Zusammenfassung Untersuchungen zur Beeinflussung von experimentellen Salmonella Enteritidis PT4 Infektionen bei Küken durch den probiotischen Stamm Escherichia coli Nissle 1917 Imad Azmi Awadein Mohamed Institut für Bakteriologie und Mykologie, Veterinärmedizinische Fakultät, Universität Leipzig und Institut für Geflügelkrankheiten, Veterinärmedizinische Fakultät, Freie Universität Berlin Eingereicht im Januar, 2004 Schlüsselworte: (E. coli Stamm Nissle 1917, Küken, S. Enteritidis, Probiotika, Bdellovibrionen) (94 Seiten, 48 Abbildungen, 16 Tabellen und 150 Referenzen) 1- Untersucht wurden die Auswirkungen der oralen Applikation von E. coli Stamm Nissle 1917 und Bdellovibrio bacteriovorus auf die Reduktion der Ansiedlung von S. Enteritidis PT4, auf die Reduktion der Mortalitätsrate, auf die Gesamtzahl aerober und Gram-negativer Bakterien, auf die Anzahl von Bdellovibrionen und auf das Körpergewicht von SPF-Hühnern. Im Vergleich zur positiven Kontrollgruppe konnten bei der Ansiedlung von S. Enteritidis PT4 im Caecum der Testgruppen an den Tagen 14, 21 und 28 signifikante Unterschiede festgestellt werden. Im Vergleich zur positiven Kontrollgruppe, die eine Mortalitätsrate von 10% aufweist, war die Mortalitätsrate der Testgruppen deutlich reduziert. Ebenso waren in den Testgruppen die aerobe und Gram-negative Gesamtkeimzahl am Tag 28 im Vergleich zur positiven Kontrollgruppe deutlich verringert. Signifikanten Anstieg der Bdellovibrionen Anzahl zeigten die Testgruppen sowohl im Vergleich zur positiven als auch negativen Kontrollgruppe. Beim Vergleich zwischen dem Gesamtkörpergewicht der Testgruppen zu dem der negativen und den überlebenden Tieren der positiven Kontrollgruppe gab es keine signifikanten Unterschiede. 2- Untersucht wurden die Auswirkungen der oralen Applikation von E. coli Stamm Nissle 1917 und Bdellovibrio bacteriovorus auf die Reisolation von S. Enteritidis PT4 aus verschiedenen Teilen des Intestinaltrakts und diverser Organe von SPF-Hühnern. In Kropf, Proventrikel, Herzblut, Lunge, Leber und Milz der Testgruppen konnte im Vergleich zur positiven Kontrollgruppe eine Reduktion ermittelt werden, die Reisolation von S. Enteritidis aus dem Caecum der Testgruppen zeigte keinen Unterschied im Vergleich zur positiven Kontrollgruppe. 3- Untersucht wurden die Auswirkungen der oralen Applikation von E. coli Stamm Nissle 1917 und Bdellovibrio bacteriovorus an Konzentrationen von Serum-Avidin, IgY gegen S. Enteritidis und IgY gegen E. coli Nissle 1917 bei experimentell mit S. Enteritidis-infizierten SPF-Hühnern. Die Untersuchungen ergaben eine signifikante Senkung der Serum-Avidin-Konzentration im Vergleich zur positiven Kontrollgruppe, vor allem sieben Tage post infectionem mit S. Enteritidis. Ein signifikanter Anstieg der Konzentration von IgY gegen S. Enteritidis konnte bei den Testgruppen im Vergleich zur positiven Kontrollgruppe vor allem an den Tagen sieben verzeichnet werden. Ein signifikanter Anstieg der Konzentration von IgY gegen E. coli Nissle 1917 konnte in allen Testgruppen im Vergleich zur positiven Kontrollgruppe festgestellt werden. 4- Untersucht wurden die Auswirkungen der oralen Applikation von E. coli Nissle 1917 mit und ohne Plasmid auf die Reduktion der Ansiedelung von S. Enteritidis PT4, auf die Reduktion der Mortalitätsrate, die aerobe und Gram-negative Gesamtkeimzahl, die Bdellovibrionen-Gesamtkeimzahl, Keimzahlen von Lactobacillus, Bifidobacterium und C. perfringens und das Körpergewicht von SPF-Hühnern. Im Vergleich zur positiven Kontrollgruppe konnte im Caecum der Testgruppen ein signifikanter Rückgang der Ansiedelung von S. Enteritidis an den Tagen 7, 21 und 28 verzeichnet werden, außerdem konnte bei den Testgruppen kein Todesfall festgestellt werden, wohingegen die Sterblichkeitsrate der positiven Kontrollgruppe bei 15% lag. Ein signifikantes Absinken in der totalen Gesamtkeimzahl und der Gram-negativen Gesamtkeimzahl konnte für die Testgruppen im Vergleich zur positiven Kontrollgruppe an den Tagen 21 beziehungsweise 28 verzeichnet werden. Die Isolation von Bdellovibrionen aus den Testgruppen ergab keinen Unterschied zu den Kontrollgruppen. Die Lactobacillus-Bifidobacterium-Keimzahl war in den Testgruppen im Vergleich zur positiven Kontrollgruppe signifikant erhöht, vor allem am Tag sieben. Die C. perfringens-Keimzahl war in der positiven Kontrollgruppe gegenüber den Testgruppen am Tag 7 und 14 signifikant erhöht. Die Vergleiche des Körpergewichts der Testgruppen, negativer und überlebender Tiere der positiven Kontrollgruppe zeigten keinen signifikanten Unterschied. 