The eukaryotic cell cytoskeleton plays many important roles in cells and their coordination is crucial for these important biological processes. Their functions are partially achieved by the actin-microtubule (MT) cross-linking proteins. Growth-arrest-specific (Gas) 2 was originally identified in murine fibroblasts under growth-arrest conditions. Gas2 protein contains putative actin- and MT-binding domains, which makes it a strong candidate to be an actin-MT cross-linking protein. However, the mechanisms of Gas2 cytoskeleton binding and its roles in cell division are still unclear. This thesis is focused on these questions. In Chapter 2, we have determined the Gas2 protein functions in Xenopus laevis embryo cell division and oocyte wound healing process. We have found that the full-length (FL) Gas2 protein and its MT-binding Gas2 domain, but not the actin-binding calponin homology (CH) domain, inhibit cell division and result in multinucleated cells. The observation that Gas2 domain alone can arrest cell division suggests that FL-Gas2 function is mediated by binding MTs. To investigate the mechanism of Gas2-induced cell division arrest, we have used a wound-induced contractile array assay and showed that FL-Gas2 stabilizes MTs. In Chapter 3, we have further investigated the FL-Gas2 protein cytoskeleton binding mechanisms in HeLa cells. The Gas2 domain itself significantly changes MTs morphology into a long loop-like bundled network. The FL-Gas2 facilitates MT polymerization and changes the dynamic behaviors of MTs. There are three protein kinase C (PKC) phosphorylation sites in the FL-Gas2 protein, and phosphomimetic point mutations reveal that all three are involved in the FL-Gas2 protein functional changes. Size-exclusive chromatography finally reveals that the FL-Gas2 protein forms a dynamic complex, which presumably has an important role in its cytoskeleton binding properties. Taken together, our data suggest that the non-phosphorylated FL-Gas2 protein forms a dynamic complex to bundle MTs, but its ability to cross-link F-actin and MTs is achieved by the phosphorylated FL-Gas2 protein. We propose that Gas2 function is mediated by binding and bundling MTs, leading to cell division arrest. / Le cytosquelette participe à de nombreuses fonctions dans les cellules eucaryotes et sa bonne coordination est essentielle au bon fonctionnement de ces fonctions biologiques. Ces fonctions sont partiellement accomplies grâce aux protéines de liaisons des filaments actine-microtubule (MT). La protéine Gowth-arrest-specific (Gas) 2 a été originellement identifiée dans des fibroblastes murins en arrêt de croissance. Le fait que la protéine Gas2 contienne des domaines putatifs d'intéractions avec actine et les microtubules supporte l'hypothèse qu'elle agit comme protéine de liaison des filaments actine-microtubule. Cependant, les mécanismes que Gas2 utilise pour interagir avec le cytosquelette et participer à la division cellulaire ne sont pas connus. Cette thèse répond à ces questions.Dans le deuxième chapitre, nous avons démontré que la protéine Gas2 participe à la division cellulaire de l'embryon et à la cicatrisation de la plaie de l'ovocyte chez le Xenopus laevis. Nous avons trouvé que la protéine entière (FL) Gas2 et son domaine d'intéraction avec les microtubules, mais pas son domaine d'intéraction avec actine homologue a calponine (CH), inhibent la division cellulaire et résultent en la formation de cellules multinucléées. Nous déduisons du fait que le domaine de Gas2 puisse causer un arrêt de la division cellulaire à lui seul que la protéine entière FL-Gas2 fonctionne grâce à l'intéraction avec les microtubules. Pour étudier comment Gas2 induit l'arrêt de la division cellulaire, nous avons utilisé un essai d'induction de contraction par cicatrisation et démontré que FL-Gas2 stabilise les microtubules. Dans le troisième chapitre, nous avons étudié en détails comment la protéine FL-Gas2 interagit avec le cytosquelette dans les cellules HeLa. Le domaine de Gas2 change dramatiquement la morphologie des microtubules, celles-ci forme un réseau de boucles longues et regroupées. La protéine FL-Gas2 favorise la polymérisation des microtubules et change leur comportement dynamique. Il existe trois sites de phosphorylation par la protéine kinase C (PKC) dans FL-Gas2. Des points de mutations imitant la phosphorylation de ces trois sites ont démontré que les trois sites participent aux changements de fonctionnalité de FL-Gas2. La chromatographie par exclusion de taille a démontré que FL-Gas2 forme un complexe dynamique qui doit jouer un rôle important dans l'intéraction de la protéine avec le cytosquelette.En conclusion, nos résultats suggèrent que la protéine FL-Gas2 non-phosphorylée forme un complexe pour regrouper les microtubules, et qu'elle crée une liaison entre F-actine et les microtubules lorsqu'elle est phosphorylée. Nous formulons hypothèse que Gas2 agit en intéragissant et en regroupant les microtubules ce qui cause un arrêt de la division cellulaire.

