Die Ergebnisse dieser Arbeit zeigen erstmals die weite Verbreitung des IS100 innerhalb der Spezies E. coli und große Ähnlichkeiten bezüglich der chromosomalen Lokalisationen einzelner Kopien in einem heterogenen Kollektiv von E. coli-Stämmen. / The results of the present study attest to the wide distribution of the IS100 element among bacteria of the E. coli species and reveal significant similarities with regard to the chromosomal localisation of numerous single copies within a heterogenous E. coli strain collection.

Porenbildende Zytolysine stellen wichtige Virulenzfaktoren von vielen pathogenen Bakterien dar. In Escherichia coli-Stämmen wurden bisher drei verschiedene porenbildende Zytolysine identifiziert, nämlich das alpha-Hämolysin (HlyA), das EHEC-Hämolysin (EHEC-HlyA, Ehx) und das latente Hämolysin ClyA. Alpha-Hämolysin und EHEC-Hämolysin, die beide zur Familie der RTX-Toxine gehören, werden häufig von uropathogenen bzw. enterohämorrhagischen E. coli-Stämmen gebildet. Verschiedene Untersuchungen haben gezeigt, daß das alpha-Hämolysin maßgeblich an der Pathogenität von uropathogenen E. coli-Stämmen beteiligt ist. Das Hämolysin ClyA, ein Protein von 34 kDa das keine Homologien zu den RTX-Toxinen aufweist, wurde zuerst im Laborstamm E. coli K-12 identifiziert, wo es unter normalen in vitro-Kulturbedingungen nur in sehr geringem Ausmaß exprimiert wird. Ein funktionales clyA-Gen wurde kürzlich aber auch in verschiedenen pathogenen E. coli-Stämmen, u. a. in enteroinvasiven E. coli (EIEC)-Stämmen, gefunden. Bislang ist jedoch unbekannt, ob ClyA eine Rolle in der Virulenz von pathogenen E. coli-Stämmen spielt. Die vorliegende Arbeit sollte deshalb zur Aufklärung der in vivo-Funktion von ClyA in E. coli beitragen. Im Mittelpunkt des Interesses stand dabei die Frage nach der Bedeutung von ClyA für EIEC-Stämme, die zur fakultativ intrazellulären Lebensweise befähigt sind. Ausgewählte wildtypische EIEC-Stämme (EIEC 12860, EIEC 4608-58) zeigten von sich aus bzw. bei Überexpression des Transkriptionsregulators SlyA phänotypisch sichtbare hämolytische Aktivität, während in vitro konstruierte isogene clyA-"knock-out"-Mutanten dieser Stämme stets nichthämolytisch waren. Daraus konnte geschlossen werden, daß die wildtypischen EIEC-Stämme in der Lage sind, ClyA in signifikanten Mengen zu exprimieren. Vergleichende Infektionsstudien, die mit dem EIEC-Stamm 4608-58 und der entsprechenden clyA-Mutante unter Verwendung von J774-Makrophagen durchgeführt wurden, ergaben außerdem, daß ClyA wesentlich zur Zytotoxizität des wildtypischen EIEC-Stamms beiträgt. Eine spezielle Bedeutung von ClyA für die fakultativ intrazelluläre Lebensweise von EIECs konnte mit diesen Versuchen allerdings nicht nachgewiesen werden. Frühere Untersuchungen hatten gezeigt, daß im Fall des fakultativ intrazellulären Bakteriums Listeria monocytogenes ein porenbildendes Toxin, Listeriolysin O (LLO), nach der Invasion in phagozytische Zellen die Befreiung der Bakterien aus dem Phagosom ermöglicht. Es stellte sich deshalb die Frage, ob ClyA bei EIECs möglicherweise eine ähnliche Rolle spielt. Um dies herauszufinden, wurde in der vorliegenden Arbeit untersucht, inwieweit ClyA von E. coli in der Lage ist, LLO in L. monocytogenes funktional zu ersetzen. Hierzu wurden L. monocytogenes-Mutanten, die aufgrund von chromosomalen Deletionen nicht in der Lage waren, LLO zu produzieren, mit verschiedenen Plasmiden komplementiert, welche clyA bzw. clyA-Derivate unter der Kontrolle der Promotorregion des LLO-Gens (hly) enthielten. Einige dieser komplementierten Stämme exprimierten und sezernierten tatsächlich das ClyA-Protein und zeigten dementsprechend auch einen hämolytischen Phänotyp. Dieselben Stämme waren jedoch bei Infektionen in J774-Zellen nicht in der Lage, sich intrazellulär signifikant zu vermehren, obwohl teilweise eine Befreiung der Bakterien aus dem Phagosom zu beobachten war. Diese Daten zeigten, daß das ClyA-Protein von E. coli das Listeriolysin O von L. monocytogenes nicht funktional ersetzen kann. Eine mögliche Funktion von ClyA als Phagosomenöffner in EIECs kann aufgrund der vorliegenden Ergebnisse jedoch nicht ausgeschlossen werden. / Pore-forming cytolysins are important virulence factors of many pathogenic bacteria. In E. coli strains, three different pore-forming cytolysins have been identified so far:alpha-hemolysin (HlyA), EHEC-hemolysin (EHEC-HlyA; Ehx) and the cryptic hemolysin (ClyA). alpha-hemolysin and EHEC-hemolysin are frequently produced by uropathogenic and enterohaemorrhagic strains. Both toxins are related cytolysins and belong to a large family referred to as RTX-toxins. Among these, alpha-hemolysin has been most extensively studied. Futher experiments have shown that alpha-hemolysin which is produced by uropathogenic E. coli strains (UPEC), contributes to the virulence of UPEC. Recently, the cryptic hemolysin ClyA, a protein of about 34 kDa showing no homology to any member of the RTX-family was identified in the laboratory strain E. coli K-12. Under standard in-vitro-laboratory conditions ClyA is not produced at detectable levels. Further studies demonstrated that clyA is not only present in E. coli K12 but also a functional clyA-gene has been detected in various pathogenic E. coli isolates (p.e. enteroinvasive E. coli strains). So far, the role of ClyA for the virulence of pathogenic E. coli strains is unknown. Therefore, in that work the in-vivo function of ClyA of pathogenic E. coli strains was investigated. Especially, in enteroinvasive E. coli (EIEC) strains, which are able to replicate intracellulary in mammalian cells and to evade into the cytoplasm of the host cell, the relevance of ClyA for EIEC strains is unknown. Carefully selected wildtyp EIEC strains (EIEC 12860, EIEC 4608-58) showed a clear hemolytic phenotyp per se and after overproduction of the positive regulatory protein SlyA, respectively, while in ClyA-knock-out-mutants of these wildtyp EIEC strains a hemolytic phenotyp has never been observed. All these findings indicate that ClyA is expressed in significant amounts in wildtyp EIEC strains under standard in-vitro-laboratory conditions. Further infection studies with J774 macrophages by using the EIEC strain 4608-58 and a isogenic ClyA deletion mutante, respectively, revealed that ClyA is a strong cytolysin in wildtyp EIEC strains, which contributes to the cytotoxicity of these wildtyp EIEC strains. But a special relevance of ClyA for the intracellulary growth of EIEC could not be seen in any of these experiments. Recent studies showed that the facultative intracellulary bacteria Listeria monocytogenes produce the poreforming toxin listeriolysin O (LLO), which allows L. monocytogenes by opening the phagosomal membrane to evade into the cytoplasma of the host cell after invasion into a phagocytic cells. However, the mechanism which allows EIEC strains to penetrate the phagosomal membran is still unknown. ClyA might play a similar role for opening the phagosomal membran after invasion of EIEC into host cells. In this work it has been investigated wether ClyA of E. coli might functionally replace LLO of L. monocytogenes. In addition, L. monocytogenes LLO mutants which have a chromosomal deletion of the LLO gene and thereby lost the ability to produce LLO, were complemented with several plasmids. These plasmids carrying clyA and clyA-derivates under the control of the listeriolysin O promotorregion, respectively, were substituted for the listeriolysin O gene in the L. monocytogenes LLO mutants. Some of the recombinant L. monocytogenes strains expressed ClyA and showed hemolytic activity and a hemolytic phenotyp. Further experiments with J774 macrophages revealed that some of these recombinant L. monocytogenes strains seemed to open the phagosomal membrane. In consequence some bacteria were able to escape from the phagosomal compartment, but were not able to grow in the cytosol of infected cells. However, when ClyA were expressed in recombinant L. monocytogenes strains, a fully virulence phenotype could not be restored in-vitro. Due to these findings, ClyA of E. coli might be involved in the opening of the phagosomal membrane and the virulence of EIEC strains.