5- Untersucht wurden die Auswirkungen der oralen Applikation von E. coli Stamm Nissle 1917 mit und ohne Plasmid auf die Reisolation von S. Enteritidis aus unterschiedlichen Teilen des Intestinaltraktes und aus Organen von SPF-Hühnern. Im Kropf, Proventrikel, Duodenum, Herzblut, Lunge, Leber und Milz konnte bei den Testgruppen im Vergleich zur positiven Kontrollgruppe eine Senkung der Reisolationsrate festgestellt werden, wohingegen sich keine Unterschied beim Vergleich der Caeca von positiver Kontrollgruppe und von den Testgruppen zeigte. 6- Untersucht wurden die Auswirkungen der oralen Applikation von E. coli Stamm Nissle 1917 mit und ohne Plasmid auf die Konzentrationen von Serum-Avidin, IgY gegen S. Enteritidis und IgY gegen E. coli Nissle 1917 bei experimentell mit S. Enteritidis-infizierten SPF-Hühnern. Bei der Serum-Avidin-Konzentration konnte kein Unterschied zwischen Testgruppen und positiver Kontrollgruppe festgestellt werden. Die Testgruppen zeigten ihrerseits im Vergleich zur positiven Kontrollgruppe eine signifikante Erhöhung der Konzentration von IgY gegen S. Enteritidis, vor allem an den Tagen 21 und 28. Ein signifikanter Anstieg der Konzentration von IgY gegen E. coli Nissle 1917 konnte in allen Testgruppen im Vergleich zur positiven Kontrollgruppe, vor allem an den Tagen sieben und vierzehn festgestellt werden. 7- Aus den Resultaten des ersten und des zweiten Versuchs schließen wir, dass der probiotische Stamm E. coli Nissle 1917 das Caecum von 7 bis 28 Tage alten Hühnern erfolgreich kolonialisieren kann. Orale Applikation des Stammes kann die Ansiedlung von S. Enteritidis, aerobe und Gram-negative Gesamtkeimzahl, Mortalitätsrate, Reisolationsrate von S. Enteritidis in Organen und im Intestinaltrakt (mit Ausnahme des Caecums im ersten Versuch) deutlich reduzieren. Die Kombination von E. coli Nissle 1917 und Bdellovibrio bacteriovorus hatte nicht den gewünschten Effekt, der auch von mehreren Autoren in-vitro beobachtet wurde. Bdellovibrionen waren in den Testgruppen des ersten Versuchs im Vergleich zu denen im zweiten deutlich erhöht. Beim durchschnittlichen Körpergewicht konnte kein signifikanter Unterschied zwischen beiden Versuchen festgestellt werden. Der Serum-Avidin-Spiegel war im ersten Versuch in der Testgruppe deutlich reduziert, im zweiten dagegen nicht. Dies ist möglicherweise auf den Effekt von Bdellovibrionen zurückzuführen, bedarf allerdings noch der weiteren Bestätigung. Im Allgemeinen konnten wir eine signifikante Verbesserung des Immunsystems der Vögel als Resultat der oralen Applikation von E. coli Nissle 1917 feststellen. 8- Untersucht wurden die antagonistischen Effekte von E. coli Stamm Nissle 1917 mit und ohne Plasmid auf die in-vitro-Wachstumsrate von S. Enteritidis PT4. Wir konnten feststellen, dass E. coli Nissle 1917 sowohl mit als auch ohne Plasmid die Wachstumsrate von S. Enteritidis erfolgreich reduzieren konnte. / Summary Influence of the probiotic strain Escherichia coli Nissle 1917 on experimental infections with Salmonella Enteritidis PT4 in chickens Imad Azmi Awadein Mohamed Institute of Bacteriology and Mycology, Faculty of Veterinary Medicine, University of Leipzig and Institute of Poultry Diseases, Faculty of Veterinary Medicine, Free University Berlin Submitted in January, 2004 Keywords: (E. coli strain Nissle 1917, chickens, S. Enteritidis, Probiotics, Bdellovibrios) (94 pages, 48 figures, 16 tables and 150 references) 1- The effect of oral application of E. coli strain Nissle 1917 with Bdellovibrio bacteriovorus on the colonization of S. Enteritidis PT4, reduction of the mortality rate, total aerobic bacterial counts, Gram negative bacterial counts, bdellovibrio bacterial counts and body weight of Specific Pathogen Free chickens were investigated. A significant reduction in the colonization of S. Enteritidis PT4 in the caecum of trial groups at 14, 21 and 28 days old in comparison to the positive control group was observed. A reduction in mortality rate in the trial groups was seen in comparison to the positive control group which had 10 %. The total aerobic and Gram negative bacterial counts were significantly decreased in the trial groups at 28 days old in comparison to the positive control group. Bdellovibrio bacterial counts were significantly increased in the trial groups in comparison to the control groups. No significant difference was seen in the mean body weight of the trial groups in comparison to control groups. 