Lipid droplets (LDs) are phylogenetically conserved and ubiquitous organelles with many cellular functions. In the last two decades, our understanding of LD biology and of their roles in physiological processes has increased dramatically. In addition, increasing evidence suggests that LDs are highly involved in inflammatory processes, and in metabolic disorders such as type 2 diabetes mellitus (T2DM). Despite such advancement, many aspects of LD biology and of their roles in health and disease remain unknown.The core of LDs is highly enriched with neutral lipids and these can be mobilized to provide metabolic energy. The phospholipid monolayer surrounding the LD core is associated with a wide variety of proteins, including structural and signaling proteins, as well as metabolic enzymes. While LDs may be induced by physiological stimuli such as dietary fatty acids, they can also be formed under stressful conditions, in the absence of such fatty acids. However, exactly how cellular stress leads to LD accumulation remains unclear. Our main objective is to understand the regulation of LD formation under stressful conditions, specifically oxidative stress, inflammation, and metabolic stress. We first investigated LDs in cells exposed to environmental stressors, namely cytotoxic metallic nanoparticles and reactive oxygen species. LD formation and expression of perilipin-2, a key structural LD protein, were highly increased in rodent cells exposed to these stress agents. Interestingly, supplementation with antioxidant N-acetyl cysteine or pharmacological inhibition of p38 mitogen activated protein kinase (MAPK) reduced stress-induced LD accumulation, suggesting that oxidative stress and p38 MAPK activation play a role in the induction of LD formation. Inflammatory leukocytes and macrophages contain a large number of LDs. While this phenomenon has been widely investigated in peripheral immune cells, its explanation remains elusive in immune cells of the central nervous system. We therefore investigated LD dynamics and regulation in microglia, the resident immune cells in the brain. We found that stimulation of microglia with toll-like receptor 4 (TLR4) agonist, lipopolysaccharides (LPS), increased LD formation and perilipin-2 expression in an Akt and p38 MAPK-dependent manner. Interestingly, LPS-induced LDs extensively colocalized with cytosolic phospholipase A2-α (cPLA2-α), a key enzyme involved in the synthesis of eicosanoids, which are inflammatory lipid mediators. Collectively, these findings imply that LD formation may contribute to increased eicosanoid synthesis in activated microglia and could be microglial biomarkers of inflammation in the central nervous system. To gain a better insight into the role of LDs in human pathology, we sought to examine alterations in LD metabolism in pancreatic tissue obtained from T2DM and obese individuals. Immunohistochemical studies revealed increased islet and extra-islet perilipin-2 expression in tissues from lean or obese T2DM donors, but not in non-T2DM obese donors, suggesting that the diabetic status, but not the obesity status, is a requirement for increasing perilipin-2 expression and LD formation. Gene expression analysis by RT-qPCR confirmed the increase in perilipin-2 expression and revealed significant alterations in several genes related to islet function, metabolism and antioxidant defense. These alterations seem to be consistently associated with obesity and T2DM and imply an adaptive and compensatory response to insulin resistance and metabolic stress. In summary, our studies show that LDs are an integral part of the adaptive cellular response to oxidative, inflammatory and metabolic stress. Perhaps, the most important challenge in LD research in the upcoming decade will be to determine how the subcellular lipid and protein composition of this organelle affects its function in different cells. / Les gouttelettes lipidiques (GL) sont des organites phylogénétiquement conservées et impliquées dans plusieurs fonctions cellulaires. Durant les deux dernières décennies, notre compréhension des rôles biologiques et physiologiques des GL a augmenté de manière draconienne. Plusieurs observations suggèrent fortement que les GL jouent un rôle important dans l'inflammation, ainsi que dans les désordres métaboliques tels que le diabète de type 2 (DT2). Malgré cette avancée, plusieurs aspects de la biologie des GL et de leurs rôles dans des maladies demeurent méconnus.Le centre des GL est riche en lipides neutres qui peuvent se mobiliser et servir comme source d'énergie. La couche phospholipidique entourant le centre de la GL est associée à plusieurs protéines et enzymes métaboliques. Bien que les GL puissent être induites par des acides gras, elles peuvent aussi l'être dans des conditions de stress. Par contre, les mécanismes de l'accumulation de GL par des conditions de stress ne sont pas encore bien compris. Notre objectif principal est de comprendre la régulation de la formation de GL par le stress oxydatif, l'inflammation et le stress métabolique. Premièrement, nous avons investigué les GL dans des cellules exposées à des stresseurs tels que des nanocrystaux métalliques et des dérivés réactifs d'oxygène. La formation de GL et l'expression de perilipin-2, qui est une protéine structurelle des GL, ont tous deux augmenté dans les cellules stressées. De plus, une supplémentation en antioxydant (n-acétylcystéine) ou un traitement avec un inhibiteur de p38 MAPK a réduit l'accumulation de GL causée par le stress. Ces observations suggèrent que le stress oxydatif et p38 MAPK jouent un rôle dans l'accumulation de GL dans des cellules stressées. Il est bien connu que les leucocytes et macrophages qui sont engagés dans l'inflammation contiennent une grande quantité de GL. Même si ce phénomène a bien été exploré dans les cellules immunitaires périphériques, il reste inexploré dans le système nerveux central (SNC). Ce faisant, nous avons investigué la dynamique et la régulation des GL dans les microglies, les cellules résidentes immunitaires dans le cerveau. Nous avons trouvé que dans les microglies stimulées avec les lipopolysaccharides (LPS), les GL et l'expression de perilipin-2 ont augmenté d'une manière dépendante de l'activation de l'Akt et p38 MAPK. Dans ces cellules activées, la phospholipase cytosolique A2-α (PLC A2-α), une enzyme fonctionnant dans la synthèse d'éicosanoides, des médiateurs lipidiques inflammatoires, colocalisait avec les GL. Ensemble, ces résultats indiquent que la formation de GL pourrait contribuer à la synthèse d'éicosanoides dans les microglies activées et servir de biomarqueurs d'inflammation dans le SNC.Pour mieux comprendre le rôle des GL dans la pathologie humaine, nous les avons examinées dans des tissues pancréatiques provenant de patients obèses ou diabétiques T2. Nos études immunohistochimiques ont révélé une augmentation de perilipin-2 dans les îlots de Langerhans chez les patients diabétiques obèses ou maigres, mais pas dans ceux de patients non-diabétiques. Ceci suggère que le DT2, mais non l'obésité, est requis pour une augmentation de perilipin-2 dans le pancréas. L'analyse d'expression de gènes par RT-PCR a confirmé l'augmentation de perilipin-2 observé antérieurement dans les îlots et a également révélé des altérations dans des gènes reliés aux fonctions des îlots, au métabolisme, et aux défenses anti-oxydantes. Ces changements, qui sont souvent associés à l'obésité et au DT2, constituent un mécanisme d'adaptation à la résistance à l'insuline et au stress métabolique.Pour résumer, nos études démontrent que l'accumulation de GL fait partie intégrante de l'adaptation des cellules au stress. Durant la prochaine décennie, le plus grand obstacle dans la recherche sur les GL sera de déterminer comment la composition lipidique ou protéinique de ces organites affecte leurs fonctions biologiques.