In the last years more than one hundred microbial genomes have been sequenced, many of them from pathogenic bacteria. The availability of this huge amount of sequence data enormously increases our knowledge on the genome structure and plasticity, as well as on the microbial diversity and evolution. In parallel, these data are the basis for the scientific “revolution” in the field of industrial and environmental biotechnology and medical microbiology – diagnostics and therapy, development of new drugs and vaccines against infectious agents. Together with the genomic approach, other molecular biological methods such as PCR, DNA-chip technology, subtractive hybridization, transcriptomics and proteomics are of increasing importance for research on infectious diseases and public health. The aim of this work was to characterize the genome structure and -content of the probiotic Escherichia coli strain Nissle 1917 (O6:K5:H31) and to compare these data with publicly available data on the genomes of different pathogenic and non-pathogenic E. coli strains and other closely related species. A cosmid genomic library of strain Nissle 1917 was screened for clones containing the genetic determinants contributing to the successful survival in and colonization of the human body, as well as to mediate this strain’s probiotic effect as part of the intestinal microflora. Four genomic islands (GEI I-IVNissle 1917) were identifed and characterized. They contain many known fitness determinants (mch/mcm, foc, iuc, kps, ybt), as well as novel genes of unknown function, mobile genetic elements or newly identified putative fitness-contributing factors (Sat, Iha, ShiA-homologue, Ag43-homologues). All islands were found to be integrated next to tRNA genes (serX, pheV, argW and asnT, respectively). Their structure and chromosomal localization closely resembles those of analogous islands in the genome of uropathogenic E. coli strain CFT073 (O6:K2(?):H1), but they lack important virulence genes of uropathogenic E. coli (hly, cnf, prf/pap). Evidence for instability of GEI IINissle 1917 was given, since a deletion event in which IS2 elements play a role was detected. This event results in loss of a 30 kb DNA region, containing important fitness determinants (iuc, sat, iha), and therefore probably might influence the colonization capacity of Nissle 1917 strain. In addition, a screening of the sequence context of tRNA-encoding genes in the genome of Nissle 1917 was performed to identify genome wide potential integration sites of “foreign” DNA. As a result, similar “tRNA screening patterns” have been observed for strain Nissle 1917 and for the uropathogenic E. coli O6 strains (UPEC) 536 and CFT073. I. Summary 4 The molecular reason for the semi-rough phenotype and serum sensitivity of strain Nissle 1917 was analyzed. The O6-antigen polymerase-encoding gene wzy was identified, and it was shown that the reason for the semi-rough phenotype is a frame shift mutation in wzy, due to the presence of a premature stop codon. It was shown that the restoration of the O side-chain LPS polymerization by complementation with a functional wzy gene increased serumresistance of strain Nissle 1917. The results of this study show that despite the genome similarity of the E. coli strain Nissle 1917 with the UPEC strain CFT073, the strain Nissle 1917 exhibits a specific set of geno- and phenotypic features which contribute to its probiotic action. By comparison with the available data on the genomics of different species of Enterobacteriaceae, this study contributes to our understanding of the important processes such as horizontal gene transfer, deletions and rearrangements which contribute to genome diversity and -plasticity, and which are driving forces for the evolution of bacterial variants. At last, the fim, bcs and rfaH determinats whose expression contributes to the mutlicellular behaviour and biofilm formation of E. coli strain Nissle 1917 have been characterized. / Bislang wurden die kompletten Genomsequenzen von mehr als 100 Bakterien ermittelt. Mehr als ein Drittel dieser Organismen wird als pathogen eingestuft. Die Verfügbarkeit dieser Sequenzinformation vergrößert unser Wissen über die bakterielle Genomstruktur und – plastizität sowie über mikrobielle Diversität und Evolution. Diese Daten bilden die Grundlage für viele Fortschritte auf dem Gebiet der Biotechnologie, der industriellen-, Umwelt- und medizinischen Mikrobiologie: neuartige Typisierung-, Diagnostik- und Therapieansätze sowie die Entwicklung neuer Medikamente und Impfstoffe basieren auf und profitieren von der ständig zunehmenden Menge an DNA-Sequenzen. Genomanalysen sind zusammen mit anderen molekularbiologischen Methoden wie PCR, DNA-Chiptechnologie, subtraktive Hybridisierung und Proteomanalysen von zunehmender Bedeutung für die Erforschung von Infektionskrankheiten und das öffentliche Gesundheitswesen. Ziel dieser Arbeit war die Analyse der Genomstruktur und des Genominhaltes des apathogenen Escherichia coli Stammes Nissle 1917 (O6:K5:H1) und der Vergleich mit verfügbaren Daten verschiedener pathogener und apathogener E. coli Stämme sowie anderer eng-verwandter Spezies. Eine Cosmid-Genbank des Stammes Nissle 1917 wurde nach Klonen durchsucht, die für Fitnessfaktoren kodieren, welche zur erfolgreichen Kolonisierung des menschlichen Verdauungstraktes und zum probiotischen Charakter dieses Stammes beitragen. Vier genomische Inseln (GEI I-IVNissle 1917) wurden nachgewiesen und charakterisiert. Auf diesen GEIs befinden sich verschiedene bekannte Fitness-Determinanten (mch/mcm, foc, iuc, kps, ybt), bislang nicht charakterisierte ORFs, mobile genetische Elemente und bislang für den Stamm Nissle 1917 nicht beschriebene Gene, die möglicherweise zur Fitness und Adaptabilität dieses Stammes beitragen. Die GEIs I-IVNissle 1917 sind jeweils mit einem tRNAGen assoziiert und ähneln hinsichtlich ihrer Struktur und chromosomalen Lokalisation entsprechenden Inseln im Genom des uropathogenen E. coli Stammes CFT073 (O6:K2(?):H1). Interessanterweise fehlen auf diesen wichtige Virulenzgene uropathogener E. coli (hly, cnf, prf/pap). Eine etwa 30 kb große Region der GEI IINissle 1917, die von IS2 Elementen flankiert wird, kann spontan deletieren, was zum Verlust verschiedener Fitnessdeterminanten (iuc, sat, iha) führt. Darüber hinaus wurde der chromosomale Sequenzkontext von tRNA-Genen mittels PCR auf die Integration von „Fremd-DNA“ hin untersucht, die