Menschen nehmen Tausende von Stoffen als bitter wahr. Die chemische Struktur der verschiedenen Bitterstoffe ist sehr vielfältig: Sie reicht von kleinen Molekülen wie Kaliumchlorid oder Harnstoff, bis zu sehr komplexen organischen Verbindungen. Die Größe der einzigen bekannten menschlichen Familie von Bitterrezeptoren (TAS2Rs) wurde auf nur ca. 80-120 Mitglieder geschätzt. In Anbetracht der hohen Zahl und Komplexität der Bitterstoffe erscheint die Zahl von Rezeptoren als sehr gering. Dies führt natürlich zu einer Reihe von Fragen: Wie viele Mitglieder hat die menschliche TAS2R-Genfamilie? Wie viele verschiedene Substanzen können denselben Rezeptor aktivieren? Scheint die Zahl der TAS2R-Rezeptoren ausreichend, alle Bitterstoffe wahrnehmen zu können oder muss es noch andere Bitterrezeptorfamilien geben? Diese Fragen zu beantworten, ist das Ziel der vorliegenden Arbeit. <br /> <br /> Hier durchgeführte Analysen des menschlichen Genomprojektes zeigen, dass Menschen ca. 25 TAS2R-Rezeptoren besitzt, die eine sehr divergente Aminosäurestruktur aufweisen. Diese Rezeptoren wurden in eine neu entwickelte Expressionskassette kloniert, die den Transport des Rezeptors an die Zelloberfläche ermöglicht. Um Liganden für die menschliche TAS2R-Rezeptoren zu identifizieren, wurden die Rezeptoren in HEK293 Zellen exprimiert und mit verschiedenen Bitterstoffen stimuliert. Der Nachweis der Rezeptoraktivierung erfolgte durch Calcium-Imaging. Es konnte gezeigt werden, dass hTAS2R16 der menschliche Rezeptor zur Wahrnehmung von Salicin und verwandten bitteren Pyranosiden ist. So wird hTAS2R16 in HEK293 Zellen durch Salicin und chemisch verwandte Substanzen aktiviert. Ein Vergleich der in diesem Messsystem erhaltenen Daten mit psychophysikalisch ermittelten Geschmackswahrnehmungen beim Menschen, ergab eine hohe Übereinstimmung. Die Ergebnisse deuten auch darauf hin, dass die Desensitiverung einzelner Rezeptoren die Ursache für die Adaption des Bittergeschmacks ist. Der Nachweis der Expression des Rezeptors in menschlichen Geschmackspapillen, sowie die festgestellte Assoziation des G/A Polymorpphismus an Position 665 des hTAS2R16 Gens mit einer reduzierten Salicinwahrnehmung, sind weitere unabhängige Beweise für diese These. Ein anderer menschlicher Rezeptor, hTAS2R10, wird durch die Bitterstoffe Strychnin, Brucin und Denatonium aktiviert. Dies sowie die Tatsache, dass die zur Aktivierung benutzten Konzentrationen eine sinnvolle Korrelation zu dem menschlichen Geschmacksschwellwert von Strychnin zeigen, sind starke Hinweise, dass hTAS2R10 der menschliche Rezeptor zur Wahrnehmung von Strychnin und verwandten Substanzen ist. <br /> <br /> Die vorliegenden Daten zeigen eindeutig, dass die TAS2R-Rezeptoren auch beim Menschen Bitterrezeptoren darstellen. Sowohl hTAS2R16, als auch hTAS2R10 werden durch ein Spektrum strukturell sehr unterschiedlicher Bitterstoffe aktiviert. Falls die anderen Mitglieder der TAS2R-Familie ebenfalls dieses Verhalten zeigen, wäre es möglich, dass die nur ca. 25 Mitglieder umfassende TAS2R-Rezeptorfamilie des Menschen tatsächlich zur Wahrnehmung aller Bitterstoffe ausreicht. / Bitter taste generally is aversive and protects vertebrates from ingestion of toxic substances, but bitter tastants also contribute to the enjoyment and palatability of food influencing human nutritional habits. Although bitter taste has been extensively studied, receptor mechanisms are still poorly understood. Anatomic, functional and genetic evidence from rodents suggested, however, that the T2R genes encode a family of bitter receptors while definite proof is missing in humans 6. We here report that the hT2R16 receptor is present in vallate papilla taste buds of the human tongue and activated by bitter b-glucopyranosides. These phytonutrients did not activate any other human T2R and showed similar concentration-response relations and cross-desensitization in hT2R16 expressing cells and psychobiological experiments. hT2R16 is broadly tuned. It binds bitter compounds that share only a b-glycosidic bond and a glucose residue. The broad tuning of T2Rs could explain how a limited number of receptors permits the perception and coding of numerous and different bitter substances. Together our data identify the hT2R16 as a broadly tuned, genuine human bitter receptor for b-glucopyranosides.