2- The effect of oral application of E. coli strain Nissle 1917 with Bdellovibrio bacteriovorus on reisolation rate of S. Enteritidis from different parts of the intestinal tract and organs of SPF chickens was investigated. A reduction in the S. Enteritidis reisolation rate was seen from crop, proventriculus, duodenum, heart blood, lungs, livers and spleens of the trial groups in comparison to the positive control group but not from the caecum. 3- The effect of oral application of E. coli strain Nissle 1917 and Bdellovibrio bacteriovorus on the serum avidin levels, IgY against S. Enteritidis and IgY against E. coli strain Nissle 1917 levels of SPF chickens experimentally infected with S. Enteritidis was investigated. A significant reduction in the serum avidin levels was observed in the trial groups at 7 days old in comparison to the positive control group. The antibody levels against S. Enteritidis was significantly increased in the trial group at 7 days old in comparison to the positive control group. A significant increase at day 7 in the antibody levels against E. coli strain Nissle 1917 was seen in the trial group in comparison to the positive control group. 4- The effect of oral application E. coli Nissle 1917 with and without plasmid on reduction on the colonization of S. Enteritidis PT4, reduction of the mortality rate, total aerobic bacterial counts, Gram negative bacterial counts, bdellovibrio bacterial counts, Lactobacillus-Bifidobacterium counts, C. perfringens bacterial counts and body weight of SPF chickens were investigated. A significant reduction in the colonization of S. Enteritidis PT4 in the caecum of trial groups at 7, 21 and 28 days old in comparison to the positive control group was observed. No mortalities were seen in the both trial groups in comparison to the positive control group which had 15 % mortalities. The total aerobic and Gram negative bacterial counts were significantly decreased in the trial groups at 21 and 28 days respectively old in comparison to the positive control group. No significant difference was observed in bdellovibrio isolation from the trial groups in comparison to the control group. Lactobacillus-Bifidobacterium bacterial counts were significantly increased in the trial groups at 7, 14 and 21 days old in comparison to the positive control group. A significant reduction in C. perfringens bacterial counts were seen in the trial groups at 7 and 14 days old in comparison to positive control group. No significant difference was observed in the mean body weight of the trial groups in comparison to control groups. 5- The effect of oral application E. coli Nissle 1917 with and without plasmid on the reisolation of S. Enteritidis from different parts of intestinal tract and organs of SPF chickens was investigated. A reduction in the S. Enteritidis reisolation rate was seen from crop, proventriculus, duodenum, caecum, heart blood, lungs, livers and spleens of the trial groups in comparison to the positive control group. 6- The effect of oral application E. coli Nissle 1917 with and without plasmid on the serum avidin levels, IgY against S. Enteritidis and IgY against E. coli strain Nissle 1917 levels of SPF chickens experimentally infected with S. Enteritidis were investigated. No significant reduction in the serum avidin levels were seen in the trial groups in comparison to the positive control group. The antibody levels against S. Enteritidis were significantly increased in the trial groups at 21 and 28 days old in comparison to the positive control group. A significant increase in the antibody levels against E. coli strain Nissle 1917 were seen in the trial groups in comparison to the positive control group. 7- From the results observed in the first and second experiments we concluded that probiotic strain E. coli Nissle 1917 can successfully colonize the caecum of SPF chickens from 7 to 28 days old. Oral appliction of probiotic strain E. coli Nissle 1917 has significantly reduced the S. Enteritidis colonization, total and Gram negative bacterial counts, mortality rate, reisolation rate of S. Enteritidis in organs and the intestinal tract except the caecum in first experiment in the trial groups in comparison to positive control. The combination between E. coli strain Nissle 1917 and B. bacteriovorus had not achieved the desirable effects in the first experiment which observed by many authors in vitro. Bdellovibrio was significantly increased in the trial groups of the first experiment in comparison to the second experiment. This may be a possible effect of Bdellovibrio which is yet to be confirmed. No significant difference was observed in the mean body weight in both experiment. A significant reduction of serum avidin levels were observed in the trial groups of the first experiment but not in the second experiment. We have observed a significant improvement in the immune system of the birds as a results of oral application of E. coli strain Nissle 1917. 8- Antagonistic effect of E. coli Nissle 1917 with and without plasmid on the growth rate of the S. Enteritidis PT4 in vitro was investigated. We concluded that E. coli Nissle 1917 with and without plasmid successfully reduced the growth rate of S. Enteritidis in comparison to the control one.