durch horizontalen Gentransfer erworben wurde (tRNA Screening), und mit denen anderer apathogener und pathogener E. coli Stämme verglichen. Der genomweite Anteil an tRNA-Gen-assoziierter, möglicherweise horizontal erworbener DNA, die im I. Summary 2 apathogenen E. coli K-12 Stamm MG1655 fehlt, unterschied sich dabei nicht bedeutend im Stamm Nissle 1917 und den uropathogenen E. coli O6 Stämmen CFT073 und 536. Die Verbreitung von DNA-Regionen der GEIs des Stammes Nissle 1917 wurde mittels PCR bei apathogenen E. coli-Isolaten sowie bei uropathogenen E. coli O6:K5-Isolaten untersucht. Nur zwei UPEC O6:K5-Isolate enthielten alle GEI-Bereiche, die in diese Untersuchung einbezogen waren, unterschieden sich jedoch vom Stamm Nissle 1917 durch ihre Phänotypen. Die Makrorestriktionsanalyse der Genomstruktur des E. coli Stammes Nissle 1917 zeigte, daß letztere der des uropathogenen E. coli Stammes CFT073 sehr ähnelt. Um die Ursache für den semi-rauhen Phänotyp des Stammes Nissle 1917 zu untersuchen, wurden die wa* und wb* Determinanten dieses Stammes, die für die LPS-Biosynthese verantwortlich sind, kloniert und sequenziert. Das bislang unbekannte Serotyp O6-spezifische O-Antigenpolymerase-kodierende Gen wzy des Stammes Nissle 1917 wurde charakterisiert und mit dem des rauhen O6 Stammes 536 verglichen. Eine Punktmutation, die zu einem vorzeitigen Translationsstop der wzy-Transkripte des Stammes Nissle 1917 führt, wurde als Ursache für den semi-rauhen Phänotyp und damit auch die Serumsensitivität dieses Stammes verantwortlich gemacht. Zur Untersuchung der Kolonisierungsfähigkeit des E. coli Stammes Nissle 1917 wurden verschiedene Faktoren, die an der Biofilmbildung bzw. am multizellulären Verhalten beteiligt sind, sequenziert und näher analysiert. Die Seqenzierung der fim Determinante zeigte, daß das fimB Gen, das für die Expression der Typ 1-Fimbrien benötigt wird, durch die Insertion eines IS-Elementes inaktiviert wurde. Untersuchungen zum multizellulären Verhalten zeigten, daß der Stamm Nissle 1917 den sogenannten „rdar“ Morphotyp, hervorgerufen durch Expression von Curli-Fimbrien und Cellulose, bei 30 °C und bei 37 °C exprimiert, nicht jedoch die uropathogenen E. coli Stämme 536 und CFT073. Das Cellulosebiosynthese-Operon (bcs) sowie das Gen rfaH, das für einen Transkriptionsantiterminator kodiert, wurden im Stamm Nissle 1917 inaktiviert, um deren Bedeutung für den „rdar“ Morphotyp zu untersuchen. Während Cellulose für die Expression des „rdar“ Morphotyps benötigt wird, hatte die rfaHInaktivierung keinen Einfluß auf dieses mulizelluläre Verhalten des E. coli Stammes Nissle 1917. Die Ergebnisse dieser Arbeit zeigen, daß der apathogene E. coli Stamm Nissle 1917 durch eine spezifische Kombination phänotypischen Eigenschaften gekennzeichnet ist, die ihn von anderen bislang untersuchten E. coli Stämmen unterscheidet. An der Evolution dieses Stammes, möglicherweise aus einem pathogenen „Vorfahren“, waren vielfältige Gentransfer- und Deletionsprozesse sowie Punktmutationen beteiligt.

Der uropathogene Escherichia coli Stamm 536 (O6:K15:H31) stammt aus einem Patienten mit akuter Pyelonephritis und ist heute einer der Hauptmodellorganismen für Studien zum Vorkommen und zur Funktionalität von Pathogenitätsinseln (PAIs). Sein Genom enthält sechs genetische Elemente (PAI I(536) bis PAI VI(536)), die an unterschiedlichen Stellen des Chromosoms integriert sind und die Hauptkriterien für PAIs erfüllen. Sie kodieren für viele Virulenzfaktoren des Stammes, sind am 3' Ende von tRNA Genen integriert, enthalten teils kryptische Fragmente mobiler genetischer Elemente wie Integrase- oder Transposasegene und werden meist von IS Elementen oder 'direct repeats' (DRs) flankiert. Darüber hinaus haben sie die Tendenz, instabil zu sein und aus dem Chromosom zu deletieren. Mit Ausnahme von PAI IV(536) sind alle PAIs von E. coli 536 mit intakten Integrasegenen assoziiert, die zu int Genen des Coliphagen P4 bzw. des Shigella flexneri Phagen SfX ähnlich sind. Neuere Untersuchungen zeigen, daß diese Gene exprimiert werden und für funktionelle Enzyme kodieren. Zusätzlich werden die PAIs ebenfalls mit Ausnahme von PAI IV(536) von DRs unterschiedlicher Größe flankiert, die den Randbereichen von Prophagen im prokaryontischen Chromosom entsprechen. Es ist daher wahrscheinlich, daß PAI-Deletionen vergleichbar zum Insertions-/Exzisionsmechanismus von Bakteriophagen durch die jeweilige PAI-assoziierte Integrase vermittelt werden und durch ortsspezifische Rekombination zwischen den flankierenden DRs erfolgen. Die Instabilität von PAI I(536) und PAI II(536) ist schon früh belegt worden. Jede Insel kodiert für eine Hämolysindeterminante und ihre Kodeletion führt zu einem ahämolytischen Phänotyp, der mit einer Häufigkeit von 3×10(-5) in vivo und bis 1x10(-3) in vitro auftritt. Die Exzision erfolgt durch ortsspezifische Rekombination zwischen den 16 bp bzw. 18 bp großen flankierenden DRs der PAIs. Da den übrigen E. coli 536-spezifischen PAIs entsprechende phänotypische Marker fehlen, wurde in der hier vorliegenden Arbeit das 'Island Probing'-Verfahren angewendet, um die Instabilität von PAI I(536) bis PAI V(536) im Detail zu untersuchen. Dazu wurde der negative Selektionsmarker sacB separat in die PAIs integriert. Zellen, die diesen Marker tragen, sind saccharosesensitiv und können nur in Gegenwart hoher Saccharosekonzentrationen wachsen, nachdem die sacB-markierte PAI aus dem Chromosom deletiert wurde. Auf diese Weise konnten von sacB-markierten Derivaten des Stammes E. coli 536 gezielt PAI-negative Zellen isoliert werden, um die Grunddeletionsraten der PAIs zu bestimmen und ihre Randbereiche zu analysieren. Zusätzlich wurde der Einfluß verschiedener Umwelteinflüsse wie niedrige/hohe Temperatur, osmotischer Streß, Nährstoffmangel, subinhibitorische Antibiotikakonzentrationen oder die Gegenwart konjugativer Plasmide auf die Exzisionsrate untersucht. Die in dieser Arbeit vorgestellten Daten zeigen, daß PAIs von E. coli 536 mit unterschiedlicher Häufigkeit deletieren. Während PAI II(536) und PAI III(536) mit Deletionsraten von 2×10(-5) bzw. 5x10(-5) am instabilsten sind, liegen die Exzisionsraten von PAI I(536) und PAI V(536) mit 2x10(-6) bzw. 1×10(-6) niedriger und deuten auf eine fortschreitende Stabilisierung dieser PAIs hin. Im Gegensatz dazu ist PAI IV(536) bereits vollständig stabil in das Chromosom eingebettet. Während die Exzision von PAI I(536), PAI II(536) und PAI V(536) RecA-unabhängig ist und auf