Centrosome duplication is coupled with cell division to ensure that centrosome is duplicated only once per cell cycle. This coupling, however, can be altered in specific developmental contexts although how this uncoupling occurs remains generally unclear. In C. elegans, the larval intestinal and the hypodermal cells will endocycles, while germ line stem cells eventually exit mitosis and enter meiosis. We use these models to better understand how the centrosome is intimately coupled to the cell cycle and the mechanisms though which the duplication of the centrioles can be uncoupled from cell division during the course of development.By monitoring the levels of SPD-2, a protein that is critical for centriole duplication in C. elegans, we found that the centriole duplicates normally at the intestinal cell nuclear division, but does not re-duplicate during the first endocycle, Subsequently SPD-2 becomes diffuse within the nucleus before it is subsequently eliminated. These dynamic changes seem to be actively regulated since they are not observed in situations of un-quantized DNA re-replication. To test whether cell cycle regulators might regulate centrosome/cell cycle uncoupling and elimination, we generated phosphomimetic and non-phosphorylable variants of SPD-2. We found that altering the highly conserved CDK-phosphorylation site of Serine 545 uncouples the centriole duplication/cell cycle coupling, whereas mimicking PLK-mediated phosphorylation or reducing the activity of ubiquitylation pathway by RNAi leads to nuclear accumulation of SPD-2 potentially by stabilizing SPD-2 without affecting centrosome duplication and uncoupling. Overall our study reveals that phosphorylation of SPD-2 by key cell cycle kinases may regulate centrosome/cell cycle uncoupling and elimination during in C.elegans development.Secondly, we studied the role of RNF-1, a RING-domain protein that interacts with Cip/Kip family member CKI-2 in C. elegans. We found that RNF-1 mediates the ubiquitylation of CKI-2, which consequently results in its proteasome-dependent degradation. Consistent with this, RNF-1 reduces the embryonic lethality caused by misexpression of CKI-2. We also found that RNF-1 is localized at nuclear periphery, although the significance of this localization still requires further characterization.Finally, we analyzed the localization and the function of γ-tubulin during germ cell progression. We found that γ-tubulin undergoes a re-distribution from its association with the centriole to germ cell membrane at the onset of meiosis. This re-distribution causes the centriole to lose its microtubule nucleating capacity and appears to be triggered by signals that occur during the mitosis-meiosis transition. We are continuing a characterization of the significance and the mechanism of this re-distribution. / La duplication des centrosomes est couplé à la division cellulaire afin qu'elle n'ait lieu qu'une seule fois par cycle cellulaire. Cependant, lors de certains contextes développementaux, ce couplage n'a pas lieu et ceci reste mal compris à ce jour. Chez C. elegans, alors que les cellules hypodermales et intestinales font de l'endo-replication, les cellules souches germinales sortent de la mitose pour entrer en méiose. L'utilisation de ces différents modèles cellulaires, nous permet de mieux comprendre comment la duplication des centrosomes est dans la plupart des cas intimement couplée au cycle cellulaire, et d'étudier les mécanismes où la duplication des centrioles est indépendante à la division cellulaire au cours de contextes développementaux particuliers.SPD-2 est une protéine essentielle à la duplication des centrioles chez C.elegans. En observant ses niveaux d'expression, nous avons pu montré qu'alors que les centrioles sont correctement dupliqués lors de la division des cellules intestinales, ils ne se re-dupliquent pas au cours du 1er-cycle d'endo-replication. En effet, SPD-2 diffuse dans le noyau, avant d'être éliminé. Cette dynamique semble être activement régulée, car elle n'est pas observée dans des situations où l'ADN est très anormalement répliqué. Afin d'étudier l'importance des régulateurs du cycle cellulaire dans ce découplage centrosome/cycle cellulaire, nous avons généré des variants SPD-2, phosphomimétiques ou non-phosphorylables. De manière très intéressante, la modification de la serine 545, site très conservé pour la phosphorylation par CDK, entraine le découplage de la duplication du centriole par rapport au cycle cellulaire. Au contraire, en mimant la phosphorylation par PLK ou en diminuant l'activité de la voie de l'ubiquitylation, par ARNi, la protéine SPD-2 s'accumule dans le noyau. Cette accumulation est probablement due à la stabilisation de la protéine, mais elle n'affecte pas la duplication du centrosome. Notre étude révèle donc l'importance des phosphorylations de SPD-2 par différentes kinases clés du cycle cellulaire dans la régulation son activité. En effet, celles ci pourraient réguler le découplage de la duplication des centrosomes du cycle cellulaire et affecter leur élimination au cours du développement chez C. elegans.Parallèlement, nous nous sommes aussi intéressé au rôle de RNF-1, une protéine contenant des domaines RING qui interagit avec CKI-2, un membre de la famille Cip/Kip. Nous avons démontré que RNF-1 joue un rôle crucial dans l'ubiquitylation de CKI-2, qui est alors dégradé par la voie du protéasome. Ainsi, l'expression de RNF-1 réduit la létalité embryonnaire causée lors d'une mauvais expression de CKI-2. RNF-1 se localise à la périphérie du noyau, toutefois la fonction associée à cette localisation nécessite une étude plus approfondie.Finalement, nous avons etudié le rôle de la γ-tubuline au cours de la progression des cellules germinales. Nous avons trouvé que la γ-tubuline est redistribuée depuis sa localisation centriolaire vers la membrane cytoplasmique des cellules germinales pendant la méiose. Cette redistribution inhibe les capacités du centriole à générer la nucléation des microtubules, ceci résultant probablement de signaux transmis lors de la transition entre la mitose et la méiose. Nous continuons notre travail afin de comprendre le rôle et les mécanismes impliqués dans cette redistribution.