A busca por um padrão estético globalizado e o aumento da obesidade fazem crescer o uso de suplementos alimentares e compostos emagrecedores à base de extratos vegetais. Produtos contendo a associação de p-sinefrina, efedrina, salicina e cafeína são amplamente consumidos e não apresentam efetividade e segurança bem esclarecidas. Portanto, o objetivo deste trabalho foi avaliar a toxicidade subcrônica de p-sinefrina, efedrina, cafeína e salicina, isoladas e em associação, em ratos Wistar machos. Doses de salicina 6 mg/kg, efedrina 4 mg/kg, p-sinefrina 10 mg/kg, cafeína 80 mg/kg e a associação de salicina, efedrina, p-sinefrina e cafeína 100 mg/kg (6:4:10:80, respectivamente) foram testadas via oral por 28 dias consecutivos. A massa corporal foi verificada semanalmente e o teste da atividade locomotora foi realizado no 28º dia. O sangue foi coletado para análise bioquímica e órgãos vitais como fígado e rins foram utilizados para avaliação histológica. Os resultados mostraram uma redução significativa (p<0,05) na massa corporal nos dias 21 e 28 do grupo tratado com cafeína comparado ao grupo controle. Nos dias 14, 21 e 28 ocorreu um aumento significativo (p<0,05) da massa corporal no grupo tratado com p-sinefrina comparado com os grupos efedrina, salicina, cafeína e associação. No teste da atividade locomotora houve um aumento significativo (p<0,05) no grupo tratado com a associação comparado ao grupo controle. Não foram encontradas alterações nos marcadores bioquímicos de fígado, rim e coração, bem como nas avaliações macroscópicas dos órgãos vitais. Entretanto, na análise histológica do fígado, verificou-se em todos os grupos a presença de vacuolização e tumefação celular, congestão vascular e alargamento dos sinusóides, e apenas os grupos p-sinefrina, efedrina e salicina apresentaram degeneração hidrópica. Na histologia dos rins todos os grupos demonstraram vacuolização celular e aumento do espaço da cápsula de Bowman e o grupo p-sinefrina mostrou a presença de infiltrado inflamatório. Esses resultados sugerem que o uso dessas substâncias, tanto na forma isolada como em associação, apresenta um perfil toxicológico considerável. / The search for a globalized aesthetic standard and the increasing obesity are enhancing the use of food supplements and weight loss compounds from plant base extracts. Products containing the combination of p-synephrine, ephedrine, caffeine and salicin are widely consumed and the effectiveness and safety are not well understood. Therefore, the aim of this study was to evaluate the subchronic toxicity of p-synephrine, ephedrine, caffeine and salicin, isolated and in combination, in male Wistar rats. Doses of salicin 6 mg/kg, ephedrine 4 mg/kg, p-synephrine 10 mg/kg, caffeine 80 mg/kg and the association of salicin, ephedrine, p-synephrine and caffeine (100 mg/kg; 6:4:10:80, respectively) were administered orally for 28 consecutive days. Body weight was recorded weekly and a locomotor activity test was performed on the 28th day. Blood was collected for biochemical analysis and vital organs such as liver and kidneys were used for histologic evaluation. The results showed a significant reduction (p <0.05) in body mass on days 21 and 28 in the caffeine-treated group compared to control group. Besides that, on days 14, 21 and 28 a significant increase (p <0.05) in body weight was observed in the group treated with p-synephrine compared to the ephedrine, salicin, caffeine and association-treated groups. In the test of locomotor activity, a significant increase (p <0.05) was observed in the association-treated group treated compared to the control group. No changes were found in biochemical markers associated with liver, kidney and heart conditions or in macroscopic evaluations of vital organs. However, the histological analysis of the liver in all groups shown presence of cellular vacuolization and swelling, vascular congestion and enlargement of the sinusoids, whereas the p-synephrine, ephedrine and salicin groups exhibited hydropic degeneration. In the histology of kidneys, all groups showed cellular vacuolation and increased of the Bowman's capsule space and the p-synephrine group showed the presence of inflammatory infiltrate. These results suggest that the use of these substances either in isolation or in combination showed a considerable toxicological profile.

The aromatic beta-glucosides of plant origin, salicin and arbutin, serve as carbon sources for the sustenance of bacteria when ‘preferred’ sugars are absent in the environment. In the family Enterobacteriaceae, there are varied patterns for utilization of these beta-glucosides, wherein, in some members the ability to utilize salicin or arbutin is cryptic while in others it is completely absent. Escherichia coli harbors silent or cryptic genetic systems for the utilization of arbutin and salicin, which are activated by spontaneous mutation(s). Of these systems, the bgl operon of E.coli has been used as a paradigm for silent genes and extensive studies have been carried out to understand its silencing and activating mechanisms. Mutational activation of the wild type bgl operon in E.coli leads to the acquisition of the ability to utilize both arbutin and salicin. Preliminary studies have shown that aromatic beta-glucoside utilization in Shigella sonnei, which is evolutionarily related to E.coli, shows a two-step activation process wherein the wild type strain first becomes Arb+, which subsequently mutates to Sal+. The genetic systems responsible for beta-glucoside utilization, including the bgl operon, are conserved in S.sonnei to a large extent. A major difference is that the bglB gene encoding the phosphor-β-glucosidase B is insertionally inactivated in S.sonnei. As a result, activation of the bgl operon in the first stage leads to expression of the permease, BglF, which along with the phosphor-β-glucosidase A expressed from an unlinked constitutive gene, bglA, confers an Arb+phenotype. Salicin is not a substrate for the enzyme BglA and therefore a second mutational event is required for the acquisition of the Sal+ phenotype. Interestingly, the