (BSP) et l'ostéocalcine (OC), ainsi que l'aggrécane (AGG), un marqueur de la chondrogenèse. Dans le but de diminuer la douleur et autres symptômes reliés à leur maladie, les patients OA consomment des drogues anti-inflammatoires non-stéroïdiennes (NSAIDs). Le but de la présente étude était de déterminer si ces drogues pouvaient influencer l'expression de gènes associés à la chondrogenèse ou à l'ostéogénèse dans les hCSMs. Les CSMs isolées de la moelle osseuse de patients OA ou de donneurs normaux ont été cultivées dans du milieu Eagle modifié selon Dulbecco (DMEM) supplémenté avec 10% de sérum de veau fétal (SVF), sans ou avec Acétominophène (Acét), Ibuprofène (Ibu), Dichlorofenac (Dic), Naproxen (Npx) et Célécoxib (célé). L'expression des marqueurs ostéogéniques et du Col X a été mesurée par PCR quantitatif après 3 jours en culture. Les résultats montrent que l'Acét et le Npx induisaient significativement l'expression du Col X et diminuaient, tout comme l'Ibu, l'expression de l'AGG et du Col de type I (Col I). Cependant, Célé stimulait de façon significative l'expression de l'AGG et inhibait, mais de façon non significative, l'expression du Col I. En résumé, la présente étude montre que les NSAIDs peuvent moduler l'expression de gènes associés à l'ostéogénèse et à la chondrogenèse dans les hCSMs, indiquant qu'ils pourraient interférer dans la réparation du cartilage. L'utilisation de hCSMs de patients OA devrait donc être faite avec prudence pour la réparation biologique du cartilage articulaire et même du disque intervertébral.