ortsspezifischer Rekombination zwischen ihren flankierenden DRs beruht, treten bei PAI III(536) zwei alternative Deletionsmechanismen auf. Die Exzision dieser PAI erfolgt entweder vollständig durch ortsspezifische Rekombination zwischen den flankierenden DRs oder partiell durch homologe Rekombination zwischen zwei IS100 Elementen innerhalb der PAI. Unabhängig vom Rekombinationsmechanismus führt die Deletion aber in allen Fällen zur Bildung zirkulärer Intermediate (CIs), die vermutlich aufgrund fehlender Replikationsstartpunkte bei nachfolgenden Zellteilungen verlorengehen. Obwohl CIs von PAI II(536) und PAI III(536) mit Hilfe spezifischer PCR-Reaktionen identifiziert werden konnten, war ein PCR-Nachweis PAI I(536)- und PAI V(536)-spezifischer CIs bedingt durch die niedrigen Deletionsraten dieser Inseln nicht möglich. Interessanterweise konnte in dieser Arbeit erstmalig gezeigt werden, daß die Deletion von PAI II(536) und PAI III(536) bei niedriger Wachstumstemperatur, hoher Zelldichte und Nährstoffmangel in vitro induzierbar ist, d. h. unter Bedingungen, die auch in natürlichen Biofilmen auftreten können. Andere Bedingungen wie osmotischer Streß, subinhibitorische Antibiotikakonzentrationen oder die Anwesenheit konjugativer Plasmide haben keinen Einfluß auf die Deletionsrate der PAIs. Insgesamt deuten die Ergebnisse darauf hin, daß die Instabilität von PAIs bei E. coli 536 in vivo eine wichtige Rolle spielt indem sie zur Genomflexibilität und Evolution sowie zur Modulation der Virulenzgenexpression der Bakterien beiträgt. / The uropathogenic Escherichia coli strain 536 (O6:K15:H31) was originally isolated from a patient suffering from acute pyelonephritis and is now one of the best-characterized model organisms to study the existence and functionality of pathogenicity islands (PAIs). Its genome carries six genetic elements (PAI I(536)-PAI VI(536)), which are inserted at different sites of the chromosome and exhibit the main features of PAIs: They encode many virulence genes of this strain, they are inserted at the 3’ end of tRNA genes, they are associated with sometimes cryptic fragments of mobile genetic elements such as integrase genes or transposase genes, and they are flanked by IS elements or direct repeats (DRs). Furthermore, they have the tendency to be instable and to delete from the chromosome. With the exception of PAI IV(536) all PAIs of E. coli strain 536 are associated with intact integrase genes, which are similar to the int genes of coliphage P4 and the Shigella flexneri phage SfX, respectively. Recently, it was shown, that these genes can be expressed and code for functional enzymes. Furthermore, with exception of PAI IV(536), the PAIs of strain 536 are flanked by DRs of different size, which correspond to the left and right end junctions of prophages in the prokaryotic chromosome. Therefore, it is very likely, that comparable to the insertion/excision mechanism of bacteriophages the deletion of PAIs is mediated by the respective PAI-encoded integrase and functions via site-specific recombination between the flanking DRs. Instability of PAI I(536) and PAI II(536) has been described very early. Each island encodes a hly gene cluster and their co-deletion leads to a non-hemolytic phenotype, which can appear with a frequency of 3x10(-5) in vivo and up to 1x10(-3) in vitro. The excision of both PAIs is the result of site-specific recombination between their 16 bp and 18 bp flanking DRs, respectively. Since all other E. coli 536-specific PAIs lack a comparable phenotypic marker, we used the 'Island Probing' approach to investigate the instability of PAI I(536) to PAI V(536) in more detail. For this purpose, the counterselectable marker sacB was integrated separately into the PAIs. Cells carrying this marker have a sucrose sensitive phenotype and are only able to grow on high concentrations of sucrose after the deletion of the sacB-labeled PAI from the chromosome. Thus, we were able to isolate PAI-negative cells systematically from sacB-positive derivatives of E. coli strain 536 to estimate the basic deletion rate of the PAIs and to analyze their junctions to the chromosome in more detail. Additionally, the influence of different environmental conditions such as low or elevated temperature, osmotic stress, depletion of nutrients, subinhibitory concentrations of antibiotics, and the presence of conjugative plasmids on the excision rate of the PAIs was investigated. According to the data presented in this study, PAIs of E. coli strain 536 delete with different frequencies. While PAI II(536) and PAI III(536) are the most unstable islands with deletion rates of 2×10(-5) and 5×10(-5), respectively, the excision rates of PAI I(536) and PAI V(536) are lower with values of 2×10(-6) and 1×10(-6), respectively, which indicates a progressive stabilization of these PAIs. In contrast, PAI IV(536) is already stably embedded in the chromosome. While the excision of PAI I(536), PAI II(536), and PAI V(536) is RecA-independent and is based on site-specific recombination between their flanking DRs, two alternative deletion mechanisms were identified in case of PAI III(536). This PAI either deletes in its entirety by site-specific recombination between its flanking DRs or partially by homologous recombination between two IS100 elements located within the PAI. Independent of the recombination mechanism, deletion leads in all cases to the formation of so-called circular intermediates (CIs), which lack an origin of replication and are probably lost during the following cell divisions. Such CIs of PAI II(536) and PAI III(536) were detected by specific PCR reactions, but an experimental proof of PAI I(536)- and PAI V(536)-specific CIs was not possible probably because of the low deletion rate of these islands. Interestingly, this study demonstrates for the first time that deletion of PAI II(536) and PAI III(536) is inducible by low incubation temperature, high cell density, and low nutrient supply, i.e. conditions that can also occur in natural biofilms. Other stimuli such as osmotic stress, subinhibitory antibiotic concentrations, or the presence of conjugative plasmids seem to have no effect on the deletion rates of the PAIs. In summary, the presented results suggest that instability of PAIs of the E. coli strain 536 is important in vivo by contributing to genome flexibility and evolution as well as to the modulation of virulence gene expression of the bacteria.