insertion within bglB is retained in AK102, the Sal+ second step mutant of S.sonnei. Therefore, the locus involved in conferring salicin utilization ability is unknown. However, S.sonnei is not amenable to routine genetic echniques and an E.coli bglB model was generated by creating an insertion in the bglB gene to identify the locus involved in conferring the Sal+ phenotype. Like S.sonnei, this E.coli strain, SD-1.3, also showed a two-step activation process for the utilization of salicin. Utilization of salicin in the Sal+ second step mutant of SD-1.3 could require activation of other silent genetic systems such as the asc operon and the chb operon or mutation in loci such as bglB or bglA. Linkage analysis by P1 transduction showed that activation of the asc operon is required for conferring a Sal+ phenotype in the second step mutant. The asc operon comprises of two genes, ascF encoding a PTS permease and ascB encoding a phosphor-β-glucosidaseB.The Precise mechanism of activation of the asc operon is not known but, it has been speculated that AscG, encoded by an upstream gene, acts as a repressor. Results presented in this thesis show that BglF is responsible for the transport of salicin and AscB provides the phosphor-β-glucosidase B in the Sal+ second step mutant of the E.coli strain SD-1.3. Analysis of the expression of the ascFB operon by measuring the transcripts as well as the activity of phosphor-β-glucosidase B showed that it is enhanced in the Sal+ second step mutant of SD-1.3 in the presence of the inducer. The expression of the ascFB operon is also increased constitutively when ascG is replaced by an antibiotic cassette in the parent strain SD-1.3 and the Arb+ first step mutant, indicating that AscG acts as a repressor for the asc operon. Moreover, inactivation of ascG in the parent leads to utilization of salicin in a single step by the activation of the bgl operon to provide the transport function, indicating that the inactivation of ascG is sufficient to activate the expression of ascB. Similarly, loss of AscG–mediated repression of the asc operon confers salicin utilization ability to the Arb+ first step mutant of SD-1.3. Interestingly, measurement of phosphor-β-glucosidase B activity in a Sal+ second step mutant derivative deleted for ascG showed a constitutive increase in the expression of the ascFB operon. Thus, AscG mediates the induction of the asc operon in response to salicin. In order to study the mechanism of activation of the asc operon, the ascB gene was cloned from the Arb+ first step mutant and the Sal+ second step mutant of SD-1.3 in a low copy number vector. Both these constructs were able to confer a Sal+ phenotype to the Arb+ first step mutant indicating absence of any genetic change in ascB in the Sal+ second step mutant. This was also confirmed by sequencing of ascB gene from the strains that showed no changes in the nucleotide sequence. Absence of any insertions within ascG showed that activation of the ascoperon is not achieved through disruption of ascG in the Sal+ second step mutants analyzed. AscG belongs to the GalR family of repressors in which some members require a mutation to enable the binding of sugar to mediate induction. Nucleotide sequence analysis showed that there was no change in the ascG gene in the Sal+ mutants analyzed. However, when the upstream regulatory region of the ascFB operon was analyzed a mutation was found in the -10 sequence of the putative promoter of the ascFB genes. This change leads to a stronger promoter as it brings the -10 sequence closer to the consensus sequence. Therefore, salicin utilization is achieved in the Sal+ second step mutant analyzed by an increase in expression of the asc operon by a promoter-up mutation. The negative effect of binding of AscG on expression of the ascFB operon is relieved in presence of the inducer, salicin. The possible role of the asc operon in salicin utilization in S.sonnei was tested by replacing the ascB gene by anantibiotic cassette in AK102, the Sal+ second step mutant of S. sonnei. This did not lead to loss of salicin utilization. By gene targeting approach it was also found that none of the phosphor-β-glucosidases known in E.coli are involved in degradation of salicin in AK102. A search of the S. sonnei genome database indicated the presence of two putative phosphor-β-glucosidases encoded by glvG and SSO1595. Replacement of glvG gene by anantibiotic cassette in AK102 did not lead to loss of salicin utilization. However, a similar replacement of SSO1595 in AK102 resulted in a Sal+ phenotype indicating that SSO1595 provides the phosphor-β-glucosidase in the Sal+ second step mutant of S. sonnei. A homolog of this enzyme is not present in E.coliorinany of the other members of the Shigella genus. Transcription alanalysis as well as measurement of phosphor-β-glucosidase B activity showed that expression of SSO1595 is enhanced constitutively in AK102. To study the mechanism of mutational activation for achieving salicin utilization in S. sonnei, SSO1595 was cloned from AK101, theArb+ first step mutant and AK102, the Sal+ second step mutant in a low copy numbe rvector. Both these constructs were able to confer a Sal+ phenotype to AK101 indicating an absence of genetic change in SSO1595 in AK102. This was also confirmed by sequencing of SSO1595 gene from the strains. Analysis of the upstream regulatory region of SSO1595 in AK102 indicated a deletion of around 1.0kbp sequence. This was also confirmed by nucleotide sequencing of the region. By primer extension analysis it was found that a new transcriptional start site is generated upstream to the deletion in the Sal+ second stepmutant of S.sonnei. Acquisition of the Sal+ phenotype in AK102 is therefore the resultof the SSO1595 gene being brought under a new promoter as a result of a DNA rearrangement. Overall, this study suggests that a high degree of similarity at the genomic level between organisms does not always ensure similarity in genetic mechanisms as two distinct pathways are responsible for conferring utilization of salicinin S. sonnei and E.coli.