The Src kinases are non-receptor tyrosine kinases involved in many epithelial processes in both normal and injured cells. Src was originally identified as a viral oncogene and has since been characterized as an important regulator of cellular proliferation, differentiation, and motility. Our lab has previously demonstrated that the Src kinases are important modifiers of gene expression in tubule cells of the kidney during ischemia-reperfusion injury. The signalling events that control and mediate the Src kinase transcriptional response in renal epithelial cells are not well understood. In this thesis, I have identified two novel negative regulators of the Src transcriptional response in renal epithelial cells. In Manuscript I and II, I demonstrate that the adapter protein Dok-4 can act as an inhibitor of Src-mediated transcription. Unlike most other adapter proteins, several members of the Dok family are primarily characterized by their inhibitory actions downstream of active tyrosine kinases. Despite being the most ubiquitously expressed Dok family member, Dok-4 function has remained elusive as few interacting proteins have been identified. In Manuscript I, we found that the previously defined boundaries of the Dok-4 PTB domain needed to be extended for proper function. We demonstrate that the PTB domain of Dok-4 contains an extended C-terminal alpha helix critical for canonical PTB-mediated interaction and identified the lipid phosphatase Ship1 as a novel partner of this redefined Dok-4 PTB domain. This interaction is greatly increased in the presence of active Src kinases and occurs through a canonical NPXpY motif present in the C-terminal region of Ship1. In contrast to the Dok-4-Ship1 interaction, in Manuscript II we present a non-canonical PTB-mediated interaction between Dok-4 and the nuclear transcription factor, Elk4. This interaction leads to relocalization of Elk4 from the nucleus to the cytoplasm and degradation of full-length Elk4. In renal cells, Dok-4 inhibits Src-mediated activation of Elk4 and represses expression of the immediate early genes, such as egr-1 and fos1, as well as some of their transcriptional targets. In agreement with this data, knock-down of Dok-4 was associated with increased proliferation of renal epithelial cells. During renal ischemia-reperfusion injury, where upregulation of immediate early genes is known to occur, we have for the first time detected a strong activation of the Src kinases and a delayed upregulation of Elk4, suggesting that Elk4 may be not only highly expressed, but also highly active. Dok-4, which is expressed in the kidney, may be essential for limiting damage to the kidney caused by Elk4-induced expression of the immediate early genes. In addition to activating transcription of the immediate early genes, we have previously shown that the Src kinases are responsible for transcriptionally upregulating the receptor tyrosine kinase, EphA2, during renal ischemia-reperfusion injury. In the preliminary manuscript presented here, we observed that while the Src kinases are highly active, the Stat proteins, downstream effectors of the Jak kinases, are dephosphorylated and inactive. As a corollary of this observation, overexpression of all three ubiquitous Jak family members, Jak1, Jak2 and Tyk2 could attenuate Src-mediated activation of the EphA2 promoter. Inhibition of endogenous Jak kinase by siRNA-mediated knock-down or incubation with the pharmacological inhibitor, Jak inhibitor I also activated EphA2 transcription. Surprisingly, Jak-mediated inhibition of EphA2 expression occurs independently of the Stat family and the cytokine receptors. Collectively, this thesis identifies two novel regulators of the Src kinase family in renal epithelial cells, the Dok-4 adapter protein and the family of Jak kinases. / Les kinases Src sont des tyrosine-kinases cytosoliques qui sont impliquées dans multiples processus dans les cellules épithéliales et autres. Originalement identifiée comme un oncogène viral, la kinase Src est maintenant caractérisée comme une régulatrice de la prolifération, la différenciation et la motilité cellulaire. Nous avons précédemment montré que les kinases Src sont capables de modifier l'expression génique dans les tubules des reins durant le domage rénal par ischémie et réperfusion. Cependant, les mécanismes de signalisation qui contrôle la réponse transcriptionelle des kinases Src ne sont pas bien compris. La présente thèse décrit deux nouveaux inhibiteurs endogènes de la famille de kinases Src dans les cellules rénale épithéliales.Les deux premiers manuscrits établissent que la protéine adaptatrice Dok-4 fonctionne comme un inhibiteur des kinases Src. Contrairement à la plus part de protéines adaptatrices, la famille Dok est caractérisée par des actions inhibitrices durant la signalisation par les tyrosines kinases. Malgré que Dok-4 soit le membre de la famille Dok exprimé de manière la plus ubiquitaire, sa fonction est encore mal connue. Le premier manuscrit que je présente (Manuscrit I) décrit le domaine PTB de Dok-4. On y a démontré que le domaine PTB contient une extension C-terminal consistant probablement en une hélice alpha et que celle-ci est essentielle pour les interactions canoniques du domaine PTB de Dok-4. De plus, nous avons identifié la phosphatase lipidique Ship1 comme un nouveau partenaire de ce domaine PTB redéfini. Cette interaction est augmentée quand les kinases Src sont actives et elle implique un motif NPXpY dans la région C-terminale de Ship1. Contrairement à l'interaction entre Dok-4 et Ship1, l'interaction décrite dans le deuxième manuscrit (Manuscrit II) entre Dok-4 et le facteur de transcription, Elk4, implique le domaine PTB, mais se fait dans une manière atypique. L'interaction entre Dok-4 et Elk4 induit la relocalisation d'Elk4 du noyau au cytoplasme et cause la dégradation de la protéine Elk4. Dans les cellules rénales, Dok-4 inhibe l'activation d'Elk4 par les kinases Src et réprime l'expression des gènes de réponse précoce ("immediate early genes"), comme egr-1 et fos, et quelques cibles transcriptionelles de ces gènes. En accord avec ces données, suppression de Dok-4 est associée avec une augmentation de prolifération. En utilisant un modèle in vivo d'ischémie-reperfusion rénale, où la surexpression de gène de réponse précoce a déjà été démontrée, nous avons détecté une forte activation des kinases Src suivie d'une augmentation retardée de l'expression d'Elk4 dans les lysates de reins. Ces données suggèrent que dans ce modèle Dok-4 pourrait être critique pour limiter les dommages aux reins causé par l'induction des gènes de réponse précoce par Elk4. En plus d'activer l'expression des gènes de réponse précoce, nous avons précédemment montré que les kinases Src sont impliquées dans l'induction transcriptionnelle du récepteur tyrosine-kinase, EphA2, durant l'ischémie-reperfusion rénale. Dans le manuscrit préliminaire que je présente, nous avons noté que dans un modèle de déplétion et réplétion d'ATP, les kinases Src sont activées et les protéines Stat, des effecteurs des kinases Jak, sont déphsophorylés et inactives. Comme corollaire de cette observation, la surexpression de trois membres de de la famille Jak inhibent l'activation du promoteur d'EphA2 par les Src kinases. En plus, l'inhibition des kinases Jak endogènes par traitement aux siRNA ou par un inhibiteur pharmacologique, Jak Inhibitor I, active le promoteur d'EphA2. Étonnement, l'inhibition de l'expression d'EphA2 par les kinases Jak se fait indépendamment des protéines Stat et les récepteurs à cytokines. Mises ensemble, les données de cette thèse démontrent deux nouveaux inhibiteurs de la famille Src dans les cellules rénales épithéliales, la protéine adaptatrice, Dok-4 et les kinases, Jak1 et Jak2.