The aromatic beta-glucosides of plant origin, salicin and arbutin, serve as carbon sources for the sustenance of bacteria when ‘preferred’ sugars are absent in the environment. In the family Enterobacteriaceae, there are varied patterns for utilization of these beta-glucosides, wherein, in some members the ability to utilize salicin or arbutin is cryptic while in others it is completely absent. Escherichia coli harbors silent or cryptic genetic systems for the utilization of arbutin and salicin, which are activated by spontaneous mutation(s). Of these systems, the bgl operon of E.coli has been used as a paradigm for silent genes and extensive studies have been carried out to understand its silencing and activating mechanisms. Mutational activation of the wild type bgl operon in E.coli leads to the acquisition of the ability to utilize both arbutin and salicin. Preliminary studies have shown that aromatic beta-glucoside utilization in Shigella sonnei, which is evolutionarily related to E.coli, shows a two-step activation process wherein the wild type strain first becomes Arb+, which subsequently mutates to Sal+. The genetic systems responsible for beta-glucoside utilization, including the bgl operon, are conserved in S.sonnei to a large extent. A major difference is that the bglB gene encoding the phosphor-β-glucosidase B is insertionally inactivated in S.sonnei. As a result, activation of the bgl operon in the first stage leads to expression of the permease, BglF, which along with the phosphor-β-glucosidase A expressed from an unlinked constitutive gene, bglA, confers an Arb+phenotype. Salicin is not a substrate for the enzyme BglA and therefore a second mutational event is required for the acquisition of the Sal+ phenotype. Interestingly, the insertion within bglB is retained in AK102, the Sal+ second step mutant of S.sonnei. Therefore, the locus involved in conferring salicin utilization ability is unknown. However, S.sonnei is not amenable to routine genetic echniques and an E.coli bglB model was generated by creating an insertion in the bglB gene to identify the locus involved in conferring the Sal+ phenotype. Like S.sonnei, this E.coli strain, SD-1.3, also showed a two-step activation process for the utilization of salicin. Utilization of salicin in the Sal+ second step mutant of SD-1.3 could require activation of other silent genetic systems such as the asc operon and the chb operon or mutation in loci such as bglB or bglA. Linkage analysis by P1 transduction showed that activation of the asc operon is required for conferring a Sal+ phenotype in the second step mutant. The asc operon comprises of two genes, ascF encoding a PTS permease and ascB encoding a phosphor-β-glucosidaseB.The Precise mechanism of activation of the asc operon is not known but, it has been speculated that AscG, encoded by an upstream gene, acts as a repressor. Results presented in this thesis show that BglF is responsible for the transport of salicin and AscB provides the phosphor-β-glucosidase B in the Sal+ second step mutant of the E.coli strain SD-1.3. Analysis of the expression of the ascFB operon by measuring the transcripts as well as the activity of phosphor-β-glucosidase B showed that it is enhanced in the Sal+ second step mutant of SD-1.3 in the presence of the inducer. The expression of the ascFB operon is also increased constitutively when ascG is replaced by an antibiotic cassette in the parent strain SD-1.3 and the Arb+ first step mutant, indicating that AscG acts as a repressor for the asc operon. Moreover, inactivation of ascG in the parent leads to utilization of salicin in a single step by the activation of the bgl operon to provide the transport function, indicating that the inactivation of ascG is sufficient to activate the expression of ascB. Similarly, loss of AscG–mediated repression of the asc operon confers salicin utilization ability to the Arb+ first step mutant of