Pastaruoju metu pasaulyje ir Lietuvoje vis didėja nesteroidinių vaistų nuo uždegimo (NVNU) vartojimas. Minėti vaistai turi įtakos virškinamojo trakto sutrikimams, kelia grėsmę širdies ir kraujagyslių sistemai. Dėl didelės NVNU sukeliamų komplikacijų rizikos, siekiama ieškoti naujų augalinių šaltinių, kurių vartojimas esant uždegiminiams procesams galimai sukelia mažesnius nepageidaujamus poveikius. Vienas iš potencialių variantų – gluosnio žievės ekstraktas. Gluosnis plačiai paplitęs augalas, pasižymintis priešuždegiminiu poveikiu, tinkamas vartoti esant osteoartritui, apatinės nugaros dalies skausmui, siekiant išvengti trombocitų agregacijos, slopinantis storosios žarnos ir plaučių vėžinių ląstelių proliferaciją. Tyrimo tikslas. Pritaikant efektyviosios skysčių chromatografijos metodą nustatyti Lietuvoje augančių gluosnių žievėje esančio salicino kiekio pasiskirstymą. Uždaviniai: 1. Išanalizuoti ir apibendrinti moksliniuose šaltiniuose pateiktą informaciją apie gluosnių gentį, augalo pritaikymą medicinoje, taikytinas tyrimo metodikas. 2. Nustatyti tinkamiausias ekstrakcijos sąlygas gluosnio žievėje esančių veikliųjų junginių ekstrahavimui bei optimizuoti efektyviosios skysčių chromatografijos (ESC) metodiką junginių identifikavimui. 3. Atlikti gluosnio vaistinės augalinės žaliavos tyrimams pritaikytos ESC metodikos validaciją. 4. Statistiškai įvertinti bei palyginti gluosnio žievėje esančio salicino kiekio pasiskirstymą trijuose Lietuvos regionuose (Kelmės, Kauno... [toliau žr. visą tekstą] / In the world and in Lithuania the use of non-steroidal anti-inflammatory drugs (NSAIDs) is growing. Mentioned drugs affect the digestive tract and threaten cardiovascular system. Due to the high risk of complications caused by NSAIDs it is aimed to find new sources of plants, whose use in inflammatory conditions potentially causes less side effects. One of the potential options is willow bark extract. Willow is wildspread plant, having anti-inflammatory properties, suitable for use in the treatment of osteoarthritis, low back pain, to prevent platelet aggregation, inhibitting proliferation of colon and lung cancer cells. Aim of the study. Using high-performance liquid chromatography to determine salicin distribution in the bark of Lithuanian willows. Objectives of the study: 1. Analyze and summarize the scientific sources of information about the willow genus, the plant application in medicine, applied research methodologies. 2. Determine the most appropriate conditions for the extraction of active compounds of the willow bark and optimize HPLC methodology for the identification of compounds. 3. Perform validation of HPLC method for studies of the willow bark. 4. Statistically evaluate and compare distribution of salicin amount of willow bark in the three regions of Lithuania (Kelmė, Kaunas, Marijampolė). HPLC was chosen as a method. The raw material moisture was estimated (from 7.98 to 12.61 per cent.). HPLC method was optimized, validated for the identification of active... [to full text]

A busca por um padrão estético globalizado e o aumento da obesidade fazem crescer o uso de suplementos alimentares e compostos emagrecedores à base de extratos vegetais. Produtos contendo a associação de p-sinefrina, efedrina, salicina e cafeína são amplamente consumidos e não apresentam efetividade e segurança bem esclarecidas. Portanto, o objetivo deste trabalho foi avaliar a toxicidade subcrônica de p-sinefrina, efedrina, cafeína e salicina, isoladas e em associação, em ratos Wistar machos. Doses de salicina 6 mg/kg, efedrina 4 mg/kg, p-sinefrina 10 mg/kg, cafeína 80 mg/kg e a associação de salicina, efedrina, p-sinefrina e cafeína 100 mg/kg (6:4:10:80, respectivamente) foram testadas via oral por 28 dias consecutivos. A massa corporal foi verificada semanalmente e o teste da atividade locomotora foi realizado no 28º dia. O sangue foi coletado para análise bioquímica e órgãos vitais como fígado e rins foram utilizados para avaliação histológica. Os resultados mostraram uma redução significativa (p<0,05) na massa corporal nos dias 21 e 28 do grupo tratado com cafeína comparado ao grupo controle. Nos dias 14, 21 e 28 ocorreu um aumento significativo (p<0,05) da massa corporal no grupo tratado com p-sinefrina comparado com os grupos efedrina, salicina, cafeína e associação. No teste da atividade locomotora houve um aumento significativo (p<0,05) no grupo tratado com a associação comparado ao grupo controle. Não foram encontradas alterações nos marcadores bioquímicos de fígado, rim e coração, bem como nas avaliações macroscópicas dos órgãos vitais. Entretanto, na análise histológica do fígado, verificou-se em todos os grupos a presença de vacuolização e tumefação celular, congestão vascular e alargamento dos sinusóides, e apenas os grupos p-sinefrina, efedrina e salicina apresentaram degeneração hidrópica. Na histologia dos rins todos os grupos demonstraram vacuolização celular e aumento do espaço da cápsula de Bowman e o grupo p-sinefrina mostrou a presença de infiltrado inflamatório. Esses resultados sugerem que o uso dessas substâncias, tanto