Cell physiology and survival critically depend on mechanisms that regulate the development and maintenance of polarity, which is manifested by the asymmetric distribution of proteins or organelles to specific sub-cellular compartments. A prime example of this is observed in mammalian photoreceptor cells, where the proteins involved in the phototransduction cascade are housed exclusively in a specialized primary cilium called the outer segment (OS). Despite the importance of polarized protein trafficking in photoreceptor physiology and disease, the mechanisms regulating this process remain largely unknown. Recent studies have shown that Numb, an endocytic adapter protein, is an essential regulator of directional protein trafficking in migrating cells and neurons, raising the possibility that it might be involved in OS protein sorting. Consistent with this idea, we find that Numb is expressed in the inner segment (IS) of rod photoreceptors, where proteins involved in phototransduction are synthesized. To study the role of Numb in photoreceptors, we used the Cre/lox system to generate double conditional knockout (dcKO) mouse in which the Numb and Numblike (Nbl, a homolog of Numb) genes are specifically inactivated in postmitotic rod photoreceptors. While rod OS disk membrane proteins traffick normally in Numb Nbl dcKO photoreceptors, the cyclic nucleotide-gated channel (CNGC), which normally localizes to the plasma membrane of rod OS, was also found localized to the IS plasma membrane. Since CNGC was also observed in this region in wildtype rod photoreceptors, albeit at much reduced levels, these results suggest a model in which the Numb/Nbl-mediated endocytosis of CNGC promotes trafficking to the OS. Consistent with this possibility, we found that Numb and CNGC physically interact both in vitro and in vivo, and that overexpressing Numb in a heterologous cell culture assay increases the pool of CNGC trafficked to early endosomes. Together, these results support a new model implicating polarized endocytosis in OS plasma membrane protein sorting in mouse rod photoreceptor cells. CNGC is critical for photoreceptor function in the retina and in addition, since Numb Nbl dcKO photoreceptors ultimately undergo progressive degeneration, our findings could have important implications in our understanding of the pathophysiology leading to retinal degeneration in humans. / Le fonctionnement et la survie de la cellule dépendent de mécanismes régulant le développement et le maintien de la polarité, laquelle se définit par la distribution asymétrique des protéines ou organelles à des compartiments cellulaires précis. Un excellent exemple de ceci peut être observé dans les photorécepteurs des mammifères. En effet, les protéines impliquées dans la cascade de phototransduction, qui est un processus essentiel à la vision, se retrouvent exclusivement dans un cilium primaire spécialisé nommé « segment externe ». Malgré son importance physiologique et son implication dans les troubles de la vision, les mécanismes contrôlant le triage directionnel et la polarisation des protéines demeurent peu connus. Toutefois, de récentes études ont démontré que Numb, une protéine adaptatrice endocytique, joue un rôle dans le contrôle directionnel du trafic des protéines dans les cellules en migration et les neurones, d'où l'idée qu'elle pourrait aussi être impliquée dans le triage des protéines du segment externe. Conformément à cette idée, nous avons trouvé que Numb est exprimée dans les segments internes des bâtonnets - un type de photorécepteurs – où les protéines impliquées dans la phototransduction sont synthétisées. Afin d'étudier le rôle de la protéine Numb dans les photorécepteurs, nous avons utilisé le système Cre/lox afin de produire une souris transgénique (conditional knock-out ou cKo) chez laquelle le gène Numb a été spécifiquement déplété dans les bâtonnets. Nos résultats démontrent que la vaste majorité des protéines membranaires du segment externe se déplacent normalement dans les bâtonnets de la souris Numb cKo. Toutefois, on dénote une accumulation de la protéine CNGC (cyclic nucleotide-gated channel, i.e. le canal à fonctionnement contrôlé par les nucléotides cycliques) au niveau du segment interne. Fait à noter, CNGC localise normalement au niveau de la membrane plasmique du segment externe des bâtonnets. Étant donné que le CNGC a aussi été observé - bien qu'à des niveaux largement réduits - dans cette région dans les bâtonnets des souris de type sauvages, ces résultats suggèrent l'existence d'un modèle selon lequel l'endocytose de CNGC par Numb pourrait favoriser le trafic vers le segment externe. Conformément à cette possibilité, nous avons trouvé que Numb et CNGC interagissent in vitro et in vivo, et que la surexpression de Numb dans un dosage de culture de cellules hétérologues augmente le niveau de CNGC situé dans les endosomes précoces. Conséquemment, ces résultats soutiennent un nouveau modèle selon lequel Numb régulerait la polarisation cellulaire via l'endocytose et le triage directionnel des protéines de la membrane plasmique des segments externe des bâtonnets des souris. Par ailleurs, puisque les photorécepteurs des souris Numb cKo subissent ultimement une dégénérescence progressive, cette étude pourrait avoir un impact important sur notre compréhension de la pathophysiologie menant à la dégénérescence maculaire chez l'humain.