In this study the Omp85 family proteins YaeT and YtfM of Escherichia coli were investigated by using biochemical and electrophysiological methods as well as bioinformatical and structural analysis. In addition, knock-out strains were constructed to further study the relevance of these proteins in vivo. The prediction that Omp85 proteins are composed of two domains, a periplasmic amino-terminal POTRA (polypeptide translocation associated) domain and a carboxy-terminal domain anchoring these proteins in the outer membrane, was confirmed by the construction of mutants. It could be shown that the carboxy-terminal part of the proteins is able to insert into the outer bacterial membrane, even if the POTRA domain is removed. Furthermore, pore-forming activity in the black-lipid bilayer was observed for both full-length proteins as well as their carboxy-terminal membrane located parts. The channels formed by both proteins in the black lipid bilayer showed variable single channel conductance states rather than a defined value for conductance. In 1M KCl, e.g. YaeT forms pores with a channel conductance of 100 to 600 pS containing a most abundant value at 400 pS. This variability is at least reasonable for YaeT due to a prerequisite flexibility of its channel for OMP insertion. YaeT was identified to form a cation selective, YtfM an anion selective channel, which is less pH dependent than YaeT. Another feature of the YaeT channel is that its selectivity and conductance is influenced by charged detergent molecules indicating an accumulation of these molecules in hydrophobic pockets inside the compact channel. YaeT revealed heat-modifiable mobility in SDS-PAGE which is characteristic for β-barrel OMPs, whereas YtfM did not show this behaviour. This result could be explained by sequence alignment and structural comparison of YaeT and YtfM via CD and FTIR spectra displaying much higher β-strand content for the carboxy-terminal part of YaeT compared to YtfM. Since the carboxy-terminal parts were shown to have pore forming ability and are inserted in the OM in vivo, the substitution of the essential protein YaeT by its carboxy-terminal mutant was attempted in a yaeT knock-out strain. The carboxy-terminal half of YaeT was not sufficient to compensate depletion of the full-length protein indicating an important role of the amino-terminus for cell viability. In contrary, YtfM is shown to be a non-essential protein and lack of YtfM had no effects on the composition and integrity of the OM. However, chromosomal deletion of ytfM remarkably reduced the growth rate of cells. This study provides the first detailed investigation of the structure of YaeT and describes its electrophysiological behaviour, which could be a basis for further studies of YaeT and its substrate proteins. Furthermore, YtfM was characterised and its in vivo function was investigated revealing YtfM as the second Omp85 family protein of importance in E. coli. In a second part of this study assembly and function of multidrug efflux pumps were investigated. Drug efflux pumps are tripartite export machineries in the cell envelope of Gram-negative bacteria conferring multidrug resistance and therefore causing severe problems for medical treatment of diseases. Protein structures of all three efflux pump components are solved, but the exact interaction sites are still unknown. Assembly of a hybrid exporter system composed of the Pseudomonas aeruginosa channel tunnel OprM, the E. coli adaptor protein AcrA and its associated transporter AcrB could be shown by chemical cross-linking, even though this efflux pump is not functional. Exchange of the hairpin domain of AcrA by the corresponding hairpin from the adaptor protein MexA of P. aeruginosa restored functionality tested by antibiotic sensitivity assays. This shows the importance of the MexA hairpin domain for functional interaction with the OprM channel tunnel. Interestingly, the hybrid protein was also able to assemble with TolC as outer membrane component to form a functional efflux pump indicating a higher flexibility of TolC compared to OprM concerning interaction partners. Based on these results, an interaction model of the hairpin domain and the channel tunnel on molecular level for AcrA and TolC as well as MexA and OprM, respectively, is presented. This model provides a basis for directed mutagenesis to reveal the exact contact sites of the hairpin of the adapter protein and the outer membrane component / In dieser Arbeit wurden die Omp85 Familienproteine YaeT und YtfM aus E. coli biochemisch und elektrophysiologisch charakterisiert, sowie bioinformatisch und strukturell analysiert. Des Weiteren wurden Bakterienstämme mit chromosomalen Deletionen der beiden zugehörigen Gene hergestellt, um die Relevanz der beiden Proteine in vivo zu untersuchen. Für Omp85 aus N. meningitdis wurde vorhergesagt, dass das Protein aus zwei strukturellen Untereinheiten besteht, einer periplasmatischen amino-terminalen Domäne, der POTRA – („polypeptide-transport-associated“ -) Domäne und einer carboxy-terminalen Domäne, die das Protein in der Außenmembran verankert. Diese Vorhersagen wurden für die Omp85 Homologen YaeT und YtfM mit Hilfe von geeigneten Mutanten bestätigt. Es konnte gezeigt werden, dass der carboxy-terminale Teil beider Proteine, YaeT und YtfM, auch bei Fehlen der amino-terminalen Domäne noch in der äußeren Membran zu finden ist. Bestätigt wurde dieses Ergebnis durch „Black Lipid Bilayer“ Experimente. Für beide nativen Proteine, sowie deren carboxy-terminale Mutanten, konnte der Einbau in eine künstliche Membran und Porenbildung gezeigt werden. Anders als bei herkömmlichen Porinen, die normalerweise eine sehr gut definierte Leitfähigkeit haben, musste man den beiden untersuchten Proteinen eher eine Leitfähigkeitsspanne zuordnen. Bei Messungen in 1M KCl wurden für YaeT beispielsweise Poren mit einer Leitfähigkeit von 100 bis 600 pS aufgezeichnet, wobei 400 pS der am häufigsten vorkommende Wert ist. Diese Variabilität ist bei YaeT zumindest dadurch begründbar, dass für den Einbau anderer Proteine in die äußere Membran ein flexibler Kanal mit einer möglichen lateralen