na forma isolada como em associação, apresenta um perfil toxicológico considerável. / The search for a globalized aesthetic standard and the increasing obesity are enhancing the use of food supplements and weight loss compounds from plant base extracts. Products containing the combination of p-synephrine, ephedrine, caffeine and salicin are widely consumed and the effectiveness and safety are not well understood. Therefore, the aim of this study was to evaluate the subchronic toxicity of p-synephrine, ephedrine, caffeine and salicin, isolated and in combination, in male Wistar rats. Doses of salicin 6 mg/kg, ephedrine 4 mg/kg, p-synephrine 10 mg/kg, caffeine 80 mg/kg and the association of salicin, ephedrine, p-synephrine and caffeine (100 mg/kg; 6:4:10:80, respectively) were administered orally for 28 consecutive days. Body weight was recorded weekly and a locomotor activity test was performed on the 28th day. Blood was collected for biochemical analysis and vital organs such as liver and kidneys were used for histologic evaluation. The results showed a significant reduction (p <0.05) in body mass on days 21 and 28 in the caffeine-treated group compared to control group. Besides that, on days 14, 21 and 28 a significant increase (p <0.05) in body weight was observed in the group treated with p-synephrine compared to the ephedrine, salicin, caffeine and association-treated groups. In the test of locomotor activity, a significant increase (p <0.05) was observed in the association-treated group treated compared to the control group. No changes were found in biochemical markers associated with liver, kidney and heart conditions or in macroscopic evaluations of vital organs. However, the histological analysis of the liver in all groups shown presence of cellular vacuolization and swelling, vascular congestion and enlargement of the sinusoids, whereas the p-synephrine, ephedrine and salicin groups exhibited hydropic degeneration. In the histology of kidneys, all groups showed cellular vacuolation and increased of the Bowman's capsule space and the p-synephrine group showed the presence of inflammatory infiltrate. These results suggest that the use of these substances either in isolation or in combination showed a considerable toxicological profile.

Os suplementos alimentares e compostos emagrecedores a base de extratos vegetais têm uso muito difundido e indiscriminado, principalmente pela diversidade de produtos disponíveis e facilidade de acesso aos mesmos, aliada à falsa crença popular de que “o que é natural não faz mal”. Produtos contendo a associação de psinefrina, efedrina, salicina e cafeína são amplamente consumidos pela população. Entretanto, a efetividade e, sobretudo, a segurança da associação dessas substâncias ainda não é conhecida, visto que estudos sobre o sinergismo farmacológico e toxicológico dessa associação ainda são praticamente inexistentes. Logo, o objetivo deste trabalho foi elucidar o perfil toxicológico agudo e subcrônico, incluindo avaliação do estresse oxidativo e de alterações fisiológicas, bem como o desenvolvimento de metodologias que permitam analisar e quantificar o teor dessas substâncias nos produtos comerciais. Para avaliação da toxicidade aguda, doses de 300, 350 e 400 mg/kg da associação de p-sinefrina, efedrina, salicina e cafeína (10:4:6:80) foram testadas via oral em camundongos machos e fêmeas. Foi possível observar redução da atividade locomotora, ptose (em todas as doses em ambos os sexos), convulsões (350 mg/kg em fêmeas e 400 mg/kg em machos e fêmeas), além de salivação, agitação, piloereção em fêmeas, bem como mortes em machos (350 e 400 mg/kg) oriunda de hemorragia cardiopulmonar. Redução na atividade locomotora foi confirmada através do teste de atividade locomotora espontânea em machos que mostrou diminuição significativa (p<0,01) em todos os grupos tratados, sendo o mesmo resultado observado quando do teste de temperatura corporal, havendo decréscimo da mesma em todas as doses testadas. O teste de rota-rod mostrou ocorrência de neurotoxicidade em machos tratados com 400 mg/kg. A DL50 da mistura foi estimada entre 350 e 400 mg/kg. No teste de avaliação da toxicidade subcrônica, ratos machos e fêmeas foram tratados por via oral com a mesma mistura por 28 dias consecutivos nas doses de 50, 75, 100 e 150 mg/kg. Avaliações hematológicas, bioquímicas e de marcadores de estresse oxidativo foram realizadas, observando-se ocorrência de peroxidação lipídica e de dano hepático e renal em ratos machos (100 e 150 mg/kg), além de diminuição da GSH em todos os machos tratados. Nas fêmeas não houve indicação de estresse oxidativo, mas sim, ocorrência de alterações hepáticas não conclusivas. O diferente perfil de toxicidade apresentado por machos e fêmeas sugere influência hormonal sobre os efeitos fármaco-toxicológicos da mistura. Os resultados obtidos mostraram que a associação de p-sinefrina, efedrina, salicina e cafeína, nas doses testadas, apresenta considerável perfil de toxicidade, tanto agudo quanto subcrônico, indicando a necessidade de testes toxicológicos mais detalhados para total