Telomeres and telomerase stand at a junction of cellular processes that govern aging, cancer and disease. Premature aging syndromes and age-related diseases are characterized by short telomeres which compromise cell function and viability, whereas cancer cells are able to reactivate telomerase or alternative lengthening of telomeres (ALT) mechanisms to maintain their telomeres and become immortal.Telomeres and telomerase represent very attractive targets for the development of anticancer therapies. However, there is concern that these therapies may lead to cell resistance, including the reactivation of telomerase or ALT in telomerase-positive cells. Here we show that telomeric recombination can be promoted by telomere-induced dysfunction, an anticancer strategy currently in development, despite the presence of an active telomerase. Our results highlight an important potential mechanism of cancer cell resistance, but might also help to understand the interplay between telomerase and the ALT pathway in the cell. Defective telomere maintenance is associated with premature or accelerated-aging disease. Mutations in almost every component of the telomerase holoenzyme have been found to be implicated in Dyskeratosis congenita (DC), revealing the importance of a functional telomerase for stem cell maintenance and cell proliferative potential. We found that the telomerase component dyskerin is sumoylated on highly conserved lysines and that lysine-to-arginine dyskerin mutants reproduce the phenotype observed in DC. Our findings identify that impaired post-translational modifications can lead to DC, and importantly point to new possibilities in the treatment of DC.Finally, we investigated the complex relationship between telomere maintenance, frailty and cardiovascular disease. We examined the feasability of measuring telomere length as a predictor of morbidity in elderly patients undergoing cardiac surgery. Our preliminary data do not identify telomere length as a predictor of surgery outcomes. Our findings also suggest that telomere length measurement in an epidemiological/clinical context must be interpreted with great caution. / Les télomeres et la télomérase se rencontrent à la jonction de processus cellulaires qui régulent le vieillissement, le cancer et certaines maladies. Plusieurs maladies de vieillissement précoce ou maladies associées au vieillissement sont caractérisées par la présence de courts télomères, qui compromettent la viabilité et la fonction de la cellule, alors que les cellules cancéreuses sont capables de réactiver la télomérase ou un mécanisme alternatif d'élongation des télomères (ALT) pour maintenir leurs télomères et devenir immortelles. Les télomères et la télomérase représentent des cibles très attrayantes pour le développement de thérapies anti-cancer. Il existe toutefois certaines possibilités que ces thérapies conduisent au développement d'une résistance chez la cellule. Ces mécanismes de résistance peuvent inclure la réactivation de l'enzyme télomérase ou réactivation du mécanisme ALT dans les cellules télomérase-positives. Nous démontrons que la recombination des télomères peut être induite par une dysfonction des télomères, une stratégie anti-cancer présentement en développement, et cela malgré la présence de télomérase dans la cellule. Nos résultats mettent l'emphase sur un mécanisme potentiel de résistance, et pourraient aussi permettre de mieux comprendre comment le mécanisme ALT et la télomérase sont régulés dans la cellule. Un maintien déficient des télomères est associé aux maladies de vieillissement précoce ou accéléré. Des mutations dans la majorité des composants de l'enzyme télomérase ont été retrouvées chez des patients atteints de Dyskératose congénitale (DC), révélant l'importance d'une télomérase fonctionnelle pour la fonction des cellules souches et le potentiel réplicatif des cellules. Nous avons identifié que la protéine dyskérine est sumoylée sur des lysines hautement conservées et que la présence de protéines mutantes dans la cellule imite les phénotypes associés à la maladie DC. Nos résultats démontrent qu'un défaut de modifications post-traductionnelles peut conduire à la maladie DC mais surtout, identifient de nouvelles possibilités pour le traitement des patients atteints de DC. Finalement, nous avons investigué la relation complexe qui existe entre le maintien des télomères, la fragilité et les maladies cardiovasculaires. Nous avons examiné le potentiel de mesurer les télomères pour prédire la mortalité et morbidité chez des patients âgés sur le point de subir une chirurgie cardiaque. Nos résultats préliminaires indiquent que la taille des télomères ne peut servir à prédire l'issue d'une chirurgie cardiaque. Nos résultats suggèrent que l'utilisation de la taille des télomères comme marqueur dans un contexte épidémiologique ou clinique doit être étudiée et interprétée avec précaution.

Coxsackie and adenovirus receptor (CAR), a binding receptor shared by subfamilies of Coxsackie viruses and adenoviruses, is an adhesion molecule which plays critical roles in development. CAR is also a putative tumor suppressor, and its expression is silenced or downregulated in a variety of tumor types. However, it is not known how CAR exerts its physiological functions. Our lab has previously reported that CAR is a potent suppressor of glioma cell migration, invasion and tumor growth in vivo, and that the cytoplasmic domain of CAR is required for these inhibitory effects, but the underlying mechanism is not entirely understood.In this thesis, we focused on characterizing the role of the four tyrosine residues, Y269, Y294, Y313 and Y318 in the cytoplasmic domain of CAR. These tyrosines were individually mutated to alanines, followed by expression in a CAR-negative glioma cell model. We found that while Y269 plays a role in mediating adenovirus infection, Y294 plays a role in STAT5 signaling during glioma cell migration. In the context of our studies on Y294, we observed that wild-type CAR inhibits STAT5 activation, its nuclear translocation, expression of its target genes and cell migration induced by growth factors, such as epidermal growth factor (EGF) and insulin growth factor 1(IGF-1). In contrast, Y294A abrogated the inhibitory function of CAR in STAT5 activation, target gene expression and cell migration, suggesting that Y294 is critical for CAR regulation of STAT5 signaling during cell migration. During these studies we also observed that introduction of wild-type CAR into various glioma cell lines invariably resulted in a decrease in the size of the cell nucleus. Three-dimensional reconstruction of confocal images further revealed that nuclear volume was diminished in CAR-expressing cells. Importantly, specific knockdown and conditional knockout of CAR in primary astrocytes resulted in increased nuclear size, suggesting that CAR-mediated nuclear size control is physiologically relevant. CAR localization on the plasma membrane was required for its effect on nuclear size, which could be abrogated by incubation of cells with a neutralizing antibody against the extracellular domain of CAR. We show that an intact cytoplasmic domain, specifically the distal 26 amino acids, is essential for control of the nuclear size in CAR-expressing cells. This domain was previously shown by our lab to interact with actin. Here we provide biochemical and electron microscopic evidence that CAR controls nuclear size and shape through its impact on the polymerization and bundling of the perinuclear actin network. While other tyrosine mutants have the same effect as CAR in reducing nuclear size, the CAR-Y318A does not reduce nuclear size, suggesting that Y318 might play a