SD-1.3. Interestingly, measurement of phosphor-β-glucosidase B activity in a Sal+ second step mutant derivative deleted for ascG showed a constitutive increase in the expression of the ascFB operon. Thus, AscG mediates the induction of the asc operon in response to salicin. In order to study the mechanism of activation of the asc operon, the ascB gene was cloned from the Arb+ first step mutant and the Sal+ second step mutant of SD-1.3 in a low copy number vector. Both these constructs were able to confer a Sal+ phenotype to the Arb+ first step mutant indicating absence of any genetic change in ascB in the Sal+ second step mutant. This was also confirmed by sequencing of ascB gene from the strains that showed no changes in the nucleotide sequence. Absence of any insertions within ascG showed that activation of the ascoperon is not achieved through disruption of ascG in the Sal+ second step mutants analyzed. AscG belongs to the GalR family of repressors in which some members require a mutation to enable the binding of sugar to mediate induction. Nucleotide sequence analysis showed that there was no change in the ascG gene in the Sal+ mutants analyzed. However, when the upstream regulatory region of the ascFB operon was analyzed a mutation was found in the -10 sequence of the putative promoter of the ascFB genes. This change leads to a stronger promoter as it brings the -10 sequence closer to the consensus sequence. Therefore, salicin utilization is achieved in the Sal+ second step mutant analyzed by an increase in expression of the asc operon by a promoter-up mutation. The negative effect of binding of AscG on expression of the ascFB operon is relieved in presence of the inducer, salicin. The possible role of the asc operon in salicin utilization in S.sonnei was tested by replacing the ascB gene by anantibiotic cassette in AK102, the Sal+ second step mutant of S. sonnei. This did not lead to loss of salicin utilization. By gene targeting approach it was also found that none of the phosphor-β-glucosidases known in E.coli are involved in degradation of salicin in AK102. A search of the S. sonnei genome database indicated the presence of two putative phosphor-β-glucosidases encoded by glvG and SSO1595. Replacement of glvG gene by anantibiotic cassette in AK102 did not lead to loss of salicin utilization. However, a similar replacement of SSO1595 in AK102 resulted in a Sal+ phenotype indicating that SSO1595 provides the phosphor-β-glucosidase in the Sal+ second step mutant of S. sonnei. A homolog of this enzyme is not present in E.coliorinany of the other members of the Shigella genus. Transcription alanalysis as well as measurement of phosphor-β-glucosidase B activity showed that expression of SSO1595 is enhanced constitutively in AK102. To study the mechanism of mutational activation for achieving salicin utilization in S. sonnei, SSO1595 was cloned from AK101, theArb+ first step mutant and AK102, the Sal+ second step mutant in a low copy numbe rvector. Both these constructs were able to confer a Sal+ phenotype to AK101 indicating an absence of genetic change in SSO1595 in AK102. This was also confirmed by sequencing of SSO1595 gene from the strains. Analysis of the upstream regulatory region of SSO1595 in AK102 indicated a deletion of around 1.0kbp sequence. This was also confirmed by nucleotide sequencing of the region. By primer extension analysis it was found that a new transcriptional start site is generated upstream to the deletion in the Sal+ second stepmutant of S.sonnei. Acquisition of the Sal+ phenotype in AK102 is therefore the resultof the SSO1595 gene being brought under a new promoter as a result of a DNA rearrangement. Overall, this study suggests that a high degree of similarity at the genomic level between organisms does not always ensure similarity in genetic mechanisms as two distinct pathways are responsible for conferring utilization of salicinin S. sonnei and E.coli.