elucidação dos efeitos, incluindo avaliações relacionadas à influência da presença de estrogênio, avaliações que permitam períodos mais longos de exposição e avaliação de outros marcadores de estresse oxidativo, visto o grande número de acidentes toxicológicos relatados após utilização de suplementos alimentares e compostos emagrecedores cujas formulações frequentemente contém essa associação de substâncias. Com base no desenvolvimento da metodologia de análise, a extração em fase sólida com cartuchos de troca iônica SCX, seguida de extracção líquido-líquido com clorofórmio, subsequente reação de derivatização com anidrido trifluoroacético e posterior análise em CG/DIC (e GC/EM para confirmação) pode ser considerada uma alternativa promissora para analisar simultaneamente sinefrina, efedrina e cafeína em suplementos alimentares e compostos emagrecedores. O método por CG/DIC foi validado pela definição da faixa de linearidade para as substâncias (50, 100, 200, 500, 1000 e 2000 ug/mL para octopamina efedrina e p-sinefrina e 250, 500, 1000, 2500, 5000 e 10000 ug/mL para cafeína), limite de detecção, limite de quantificação, precisão, exatidão, seletividade, especificidade e robustez. O método de análise desenvolvida pode ser utilizado no controle de qualidade de produtos, para identificar e quantificar estas substâncias em uma ampla variedade de matrizes. / Dietary supplements and weight loss compounds plant-based are indiscriminate and widespread use, mainly for the diversity of products available and easy acess to them, coupled with the false popular belief that “what is natural does not hurt”. Products containing p-synephrine associated to ephedrine, salicin and caffeine are largely consumed. However, the effectiveness and safety of this mixture is still unknown, since studies about pharmacological and toxicological synergism are still nonexistent. Therefore, the aim of this study was evaluate the acute and subchronic toxicological profile, including assessment of oxidative stress physiological alterations, as well as the development of methodologies to analyze and quantify these substances in commercial products. To acute toxicological evaluation, 300, 350 and 400 mg/kg doses of association of p-synephrine, ephedrine, salicin and caffeine (10:4:6:80 w/w) were tested by oral gavage in male and female mice and was possible to observed a reduction in locomotor activity and ptose (in all treated groups for both male and female mice), seizures (350 mg/kg in female and 400 mg/kg in male and female), besides salivation, agitation and piloerection in female. Deaths occurred in male (350 and 400 mg/kg) and necropsy showed cardiopulmonary hemorrhage. The decrease in locomotor activity was confirmed throught the spontaneous locomotor activity, in which the number of crossings significantly decreased (p<0.01) in all treated groups, being the similar result obtained in body temperature evaluation, reducing in the all same doses. The rotarod test showed neurotoxicity in male treated with 400 mg/kg. The LD50 of the mixture was estimated between 350 and 400 mg/kg. In subchronic toxicity evaluation, male and female rats were treated by oral gavage with the mixture for 28 consecutive days at doses of 50, 75, 100 and 150 mg/kg. Hematological, biochemical and oxidative stress biomarkers were performed and showed lipid peroxidation, and hepatic and renal damages in male rats (100 and 150 mg/kg) and reduction in GSH levels and all treated male groups. In females, there were no indications of oxidative stress, but were observed not conclusive hepatic enzyme changes. The different toxicity profile displayed by male and female rats suggests hormonal influence in mixture effects. All the results obtained showed that the association of p-synephrine, ephedrine, salicin and caffeine in tested doses has considerable toxicity both acute and subchronic profiles, indicating the need of more detailed investigations for elucidate all the effects, including assessments related to protector role of estrogen, and more longterm studies of exposure, besides evaluations of more oxidative biomarkers, since the large number of toxicological report cases related to these products whose formulations usually contain these substances´s combination. On the basis of analytical methodology development, the SPE with SCX stationary phases followed by liquid-liquid extraction with chloroform and subsequent derivatization with anhydride trifluoroacetic and GC/FID (and GC/MS confirmation) analysis can be considered a promising alternative to analyze simultaneously synephrine, ephedrine and caffeine in supplements and weight loss products. The GC/FID method was validated by defining the linearity (50, 100, 200, 500, 1000 and 2000 μg/mL to ephedrine, octopamine and p-synephrine and 250, 500, 1000, 2500, 5000 and 10000 μg/mL to caffeine), limit of detection, limit of quantification, precision, accuracy, selectivity, specificity and robustness. The analysis method developed can be used in quality control to identify and quantificate these substances in a wide range of matrices.