Öffnung notwendig ist. Die YaeT Poren sind kationenselektiv, für YtfM wurde ein anionenselektiver Kanal nachgewiesen, welcher zusätzlich im Vergleich zu YaeT weniger pH anfällig ist. Weiterhin haben die elektrophysiologischen Experimente gezeigt, dass die Ionenselektivität und Leitfähigkeit von YaeT durch Detergenzmoleküle beeinflussbar ist. Dies lässt hydrophobe Bereiche im Kanalinnern vermuten, an denen sich die Moleküle mit ihrem unpolaren Teil anlagern und dann durch ihre polaren Köpfe die Nettoladungen im Kanalinnern verändern. Mittels Gelelektrophorese konnte für YaeT das typische Laufverhalten von Außenmembranproteinen gezeigt werden. Wenn YaeT ungekocht auf ein SDS-Gel aufgetragen wurde, wanderte es schneller, als wenn man es vorher auf 100°C erhitzte, was für eine kompakte Struktur spricht. Für YtfM wurde dieses Verhalten nicht festgestellt. Die Erklärung für diesen Unterschied lieferten ein Sequenzvergleich beider Proteine, sowie die strukturelle Untersuchung mittels CD- und FTIR-Spektroskopie, welche im Vergleich zu YtfM einen deutlich höheren β-Faltblatt-Anteil für den carboxy-terminalen Teil von YaeT ergaben. Da der carboxy-terminale Teil der Proteine in der Außenmembran zu finden ist und porenformende Aktivität besitzt, wurde versucht, YaeT durch seine carboxy-terminale Mutante in einem Knock-out Stamm zu ersetzen. Dies schlug jedoch fehl, was auf eine bestimmte Funktion der amino-terminalen Hälfte in vivo hindeutet. Im Vergleich zu YaeT ist YtfM kein essentielles Protein und sein Fehlen beeinflusst die Zusammensetzung und die Funktion der äußeren Membran nicht. Die chromosomale Deletion von ytfM führte jedoch zu einer deutlichen Reduktion der Wachstumsrate. Bei den Multidrug Efflux Pumpen AcrAB/TolC und MexAB/OprM sind mittlerweile Strukturen aller drei Pumpenkomponenten bekannt, ihre Interaktionsstellen sind allerdings noch nicht bekannt. Mit einem chemischen „Cross-linker“ konnte der Zusammenbau eines hybriden Exportsystems bestehend aus der Außenmembrankomponente OprM aus Pseudomonas aeruginosa, dem Adapterprotein AcrA aus E. coli, sowie dessen zugehörigem Innenmembrantransporter AcrB, nachgewiesen werden. Der Zusammenbau ist insofern erstaunlich, da diese hybride Effluxpumpe nicht funktionell ist. Die Funktionalität dieser Effluxpumpe, nachgewiesen durch Antibiotikasensitivitätstests, konnte jedoch durch den Austausch der „Hairpin“-Domäne von AcrA durch den „Hairpin“ von MexA wieder hergestellt werden. Dieses Ergebnis zeigt deutlich die Wichtigkeit dieser Haarnadelstruktur für die funktionelle Interaktion mit der Außenmembrankomponente OprM. Interessanterweise konnte das hybride Adapterprotein eine funktionelle Effluxpumpe mit TolC als Außenmembrankomponente bilden, was für eine höhere Flexibilität von TolC im Gegensatz zu OprM bezüglich der Interaktionspartner spricht. Aufgrund der oben genannten Ergebnisse wurde ein Interaktionsmodell der „Hairpin“-Domäne von AcrA bzw. MexA mit den Außenmembranproteinen TolC und OprM auf molekularer Ebene erstellt. Dieses Modell kann nun als Vorlage für zielgerichtete Mutationen dienen, um die Interaktionsstellen des Adapterproteins mit der zugehörigen Außenmembrankomponente genau zu beschreiben.

Para se determinar o efeito da adição de baixas concentrações de ácidos na resistência de microrganismos ao calor úmido, cultura de E. coli IZ-923 foi aquecida a 55°C e 60°C em caldo nutriente contendo 0,1 ou 0,2% dos ácidos acético, lático, cítrico e fosfórico por 12min. A intervalos de 4 min amostras foram retiradas, resfriadas, plaqueadas em nutriente ágar (NA) e ágar com bile vermelho violeta (VRBA) e incubadas por 48h a 37°C ± 0,5°C. Com o número de colônias desenvolvidas no nutriente ágar foram calculadas as porcentagens de redução e os valores D55 e D60. Com aquelas desenvolvidas no ágar com bile e vermelho violeta, calculou-se as porcentagens de danificação celular. As conclusões foram: 1. Na maioria das vezes a porcentagem de redução da E. coli IZ-923 aumentou com o aumento da concentração de ácidos e com a temperatura; 2. Durante o aquecimento tanto com a adição de 0,1% como 0,2% de ácido em ambas as temperaturas, pôde-se estabelecer a seguinte ordem de redução: acético > fosfórico > lático > cítrico; 3. As porcentagens da danificação foram semelhantes para todos os ácidos em ambas as concentrações de ácidos e temperaturas empregadas; 4. Os valores D55 e D60 diminuíram com o aumento da temperatura de aquecimento; 5. Nas condições do presente trabalho não foi possível caracterizar uma diferença expressiva entre os ácidos empregados com relação aos seus efeitos na resistência térmica de E. coli IZ-923 / In order to determine the effect of the addition of low concentrations of acids in the microorganism heat resistance, E. coli IZ-923 culture, was heat at 55°C and 60°C in nutrient broth, containing 0.1% and 0.2% acetic, lactic, citric and phosphoric acids for 12 minutes. Every four minutes samples were taken, cooled, plated on nutrient agar and violet-red bile agar and incubation at 37°C ± 0.5°C for 48 hours. The D55 e D60 values and the reduction percentage were calculated from the number of developed colonies on nutrient agar. The cellular injure percentages were calculated from the developed colonies on violet-red bile agar. The conclusions are: 1. The E. coli IZ-923 populations reduction percentage, in the most although variable, raised as the added acid concentration and temperature increased; 2. Either heating temperatures and any of the concentrations showed the following acid reduction power: acetic > phosphoric > lactic > citric; 3. The cellular injure percentages were similar for all acids in both concentrations and temperatures employed; 4. D55 e D60 values decreased as the acid concentration and heating temperature increased; 5. AT working conditions it was not possible to stablish any great difference regarding to the effect of all acids used on the E. coli IZ-923 heat resistance

by Yiu-kuen Kam. / Bibliography: leaves 108-118 / Thesis (M.Phil.) -- Chinese University of Hong Kong, 1983

Sui-lam Wong. / Thesis (M.Phil.) -- Chinese University of Hong Kong. / Includes bibliographies.