Zusammenfassung Untersuchungen zur Beeinflussung von experimentellen Salmonella Enteritidis PT4 Infektionen bei Küken durch den probiotischen Stamm Escherichia coli Nissle 1917 Imad Azmi Awadein Mohamed Institut für Bakteriologie und Mykologie, Veterinärmedizinische Fakultät, Universität Leipzig und Institut für Geflügelkrankheiten, Veterinärmedizinische Fakultät, Freie Universität Berlin Eingereicht im Januar, 2004 Schlüsselworte: (E. coli Stamm Nissle 1917, Küken, S. Enteritidis, Probiotika, Bdellovibrionen) (94 Seiten, 48 Abbildungen, 16 Tabellen und 150 Referenzen) 1- Untersucht wurden die Auswirkungen der oralen Applikation von E. coli Stamm Nissle 1917 und Bdellovibrio bacteriovorus auf die Reduktion der Ansiedlung von S. Enteritidis PT4, auf die Reduktion der Mortalitätsrate, auf die Gesamtzahl aerober und Gram-negativer Bakterien, auf die Anzahl von Bdellovibrionen und auf das Körpergewicht von SPF-Hühnern. Im Vergleich zur positiven Kontrollgruppe konnten bei der Ansiedlung von S. Enteritidis PT4 im Caecum der Testgruppen an den Tagen 14, 21 und 28 signifikante Unterschiede festgestellt werden. Im Vergleich zur positiven Kontrollgruppe, die eine Mortalitätsrate von 10% aufweist, war die Mortalitätsrate der Testgruppen deutlich reduziert. Ebenso waren in den Testgruppen die aerobe und Gram-negative Gesamtkeimzahl am Tag 28 im Vergleich zur positiven Kontrollgruppe deutlich verringert. Signifikanten Anstieg der Bdellovibrionen Anzahl zeigten die Testgruppen sowohl im Vergleich zur positiven als auch negativen Kontrollgruppe. Beim Vergleich zwischen dem Gesamtkörpergewicht der Testgruppen zu dem der negativen und den überlebenden Tieren der positiven Kontrollgruppe gab es keine signifikanten Unterschiede. 2- Untersucht wurden die Auswirkungen der oralen Applikation von E. coli Stamm Nissle 1917 und Bdellovibrio bacteriovorus auf die Reisolation von S. Enteritidis PT4 aus verschiedenen Teilen des Intestinaltrakts und diverser Organe von SPF-Hühnern. In Kropf, Proventrikel, Herzblut, Lunge, Leber und Milz der Testgruppen konnte im Vergleich zur positiven Kontrollgruppe eine Reduktion ermittelt werden, die Reisolation von S. Enteritidis aus dem Caecum der Testgruppen zeigte keinen Unterschied im Vergleich zur positiven Kontrollgruppe. 3- Untersucht wurden die Auswirkungen der oralen Applikation von E. coli Stamm Nissle 1917 und Bdellovibrio bacteriovorus an Konzentrationen von Serum-Avidin, IgY gegen S. Enteritidis und IgY gegen E. coli Nissle 1917 bei experimentell mit S. Enteritidis-infizierten SPF-Hühnern. Die Untersuchungen ergaben eine signifikante Senkung der Serum-Avidin-Konzentration im Vergleich zur positiven Kontrollgruppe, vor allem sieben Tage post infectionem mit S. Enteritidis. Ein signifikanter Anstieg der Konzentration von IgY gegen S. Enteritidis konnte bei den Testgruppen im Vergleich zur positiven Kontrollgruppe vor allem an den Tagen sieben verzeichnet werden. Ein signifikanter Anstieg der Konzentration von IgY gegen E. coli Nissle 1917 konnte in allen Testgruppen im Vergleich zur positiven Kontrollgruppe festgestellt werden. 4- Untersucht wurden die Auswirkungen der oralen Applikation von E. coli Nissle 1917 mit und ohne Plasmid auf die Reduktion der Ansiedelung von S. Enteritidis PT4, auf die Reduktion der Mortalitätsrate, die aerobe und Gram-negative Gesamtkeimzahl, die Bdellovibrionen-Gesamtkeimzahl, Keimzahlen von Lactobacillus, Bifidobacterium und C. perfringens und das Körpergewicht von SPF-Hühnern. Im Vergleich zur positiven Kontrollgruppe konnte im Caecum der Testgruppen ein signifikanter Rückgang der Ansiedelung von S. Enteritidis an den Tagen 7, 21 und 28 verzeichnet werden, außerdem konnte bei den Testgruppen kein Todesfall festgestellt werden, wohingegen die Sterblichkeitsrate der positiven Kontrollgruppe bei 15% lag. Ein signifikantes Absinken in der totalen Gesamtkeimzahl und der Gram-negativen Gesamtkeimzahl konnte für die Testgruppen im Vergleich zur positiven Kontrollgruppe an den Tagen 21 beziehungsweise 28 verzeichnet werden. Die Isolation von Bdellovibrionen aus den Testgruppen ergab keinen Unterschied zu den Kontrollgruppen. Die Lactobacillus-Bifidobacterium-Keimzahl war in den Testgruppen im Vergleich zur positiven Kontrollgruppe signifikant erhöht, vor allem am Tag sieben. Die C. perfringens-Keimzahl war in der positiven Kontrollgruppe gegenüber den Testgruppen am Tag 7 und 14 signifikant erhöht. Die Vergleiche des Körpergewichts der Testgruppen, negativer und überlebender Tiere der positiven Kontrollgruppe zeigten keinen signifikanten Unterschied. 5- Untersucht wurden die Auswirkungen der oralen Applikation von E. coli Stamm Nissle 1917 mit und ohne Plasmid auf die Reisolation von S. Enteritidis aus unterschiedlichen Teilen des Intestinaltraktes und aus Organen von SPF-Hühnern. Im Kropf, Proventrikel, Duodenum, Herzblut, Lunge, Leber und Milz konnte bei den Testgruppen im Vergleich zur positiven Kontrollgruppe eine Senkung der Reisolationsrate festgestellt werden, wohingegen sich keine Unterschied beim Vergleich der Caeca von positiver Kontrollgruppe und von den Testgruppen zeigte. 