A busca por um padrão estético globalizado e o aumento da obesidade fazem crescer o uso de suplementos alimentares e compostos emagrecedores à base de extratos vegetais. Produtos contendo a associação de p-sinefrina, efedrina, salicina e cafeína são amplamente consumidos e não apresentam efetividade e segurança bem esclarecidas. Portanto, o objetivo deste trabalho foi avaliar a toxicidade subcrônica de p-sinefrina, efedrina, cafeína e salicina, isoladas e em associação, em ratos Wistar machos. Doses de salicina 6 mg/kg, efedrina 4 mg/kg, p-sinefrina 10 mg/kg, cafeína 80 mg/kg e a associação de salicina, efedrina, p-sinefrina e cafeína 100 mg/kg (6:4:10:80, respectivamente) foram testadas via oral por 28 dias consecutivos. A massa corporal foi verificada semanalmente e o teste da atividade locomotora foi realizado no 28º dia. O sangue foi coletado para análise bioquímica e órgãos vitais como fígado e rins foram utilizados para avaliação histológica. Os resultados mostraram uma redução significativa (p<0,05) na massa corporal nos dias 21 e 28 do grupo tratado com cafeína comparado ao grupo controle. Nos dias 14, 21 e 28 ocorreu um aumento significativo (p<0,05) da massa corporal no grupo tratado com p-sinefrina comparado com os grupos efedrina, salicina, cafeína e associação. No teste da atividade locomotora houve um aumento significativo (p<0,05) no grupo tratado com a associação comparado ao grupo controle. Não foram encontradas alterações nos marcadores bioquímicos de fígado, rim e coração, bem como nas avaliações macroscópicas dos órgãos vitais. Entretanto, na análise histológica do fígado, verificou-se em todos os grupos a presença de vacuolização e tumefação celular, congestão vascular e alargamento dos sinusóides, e apenas os grupos p-sinefrina, efedrina e salicina apresentaram degeneração hidrópica. Na histologia dos rins todos os grupos demonstraram vacuolização celular e aumento do espaço da cápsula de Bowman e o grupo p-sinefrina mostrou a presença de infiltrado inflamatório. Esses resultados sugerem que o uso dessas substâncias, tanto na forma isolada como em associação, apresenta um perfil toxicológico considerável. / The search for a globalized aesthetic standard and the increasing obesity are enhancing the use of food supplements and weight loss compounds from plant base extracts. Products containing the combination of p-synephrine, ephedrine, caffeine and salicin are widely consumed and the effectiveness and safety are not well understood. Therefore, the aim of this study was to evaluate the subchronic toxicity of p-synephrine, ephedrine, caffeine and salicin, isolated and in combination, in male Wistar rats. Doses of salicin 6 mg/kg, ephedrine 4 mg/kg, p-synephrine 10 mg/kg, caffeine 80 mg/kg and the association of salicin, ephedrine, p-synephrine and caffeine (100 mg/kg; 6:4:10:80, respectively) were administered orally for 28 consecutive days. Body weight was recorded weekly and a locomotor activity test was performed on the 28th day. Blood was collected for biochemical analysis and vital organs such as liver and kidneys were used for histologic evaluation. The results showed a significant reduction (p <0.05) in body mass on days 21 and 28 in the caffeine-treated group compared to control group. Besides that, on days 14, 21 and 28 a significant increase (p <0.05) in body weight was observed in the group treated with p-synephrine compared to the ephedrine, salicin, caffeine and association-treated groups. In the test of locomotor activity, a significant increase (p <0.05) was observed in the association-treated group treated compared to the control group. No changes were found in biochemical markers associated with liver, kidney and heart conditions or in macroscopic evaluations of vital organs. However, the histological analysis of the liver in all groups shown presence of cellular vacuolization and swelling, vascular congestion and enlargement of the sinusoids, whereas the p-synephrine, ephedrine and salicin groups exhibited hydropic degeneration. In the histology of kidneys, all groups showed cellular vacuolation and increased of the Bowman's capsule space and the p-synephrine group showed the presence of inflammatory infiltrate. These results suggest that the use of these substances either in isolation or in combination showed a considerable toxicological profile.

Os suplementos alimentares e compostos emagrecedores a base de extratos vegetais têm uso muito difundido e indiscriminado, principalmente pela diversidade de produtos disponíveis e facilidade de acesso aos mesmos, aliada à falsa crença popular de que “o que é natural não faz mal”. Produtos contendo a associação de psinefrina, efedrina, salicina e cafeína são amplamente consumidos pela população. Entretanto, a efetividade e, sobretudo, a segurança da associação dessas substâncias ainda não é conhecida, visto que estudos sobre o sinergismo farmacológico e toxicológico dessa associação ainda são praticamente inexistentes. Logo, o objetivo deste trabalho foi elucidar o perfil toxicológico agudo e subcrônico, incluindo avaliação do estresse oxidativo e de alterações fisiológicas, bem como o desenvolvimento de metodologias que permitam analisar e quantificar o teor dessas substâncias nos produtos comerciais. Para avaliação da toxicidade aguda, doses de 300, 350 e 400 mg/kg da associação de p-sinefrina, efedrina, salicina e cafeína (10:4:6:80) foram testadas via oral em camundongos machos e fêmeas. Foi possível observar redução da atividade locomotora, ptose (em todas as doses em ambos os sexos), convulsões (350 mg/kg em fêmeas e 400 mg/kg em machos e fêmeas), além de salivação, agitação, piloereção em fêmeas, bem como mortes em machos (350 e 400 mg/kg) oriunda de hemorragia cardiopulmonar. Redução na atividade locomotora foi confirmada através do teste de atividade locomotora espontânea em machos que mostrou diminuição significativa (p<0,01) em todos os grupos tratados, sendo o mesmo resultado observado quando do teste de temperatura corporal, havendo decréscimo da mesma em todas as doses testadas. O teste de rota-rod mostrou ocorrência de neurotoxicidade em machos tratados com 400 mg/kg. A DL50 da mistura foi estimada entre 350 e 400 mg/kg. No teste de avaliação da toxicidade subcrônica, ratos machos e fêmeas foram tratados por via oral