role in regulating CAR-mediated nuclear size control.In summary, we found that the tyrosine residues in the cytoplasmic domain of CAR play critical roles in various physiological processes, including cell migration, virus infection and nuclear size control. This study extends our understanding on the roles of CAR in cell migration and nuclear size control. / Le récepteur CAR est un récepteur de liaison utilisé par des sous-familles de virus Coxsackie et des adénovirus. CAR est une molécule d'adhésion qui joue un rôle crucial dans le développement de l'organisme. CAR est également considéré comme un suppresseur de tumeur, et son niveau d'expression est diminué ou absent dans une variété de tumeurs. Cependant, on ne connaît pas le mécanisme d'action de CAR dans ces fonctions physiologiques. Notre laboratoire a déjà rapporté que CAR est un suppresseur puissant de la migration des cellules de gliome, de leur invasion et de la croissance tumorale in vivo, et que le domaine cytoplasmique de CAR est nécessaire pour ces effets inhibiteurs, mais le mécanisme sous-jacent n'est pas entièrement connu.Dans cette thèse, nous nous sommes concentrés sur la caractérisation du rôle des quatre résidus tyrosine Y269, Y294, Y313, Y318 qui se retrouvent dans le domaine cytoplasmique de CAR. Par la mutation dirigée, ces tyrosines ont été remplacés par des alanines, et le CAR muté a été exprimé dans des cellules de gliomes qui étaient CAR-négatif. Nous avons constaté que Y269 joue un rôle dans la voie d'infection de l'adénovirus, et que Y294 joue un rôle dans la voie de signalisation du facteur STAT5 lors de la migration des cellules de gliome. Dans le cadre de nos études sur Y294, nous avons observé que le CAR type sauvage inhibe l'activation de STAT5, ainsi que sa translocation nucléaire, l'expression de ses gènes cibles et la migration cellulaire induite par des facteurs de croissance tels que le facteur de croissance épidermique (EGF) et le facteur de croissance insuline 1 (IGF-1). En revanche, Y294A abolit la fonction inhibitrice de CAR envers l'activation de STAT5, l'expression de ses gènes cibles et la migration des cellules, ce qui suggère que Y294 est critique pour la régulation par CAR de la voie de signalisation STAT5 pendant la migration cellulaire.Au cours de ces études, nous avons également observé que l'introduction du CAR type sauvage dans différentes lignées cellulaires de gliomes entraînait invariablement une diminution de la taille du noyau de la cellule. En outre la reconstruction tridimensionnelle des images acquises par microscopie confocale a révélé que le volume nucléaire était aussi diminué dans les cellules qui exprimaient CAR. Le knockdown spécifique et knock-out conditionnel de CAR dans les astrocytes primaires résulta en une augmentation de la taille nucléaire, ce qui suggère que CAR contrôle la taille nucléaire d'une façon physiologique. Nous avons démontré que ces effets nécessitaient que CAR soit à la membrane plasmique et que son domaine cytoplasmique soit intact, en particulier les derniers 26 acides aminés du C-terminus. Notre laboratoire a déjà démontré que ce domaine intéragit avec l'actine. Dans cette thèse nous montrons par analyses biochimiques et microscopie électronique que CAR contrôle la taille et la forme nucléaire par son impact sur la polymérisation et le regroupement du réseau d'actine périnucléaire. Alors que d'autres mutants tyrosine ont le même effet que CAR type sauvage dans la dimunition de la taille du noyau, le CAR-Y318A n'a aucun effet sur la taille nucléaire, ce qui suggère que Y318 pourrait jouer un rôle dans la régulation de la taille nucléaire par CAR.En résumé, nous avons constaté que les résidus de tyrosine dans le domaine cytoplasmique du CAR jouent un rôle crucial dans divers processus physiologiques, y compris la migration cellulaire, l'infection par l'adénovirus et le contrôle de la taille du noyau. Cette étude élargit notre compréhension des rôles de CAR dans la migration cellulaire et le contrôle de la taille du noyau.

The Prion protein (PrP), which is the causative agent of scrapie diseases, has a still unclear physiological function, despite 30 years of research on its nature. However, a preponderance of evidence is beginning to support the idea that cellular prion protein (PrPC) has a pro-survival function. Here, we study the regulation of the prion protein gene (PRNP) in this context, as the regulation of the PRNP gene is not well understood. By homology, we identified in the PRNP a novel promoter element which bears similarity to the Endoplasmic Reticulum Stress Response Element (ERSE). This novel ERSE ("ERSE-26") is able to regulate PRNP endogenously in response to endoplasmic reticulum (ER) stress. In order to determine whether or not the ERSE-26 exists elsewhere in the genome and what is co-regulated with PRNP, we conducted a bioinformatic search and identified 38 other genes with an ERSE-26. Their expression was confirmed by treating cultured primary human neurons and MCF-7 cells with the ER stressors Brefeldin A, Tunicamycin and Thapsigargin and conducting Reverse Transcriptase PCR or Quantitative PCR. We found that the genes SESN2, GADD45B and PRNP were significantly upregulated, and others showed an upward trend. Finally, a luciferase reporter construct containing the ERSE-26 only was used to identify that the ER stress transcription factor XBP1 is a transcription factor that induces ERSE-26 activity. Finally, we conducted a literature search to determine what functions of the cell are co-regulated with PRNP with the ERSE-26. Oxidative stress response and pro-survival genes were found in the ERSE-26 genes and found to be the most upregulated by the ERSE-26, strengthening the case for PrPC as a pro-survival gene. / La protéine Prion (PrP), qui est l'agent infectieux causant les encéphalopathies transmissibles, n'a pas toujours un rôle bien identifié dans la cellule, malgré 30 ans de recherche sur sa fonction physiologique. Cependant, de plus en plus de preuves commencent à impliquer PrP dans des fonctions de protection dans la cellule. Dans cette étude, nous avons étudié la régulation peu connue du promoteur du gène qui encode PrP (PRNP). Par homologie de séquence, nous avons identifié un nouvel élément dans le promoteur de PRNP qui ressemble à l'Endoplasmic Reticulum Stress Response Element (ERSE). Ce nouvel ERSE (appelé ERSE-26) est capable de réguler l'expression du PRNP de manière endogène en réponse au stress dans le réticulum endoplasmique (RE). Pour savoir si l'ERSE-26 existe ailleurs dans le génome et afin de trouver d'autres gènes régulé avec PRNP, nous avons fait une recherche bioinformatique dans le génome entier. Nous avons identifié 38 gènes contenant aussi un ERSE-26 dans leur promoteur. Afin de confirmer l'expression de ces gènes en réponse au stress ER, nous avons traité des cultures de neurones primaires humains et des cellules MCF-7 avec les activateurs du stress RE Brefeldin A, Tunicamycin et Thapsigargin, puis vérifié l'expression par Transcriptase Inverse PCR (RT-PCR) ou RT-PCR quantitative. Nous avons montré l'induction des gènes GADD45B, SESN2 et PRNP, et d'autres ont montré une tendance positive. Ensuite, un plasmide rapporteur luciferase contenant l'ERSE-26 seulement a été utilisé pour montrer que le facteur de transcription du stress ER XBP1 est un facteur de transcription responsable pour l'activité de l'ERSE-26. Finalement, nous avons fait une recherche dans la littérature afin de déterminer la fonction des gènes contenant ERSE-26. Les gènes répondant au stress oxydant et les gènes pro-survie étaient parmi les gènes ERSE-26, et aussi ont été le plus induits, soutenant le rôle protecteur du PrP dans la cellule.