6- Untersucht wurden die Auswirkungen der oralen Applikation von E. coli Stamm Nissle 1917 mit und ohne Plasmid auf die Konzentrationen von Serum-Avidin, IgY gegen S. Enteritidis und IgY gegen E. coli Nissle 1917 bei experimentell mit S. Enteritidis-infizierten SPF-Hühnern. Bei der Serum-Avidin-Konzentration konnte kein Unterschied zwischen Testgruppen und positiver Kontrollgruppe festgestellt werden. Die Testgruppen zeigten ihrerseits im Vergleich zur positiven Kontrollgruppe eine signifikante Erhöhung der Konzentration von IgY gegen S. Enteritidis, vor allem an den Tagen 21 und 28. Ein signifikanter Anstieg der Konzentration von IgY gegen E. coli Nissle 1917 konnte in allen Testgruppen im Vergleich zur positiven Kontrollgruppe, vor allem an den Tagen sieben und vierzehn festgestellt werden. 7- Aus den Resultaten des ersten und des zweiten Versuchs schließen wir, dass der probiotische Stamm E. coli Nissle 1917 das Caecum von 7 bis 28 Tage alten Hühnern erfolgreich kolonialisieren kann. Orale Applikation des Stammes kann die Ansiedlung von S. Enteritidis, aerobe und Gram-negative Gesamtkeimzahl, Mortalitätsrate, Reisolationsrate von S. Enteritidis in Organen und im Intestinaltrakt (mit Ausnahme des Caecums im ersten Versuch) deutlich reduzieren. Die Kombination von E. coli Nissle 1917 und Bdellovibrio bacteriovorus hatte nicht den gewünschten Effekt, der auch von mehreren Autoren in-vitro beobachtet wurde. Bdellovibrionen waren in den Testgruppen des ersten Versuchs im Vergleich zu denen im zweiten deutlich erhöht. Beim durchschnittlichen Körpergewicht konnte kein signifikanter Unterschied zwischen beiden Versuchen festgestellt werden. Der Serum-Avidin-Spiegel war im ersten Versuch in der Testgruppe deutlich reduziert, im zweiten dagegen nicht. Dies ist möglicherweise auf den Effekt von Bdellovibrionen zurückzuführen, bedarf allerdings noch der weiteren Bestätigung. Im Allgemeinen konnten wir eine signifikante Verbesserung des Immunsystems der Vögel als Resultat der oralen Applikation von E. coli Nissle 1917 feststellen. 8- Untersucht wurden die antagonistischen Effekte von E. coli Stamm Nissle 1917 mit und ohne Plasmid auf die in-vitro-Wachstumsrate von S. Enteritidis PT4. Wir konnten feststellen, dass E. coli Nissle 1917 sowohl mit als auch ohne Plasmid die Wachstumsrate von S. Enteritidis erfolgreich reduzieren konnte. / Summary Influence of the probiotic strain Escherichia coli Nissle 1917 on experimental infections with Salmonella Enteritidis PT4 in chickens Imad Azmi Awadein Mohamed Institute of Bacteriology and Mycology, Faculty of Veterinary Medicine, University of Leipzig and Institute of Poultry Diseases, Faculty of Veterinary Medicine, Free University Berlin Submitted in January, 2004 Keywords: (E. coli strain Nissle 1917, chickens, S. Enteritidis, Probiotics, Bdellovibrios) (94 pages, 48 figures, 16 tables and 150 references) 1- The effect of oral application of E. coli strain Nissle 1917 with Bdellovibrio bacteriovorus on the colonization of S. Enteritidis PT4, reduction of the mortality rate, total aerobic bacterial counts, Gram negative bacterial counts, bdellovibrio bacterial counts and body weight of Specific Pathogen Free chickens were investigated. A significant reduction in the colonization of S. Enteritidis PT4 in the caecum of trial groups at 14, 21 and 28 days old in comparison to the positive control group was observed. A reduction in mortality rate in the trial groups was seen in comparison to the positive control group which had 10 %. The total aerobic and Gram negative bacterial counts were significantly decreased in the trial groups at 28 days old in comparison to the positive control group. Bdellovibrio bacterial counts were significantly increased in the trial groups in comparison to the control groups. No significant difference was seen in the mean body weight of the trial groups in comparison to control groups. 2- The effect of oral application of E. coli strain Nissle 1917 with Bdellovibrio bacteriovorus on reisolation rate of S. Enteritidis from different parts of the intestinal tract and organs of SPF chickens was investigated. A reduction in the S. Enteritidis reisolation rate was seen from crop, proventriculus, duodenum, heart blood, lungs, livers and spleens of the trial groups in comparison to the positive control group but not from the caecum. 