Leung Kwan-chi. / Thesis (Ph.D.)--Chinese University of Hong Kong, 1994. / Includes bibliographical references (leaves 215-223). / ACKNOWLEDGEMENTS --- p.i / ABSTRACT --- p.ii / ABBREVIATIONS --- p.iii / Chapter CHAPTER 1 --- INTRODUCTION --- p.1 / Chapter 1.1 --- Brief description of Momordica charantia --- p.2 / Chapter 1.2 --- Toxicity of RIPs and their potential uses in the treatment of AIDS --- p.3 / Chapter 1.3 --- General mechanism of action of RIPs --- p.6 / Chapter 1.4 --- Structure of αMMC --- p.7 / Chapter 1.5 --- "Antigenicities of αMMC, BMMC and TCS" --- p.13 / Chapter 1.6 --- "Immunosuppressive properties of the abortifacient proteins αMMC, BMMC and TCS" --- p.14 / Chapter 1.7 --- Objectives of our study --- p.15 / Chapter CHAPTER 2 --- EXPRESSION OF FULL-LENGTH αMMC cDNA --- p.20 / Chapter 2.1 --- Expression of αMMC cDNA as a fusion protein --- p.22 / Chapter 2.1.1 --- Materials and methods --- p.22 / Chapter 2.1.1.1 --- Construction of fusion vector pRIT2T/MMC --- p.22 / Chapter 2.1.1.2 --- Preparation of αMMC insert by PCR --- p.26 / Chapter 2.1.1.3 --- Cloning of αMMC cDNA into fusion vector pRIT2T --- p.27 / Chapter 2.1.1.4 --- Transformation --- p.28 / Chapter 2.1.1.5 --- DNA sequencing --- p.29 / Chapter 2.1.1.6 --- Expression of protein A-αMMC fusion cDNA --- p.30 / Chapter 2.1.1.7 --- Preparation of fusion αMMC for affinity chromatography --- p.31 / Chapter 2.1.1.8 --- Affinity chromatography of Protein A-αMMC fusion protein --- p.31 / Chapter 2.1.1.9 --- Cleavage of protein A-αMMC fusion protein by factor Xa --- p.32 / Chapter 2.1.1.10 --- SDS-PAGE analysis --- p.33 / Chapter 2.1.1.11 --- Western blot analysis --- p.33 / Chapter 2.1.1.12 --- Assay of biological activity --- p.35 / Chapter 2.1.2 --- Results --- p.37 / Chapter 2.1.2.1 --- Construction of pRIT2T/MMC --- p.37 / Chapter 2.1.2.2 --- DNA sequencing --- p.40 / Chapter 2.1.2.3 --- Expression of protein A-αMMC fusion cDNA --- p.42 / Chapter 2.1.2.4 --- Purification of protein A-αMMC fusion protein --- p.45 / Chapter 2.1.2.5 --- Cleavage of protein A-aMMC fusion protein --- p.49 / Chapter 2.1.2.6 --- Assay of biological activity --- p.49 / Chapter 2.1.3 --- Discussion --- p.51 / Chapter 2.2 --- Expression of αMMC cDNA as an unfused protein --- p.52 / Chapter 2.2.1 --- Materials and methods --- p.52 / Chapter 2.2.1.1 --- Construction of the plasmid pET/MMC --- p.52 / Chapter 2.2.1.2 --- Preparation of αMMC insert by PCR --- p.56 / Chapter 2.2.1.3 --- Enzyme digestions --- p.57 / Chapter 2.2.1.4 --- Ligation --- p.58 / Chapter 2.2.1.5 --- Transformation --- p.59 / Chapter 2.2.1.6 --- Screening for αMMC inserts --- p.59 / Chapter 2.2.1.7 --- DNA sequencing --- p.60 / Chapter 2.2.1.8 --- Expression of unfused aMMC cDNA --- p.60 / Chapter 2.2.1.9 --- SDS-PAGE analysis --- p.61 / Chapter 2.2.1.10 --- Western blot analysis --- p.62 / Chapter 2.2.1.11 --- Purification of recombinant αMMC --- p.62 / Chapter 2.2.1.12 --- Biological activity of recombinant αMMC --- p.63 / Chapter 2.2.1.13 --- Radioimmunoassay --- p.63 / Chapter 2.2.2 --- Results --- p.67 / Chapter 2.2.2.1 --- Screening of pET/MMC --- p.67 / Chapter 2.2.2.2 --- DNA sequencing --- p.69 / Chapter 2.2.2.3 --- Expression of unfused αMMC cDNA --- p.69 / Chapter 2.2.2.4 --- Radioimmunoassay --- p.72 / Chapter 2.2.2.5 --- Purification of recombinant αMMC --- p.74 / Chapter 2.2.2.6 --- Biological activity of recombinant αMMC --- p.74 / Chapter 2.2.3 --- Discussion --- p.80 / Chapter CHAPTER 3 --- EXPRESSION OF MODIFIED FORMS OF αMMC cDNA --- p.82 / Chapter 3.1 --- Expression of deletion fragments of αMMC cDNA --- p.83 / Chapter 3.1.1 --- Materials and methods --- p.83 / Chapter 3.1.1.1. --- Construction of deletion mutants --- p.83 / Chapter 3.1.1.1.1 --- Modification of pRIT2T/MMC --- p.86 / Chapter 3.1.1.1.2 --- Preparation of closed circular DNA --- p.86 / Chapter 3.1.1.1.3 --- Alpha-phosphorothioate nucleotide --- p.87 / Chapter 3.1.1.1.4 --- Exo III digestion --- p.89 / Chapter 3.1.1.1.5 --- Ligation --- p.89 / Chapter 3.1.1.1.6 --- Transformation --- p.90 / Chapter 3.1.1.1.7 --- Screening of deletion subclones --- p.91 / Chapter 3.1.1.2 --- Confirmation of sequences --- p.91 / Chapter 3.1.1.3 --- Expression of deletion mutants --- p.92 / Chapter 3.1.1.4 --- Purification of deletion mutants --- p.92 / Chapter 3.1.1.5 --- Cleavage of deletion mutants --- p.93 / Chapter 3.1.1.6 --- Subcloning of the αMMC cDNA fragments --- p.94 / Chapter 3.1.1.7 --- Expression of the unfused deletion --- p.96 / Chapter 3.1.2 --- Results --- p.97 / Chapter 3.1.2.1 --- Designation of the deletion mutants --- p.97 / Chapter 3.1.2.2 --- Screening of deletion mutants --- p.98 / Chapter 3.1.2.3 --- DNA sequencing --- p.100 / Chapter 3.1.2.4 --- Expression of deletion mutants --- p.109 / Chapter 3.1.2.5 --- Purification of the fusion fragments --- p.111 / Chapter 3.1.2.6 --- Digestion of deletion mutants by factor Xa --- p.113 / Chapter 3.1.2.7 --- Subcloning of αMMC deletion fragments --- p.115 / Chapter 3.1.2.8 --- Expression of the unfused aMMC deletion --- p.117 / Chapter 3.1.3 --- Discussion --- p.119 / Chapter 3.2 --- Expression of a chimeric αMMC/TCS cDNA --- p.121 / Chapter 3.2.1 --- Materials and methods --- p.122 / Chapter 3.2.1.1 --- Construction of the MMC/TCS chimeric plasmid --- p.122 / Chapter 3.2.1.1.1 --- Digestion of pfG104 - Preparation of GH1100 --- p.125 / Chapter 3.2.1.1.2 --- Preparation of the GH405 fragment --- p.125 / Chapter 3.2.1.1.3 --- Digestion of pACYC177 --- p.126 / Chapter 3.2.1.1.4 --- "Dephosphorylation, ligation and transformation" --- p.126 / Chapter 3.2.1.1.5 --- Confirmation of insert orientation --- p.127 / Chapter 3.2.1.1.6 --- "Preparation of a fragment without PstI, ScaI" --- p.128 / Chapter 3.2.1.1.7 --- Preparation of the 750-bp TCS fragment --- p.128 / Chapter 3.2.1.1.8 --- Ligation of the TCS fragment --- p.129 / Chapter 3.2.1.1.9 --- Cleavage of pACYC177/TCS with ScaI and PstI --- p.129 / Chapter 3.2.1.1.10 --- Preparation of the PstI/HhaI-digested αMMC --- p.130 / Chapter 3.2.1.1.11 --- Ligation of the 252-bp fragment --- p.131 / Chapter 