Cancer metastasis is the major cause of death from malignant disease. The biological factors that dictate the secondary site(s) of a primary tumor remain largely unknown, yet their understanding would greatly facilitate the management of malignancy. Matrix metalloproteinases (MMPs) are responsible for the degradation of the extracellular matrix and regulate the tumor microenvironment. The expression of specific MMPs in primary tumors has been correlated with the extent and site of metastatic disease and may therefore potentially be predictive of the preferred site of metastasis. In this study, a subline of the Lewis lung carcinoma (M27 cells) was used to study the role of MMP-3 in lung metastasis as well as elucidate the signaling pathways that regulate its expression in a cellular context where expression of the insulin like growth factor-I receptor (IGF-IR) is altered. Previous work demonstrated that following ectopic expression of the IGF-IR in M27 cells (M27R cells) MMP-3 expression was downregulated and this coincided with a loss of lung metastasis. Here it is shown that the ectopic expression of the IGF-IR downregulates the expression of IκB kinase ε (IKKε). Reconstitution of IKKε expression (M27R/IKKε cells), partly restored MMP-3 expression in M27R cells and furthermore, it sensitized MMP-3 expression levels to induction by phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA). This induction was, in turn, dependent on protein kinase C (PKC) α and the transcription factor p65. Finally, reconstituting MMP-3 expression in M27R cells enabled their metastasis to the lungs. Collectively, our results implicate IKKε as a regulator of MMP-3 expression and implicate MMP-3 in lung metastasis. / Les métastases sont responsables de la majorité des décès causé par les cancers. Les facteurs biologiques qui déterminent le site des tumeurs secondaires ne sont pas bien compris, mais pourraient aider au traitement de cette maladie. Les métalloproteinases de la matrice (MMPs) sont responsables de la dégradation de la matrice extracellulaire et en plus, elles sont des régulateurs du microenvironnement. Une corrélation a déjà été montrée entre le profil des MMPs chez les tumeurs primaires et les sites où vont s'implanter les métastases. Dans cette étude, on a examiné le rôle de la MMP-3 dans la capacité à former des métastases d'une lignée cellulaire dérivée de carcinome des poumons de Lewis (M27). De plus, on a examiné les signaux de transduction responsables de la régulation de la MMP-3 dans un environnement où l'expression du récepteur au facteur de croissance à l'insuline (IGF-I) était altérée. Précédemment, on a demontré que l'expression de l'IGF-IR (M27R) régulait négativement l'expression de la MMP-3 et ceci a abrogé les métastases aux poumons. Ici, on démontre que l'expression d'IGF-IR régule négativement l'expression de la kinase IκB ε (IKKε). La surexpression d'IKKε dans les cellules M27R (M27R/IKKε), reconstitue partiellement l'expression de MMP-3 dans les cellules M27R. En addition, l'expression de MMP-3 dans ces cellules peuvent être stimulées suite à l'ajout de phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA). Cette stimulation dépendait sur la kinase des protéines C (PKC) α et sur le facteur de transcription, p65. Finalement, la reconstitution de l'expression de la MMP-3, dans les cellules M27R, a permis à celles-ci de former des métastases dans les poumons. L'ensemble de nos résultats démontre qu'IKKε participe dans la régulation de l'expression de la MMP-3 et de plus que la MMP-3 serait impliquée dans la formation des métastases aux niveaux des poumons.

The Sonic hedgehog (Shh) signalling pathway is crucial for developmental events such as neural tube patterning and cell proliferation in the cerebellum. Almost all vertebrate cell types possess a primary cilium, an immotile microtubule-based structure that is the site of Shh signalling. Ptch1 and Smo are negative and positive regulators of the Shh pathway whose localization at the primary cilium is Shh-dependent. Recently, it has been shown that Boc, Cdo and Gas1 are required co-receptors of Ptch1, however, it has yet to be discovered whether these co-receptors also re-locate to and from the cilium in response to Shh. Here we show that a sufficient level of Ptch1 is a minimum requirement for recruiting Boc and Gas1 to the primary cilium in the presence of a pathway agonist. Surprisingly Cdo is not recruited to the primary cilium with or without Ptch1, despite its similarity to Boc. Structure-function analysis of Ptch1 and Boc suggests that the cytoplasmic tail is an important domain for their ciliary localization. For Gas1, mutations in regions close to the second GFRα-like domain and GPI tail affect recruitment to the cilium with Ptch1. Finally, we show that the role of Boc and Gas1 at the primary cilium may be to facilitate the removal of Ptch1 in response to Shh ligand, leading to the release of Smo and pathway activation. Altogether, these results improve our understanding of upstream Shh signal transduction and might eventually aid in the development of therapies targeting Shh signalling in developmental disorders and cancers. / La voie de signalisation Sonic hedgehog (Shh) est cruciale pour de nombreux processus développementaux tels que la spécification régionale du tube neural et la prolifération cellulaire dans le cervelet. Presque tous les types cellulaires chez les vertébrés possèdent un cil primaire, une structure immobile et microtubulaire qui est le site de la signalisation Shh. Ptch1 et Smo sont des régulateurs respectivement positifs et négatifs de la voie Shh et leur localisation au cil primaire est dépendante de Shh. Récemment, il a été démontré que Boc, Cdo et Gas1 sont des co-récepteurs requis de Ptch1. Cependant, il n'a pas encore été déterminé si ces co-récepteurs re-localisent au cil en réponse à Shh. Ici, nous montrons qu'un niveau suffisant de Ptch1 est nécessaire au recrutement de Boc et de Gas1 au cil primaire en présence d'un agoniste de la voie. Etonnamment Cdo n'est pas recruté au cil primaire, et ce malgré sa ressemblance structurale avec Boc. L'analyse comparative de Ptch1 et Boc suggère que l'extrémité cytoplasmique a un rôle majeur pour la localisation ciliaire. Pour Gas1, des mutations dans les régions proches du second domaine GFRα-like et de l'ancre GPI affectent le recrutement au cil avec Ptch1. Enfin, nous montrons que Boc et Gas1 dans le cil primaire pourraient faciliter le transport de Ptch1 hors du cil en réponse au ligand Shh. En conclusion, ces résultats permettent de mieux comprendre la transduction du signal Shh et pourraient aider au développement de thérapies ciblant la voie signalisation par Shh dans les troubles du développement et dans les cancers.