3- The effect of oral application of E. coli strain Nissle 1917 and Bdellovibrio bacteriovorus on the serum avidin levels, IgY against S. Enteritidis and IgY against E. coli strain Nissle 1917 levels of SPF chickens experimentally infected with S. Enteritidis was investigated. A significant reduction in the serum avidin levels was observed in the trial groups at 7 days old in comparison to the positive control group. The antibody levels against S. Enteritidis was significantly increased in the trial group at 7 days old in comparison to the positive control group. A significant increase at day 7 in the antibody levels against E. coli strain Nissle 1917 was seen in the trial group in comparison to the positive control group. 4- The effect of oral application E. coli Nissle 1917 with and without plasmid on reduction on the colonization of S. Enteritidis PT4, reduction of the mortality rate, total aerobic bacterial counts, Gram negative bacterial counts, bdellovibrio bacterial counts, Lactobacillus-Bifidobacterium counts, C. perfringens bacterial counts and body weight of SPF chickens were investigated. A significant reduction in the colonization of S. Enteritidis PT4 in the caecum of trial groups at 7, 21 and 28 days old in comparison to the positive control group was observed. No mortalities were seen in the both trial groups in comparison to the positive control group which had 15 % mortalities. The total aerobic and Gram negative bacterial counts were significantly decreased in the trial groups at 21 and 28 days respectively old in comparison to the positive control group. No significant difference was observed in bdellovibrio isolation from the trial groups in comparison to the control group. Lactobacillus-Bifidobacterium bacterial counts were significantly increased in the trial groups at 7, 14 and 21 days old in comparison to the positive control group. A significant reduction in C. perfringens bacterial counts were seen in the trial groups at 7 and 14 days old in comparison to positive control group. No significant difference was observed in the mean body weight of the trial groups in comparison to control groups. 5- The effect of oral application E. coli Nissle 1917 with and without plasmid on the reisolation of S. Enteritidis from different parts of intestinal tract and organs of SPF chickens was investigated. A reduction in the S. Enteritidis reisolation rate was seen from crop, proventriculus, duodenum, caecum, heart blood, lungs, livers and spleens of the trial groups in comparison to the positive control group. 6- The effect of oral application E. coli Nissle 1917 with and without plasmid on the serum avidin levels, IgY against S. Enteritidis and IgY against E. coli strain Nissle 1917 levels of SPF chickens experimentally infected with S. Enteritidis were investigated. No significant reduction in the serum avidin levels were seen in the trial groups in comparison to the positive control group. The antibody levels against S. Enteritidis were significantly increased in the trial groups at 21 and 28 days old in comparison to the positive control group. A significant increase in the antibody levels against E. coli strain Nissle 1917 were seen in the trial groups in comparison to the positive control group. 7- From the results observed in the first and second experiments we concluded that probiotic strain E. coli Nissle 1917 can successfully colonize the caecum of SPF chickens from 7 to 28 days old. Oral appliction of probiotic strain E. coli Nissle 1917 has significantly reduced the S. Enteritidis colonization, total and Gram negative bacterial counts, mortality rate, reisolation rate of S. Enteritidis in organs and the intestinal tract except the caecum in first experiment in the trial groups in comparison to positive control. The combination between E. coli strain Nissle 1917 and B. bacteriovorus had not achieved the desirable effects in the first experiment which observed by many authors in vitro. Bdellovibrio was significantly increased in the trial groups of the first experiment in comparison to the second experiment. This may be a possible effect of Bdellovibrio which is yet to be confirmed. No significant difference was observed in the mean body weight in both experiment. A significant reduction of serum avidin levels were observed in the trial groups of the first experiment but not in the second experiment. We have observed a significant improvement in the immune system of the birds as a results of oral application of E. coli strain Nissle 1917. 8- Antagonistic effect of E. coli Nissle 1917 with and without plasmid on the growth rate of the S. Enteritidis PT4 in vitro was investigated. We concluded that E. coli Nissle 1917 with and without plasmid successfully reduced the growth rate of S. Enteritidis in comparison to the control one.