3.2.1.1.12 --- Cloning of MMC/TCS chimeric fragment --- p.131 / Chapter 3.2.1.2 --- Expression of pET/MMC-TCS --- p.132 / Chapter 3.2.1.3 --- SDS-PAGE analysis --- p.133 / Chapter 3.2.1.4 --- Western blot analysis --- p.134 / Chapter 3.2.1.5 --- Purification of MMC-TCS chimeric protein --- p.134 / Chapter 3.2.2 --- Results --- p.135 / Chapter 3.2.2.1 --- Construction of pET/MMC-TCS --- p.135 / Chapter 3.2.2.2 --- Expression of TCS/MMC chimeric cDNA --- p.140 / Chapter 3.2.2.3 --- Purification of MMC-TCS chimeric protein --- p.142 / Chapter 3.2.2.4 --- Reactivity of MMC-TCS chimeric protein with various antisera --- p.145 / Chapter 3.2.3 --- Discussion --- p.146 / Chapter CHAPTER 4 --- SCREENING OF αMMC IMMUNO-REACTIVE FRAGMENTS FROM A RANDOM FRAGMENT LIBRARY --- p.148 / Chapter 4.1 --- Materials and methods --- p.150 / Chapter 4.1.1 --- Description of the pTOPE vector --- p.150 / Chapter 4.1.2 --- Construction of an αMMC random fragment library --- p.152 / Chapter 4.1.2.1 --- Preparation of the cDNA insert of αMMC --- p.155 / Chapter 4.1.2.1.1 --- Large scale prearation of theE plasmid MMC18p8 --- p.155 / Chapter 4.1.2.1.2 --- Digestion of the plasmid MMC18p8 with EcoRI --- p.156 / Chapter 4.1.2.1.3 --- Electro-elution --- p.157 / Chapter 4.1.2.2 --- DNase I digestion --- p.158 / Chapter 4.1.2.3 --- Fractionation of DNA fragments --- p.159 / Chapter 4.1.2.3.1 --- Electrophoresis --- p.159 / Chapter 4.1.2.3.2 --- Electro-elution --- p.160 / Chapter 4.1.2.4 --- Single dA Tailing --- p.161 / Chapter 4.1.2.5 --- Ligation --- p.162 / Chapter 4.1.2.6 --- Transformation --- p.162 / Chapter 4.1.2.7 --- Controls --- p.163 / Chapter 4.1.2.7.1 --- Full-length αMMC cDNA control --- p.163 / Chapter 4.1.2.7.2 --- T-Vector ligation control --- p.164 / Chapter 4.1.2.8 --- Storage of the fragment library --- p.164 / Chapter 4.1.3 --- Immunoscreening of the random fragment library OF αMMC --- p.165 / Chapter 4.1.3.1 --- Anti-αMMC sera --- p.165 / Chapter 4.1.3.2 --- Purification of anti-αMMC sera --- p.165 / Chapter 4.1.3.3 --- Colony lift --- p.167 / Chapter 4.1.3.4 --- Induction of expression --- p.169 / Chapter 4.1.3.5 --- Colony lysis --- p.169 / Chapter 4.1.3.6 --- Immunoscreening --- p.170 / Chapter 4.1.4 --- PCR screening of inserts --- p.170 / Chapter 4.1.5 --- Amplification of positive signals --- p.172 / Chapter 4.1.6 --- Dot blot --- p.173 / Chapter 4.1.7 --- Confirmation of positive signals by Western blotting --- p.174 / Chapter 4.1.8 --- Analysis of positive clones by DNA sequencing --- p.175 / Chapter 4.1.9 --- Analysis of 3-dimensional structure of αMMC --- p.176 / Chapter 4.1.10 --- Effect of a monoclonal anti-αMMC antibody (#A1) on ribosome-inactivating activity of aMMC --- p.176 / Chapter 4.2 --- Results --- p.178 / Chapter 4.2.1 --- Theoretical considerations --- p.178 / Chapter 4.2.2 --- Construction of a random fragment library of αMMC cDNA --- p.180 / Chapter 4.2.3 --- Screening for immuno-reactive fragments of αMMC --- p.183 / Chapter 4.2.4 --- Confirmation of positive signals by Western blotting --- p.186 / Chapter 4.2.5 --- Estimation of fragment sizes by PCR --- p.188 / Chapter 4.2.6 --- Analysis of the fragment sequences --- p.190 / Chapter 4.2.7 --- Cross-reactivity of the immuno-reactive fragments --- p.194 / Chapter 4.2.8 --- Effect of a monoclonal anti-αMMC antibody (#A1) on ribosome-inactivating activity of αMMC --- p.196 / Chapter 4.3 --- Discussion --- p.198 / Chapter CHAPTER 5 --- GENERAL DISCUSSION --- p.200 / Concluding remarks --- p.214 / REFERENCES --- p.215 / APPENDIXES GENERAL PROCEDURES --- p.224 / Chapter A.l --- DNA sequencing --- p.224 / Chapter A.2 --- Purification of DNA with Gene Clean --- p.229 / Chapter A.3 --- Purification of primers after synthesis --- p.230 / Chapter A.4 --- Purification of plasmid DNA by Magic Prep (Promega) --- p.232 / Chapter A.5 --- Large-scale preparation of plasmid DNA by QIAGEN --- p.234 / Chapter A.6 --- Lowry protein determination --- p.236 / Chapter A.7 --- Preparation of acid phenol --- p.237 / Chapter A.8 --- SDS-polyacrylamide gel electrophoresis --- p.238

Strains of enteroaggregative E. scherichia colt (EAggEC), characterised by their pattern of adhesion to HEp-2 cells known as the `stacked brick' formation, are a significant cause of chronic diarrhoea in certain under-developed countries. Strains of EAggEC are detected either by a HEp-2 adhesion cell test or by an `aggregative adhesion' gene probe. The pathogenic mechanisms expressed by EAggEC are only poorly understood and the aim of the research described was to obtain a better understanding of how these bacteria cause disease. The adhesion of EAggEC to HEp-2 cells was shown in the majority of strains not to involve fimbriae and was thought to result from physical properties of strains such as charge, since EAggEC adhered to `fixed' HEp-2 cells and readily agglutinated a range of different erythrocytes. Certain strains of EAggEC, which also hybridised with a probe for diffuse adhesion, expressed membrane-associated proteins (MAPs) of 18 or 20 kDa responsible for HEp-2 adhesion. Divalent cations were essential for the expression of the MAPs, which did not contain disulphide bonds or have a quaternary structure. Strains of EAggEC did not express recognised subunit toxins such as Verocytotoxin or E. coil heat-labile toxin, and strains which hybridised with probes for enteroaggregativeh eat-stable toxin-1 did not produce E. coil heat-stable toxin detected by the infant mouse test. Some EAggEC strains (15%) had haemolytic properties. Certain strains expressed type II capsular polysaccharides and approximately 50% of strains expressed an aerobactin-mediated iron uptake system. It was concluded that strains of EAggEC belonged to a very diverse range of serotypes, and it was thought that this heterogeneity resulted from strains of E. coil readily acquiring the genes encoding the EAggEC phenotype. Strains of EAggEC were not associated with a single pathogenic phenotype and the ability of these bacteria to adhere to HEp-2 cells in a `stacked brick'-pattern remains the only common characteristic.