com a mesma mistura por 28 dias consecutivos nas doses de 50, 75, 100 e 150 mg/kg. Avaliações hematológicas, bioquímicas e de marcadores de estresse oxidativo foram realizadas, observando-se ocorrência de peroxidação lipídica e de dano hepático e renal em ratos machos (100 e 150 mg/kg), além de diminuição da GSH em todos os machos tratados. Nas fêmeas não houve indicação de estresse oxidativo, mas sim, ocorrência de alterações hepáticas não conclusivas. O diferente perfil de toxicidade apresentado por machos e fêmeas sugere influência hormonal sobre os efeitos fármaco-toxicológicos da mistura. Os resultados obtidos mostraram que a associação de p-sinefrina, efedrina, salicina e cafeína, nas doses testadas, apresenta considerável perfil de toxicidade, tanto agudo quanto subcrônico, indicando a necessidade de testes toxicológicos mais detalhados para total elucidação dos efeitos, incluindo avaliações relacionadas à influência da presença de estrogênio, avaliações que permitam períodos mais longos de exposição e avaliação de outros marcadores de estresse oxidativo, visto o grande número de acidentes toxicológicos relatados após utilização de suplementos alimentares e compostos emagrecedores cujas formulações frequentemente contém essa associação de substâncias. Com base no desenvolvimento da metodologia de análise, a extração em fase sólida com cartuchos de troca iônica SCX, seguida de extracção líquido-líquido com clorofórmio, subsequente reação de derivatização com anidrido trifluoroacético e posterior análise em CG/DIC (e GC/EM para confirmação) pode ser considerada uma alternativa promissora para analisar simultaneamente sinefrina, efedrina e cafeína em suplementos alimentares e compostos emagrecedores. O método por CG/DIC foi validado pela definição da faixa de linearidade para as substâncias (50, 100, 200, 500, 1000 e 2000 ug/mL para octopamina efedrina e p-sinefrina e 250, 500, 1000, 2500, 5000 e 10000 ug/mL para cafeína), limite de detecção, limite de quantificação, precisão, exatidão, seletividade, especificidade e robustez. O método de análise desenvolvida pode ser utilizado no controle de qualidade de produtos, para identificar e quantificar estas substâncias em uma ampla variedade de matrizes. / Dietary supplements and weight loss compounds plant-based are indiscriminate and widespread use, mainly for the diversity of products available and easy acess to them, coupled with the false popular belief that “what is natural does not hurt”. Products containing p-synephrine associated to ephedrine, salicin and caffeine are largely consumed. However, the effectiveness and safety of this mixture is still unknown, since studies about pharmacological and toxicological synergism are still nonexistent. Therefore, the aim of this study was evaluate the acute and subchronic toxicological profile, including assessment of oxidative stress physiological alterations, as well as the development of methodologies to analyze and quantify these substances in commercial products. To acute toxicological evaluation, 300, 350 and 400 mg/kg doses of association of p-synephrine, ephedrine, salicin and caffeine (10:4:6:80 w/w) were tested by oral gavage in male and female mice and was possible to observed a reduction in locomotor activity and ptose (in all treated groups for both male and female mice), seizures (350 mg/kg in female and 400 mg/kg in male and female), besides salivation, agitation and piloerection in female. Deaths occurred in male (350 and 400 mg/kg) and necropsy showed cardiopulmonary hemorrhage. The decrease in locomotor activity was confirmed throught the spontaneous locomotor activity, in which the number of crossings significantly decreased (p<0.01) in all treated groups, being the similar result obtained in body temperature evaluation, reducing in the all same doses. The rotarod test showed neurotoxicity in male treated with 400 mg/kg. The LD50 of the mixture was estimated between 350 and 400 mg/kg. In subchronic toxicity evaluation, male and female rats were treated by oral gavage with the mixture for 28 consecutive days at doses of 50, 75, 100 and 150 mg/kg. Hematological, biochemical and oxidative stress biomarkers were performed and showed lipid peroxidation, and hepatic and renal damages in male rats (100 and 150 mg/kg) and reduction in GSH levels and all treated male groups. In females, there were no indications of oxidative stress, but were observed not conclusive hepatic enzyme changes. The different toxicity profile displayed by male and female rats suggests hormonal influence in mixture effects. All the results obtained showed that the association of p-synephrine, ephedrine, salicin and caffeine in tested doses has considerable toxicity both acute and subchronic profiles, indicating the need of more detailed investigations for elucidate all the effects, including assessments related to protector role of estrogen, and more longterm studies of exposure, besides evaluations of more oxidative biomarkers, since the large number of toxicological report cases related to these products whose formulations usually contain these substances´s combination. On the basis of analytical methodology development, the SPE with SCX stationary phases followed by liquid-liquid extraction with chloroform and subsequent derivatization with anhydride trifluoroacetic and GC/FID (and GC/MS confirmation) analysis can be considered a promising alternative to analyze simultaneously synephrine, ephedrine and caffeine in supplements and weight loss products. The GC/FID method was validated by defining the linearity (50, 100, 200, 500, 1000 and 2000 μg/mL to ephedrine, octopamine and p-synephrine and 250, 500, 1000, 2500, 5000 and 10000 μg/mL to caffeine), limit of detection, limit of quantification, precision, accuracy, selectivity, specificity and robustness. The analysis method developed can be used in quality control to identify and quantificate these substances in a wide range of matrices.

Os suplementos alimentares e compostos emagrecedores a base de extratos vegetais têm uso muito difundido e indiscriminado, principalmente pela diversidade de produtos disponíveis e facilidade de acesso aos mesmos, aliada à falsa crença popular de que “o que é natural não faz mal”. Produtos contendo a associação de psinefrina, efedrina, salicina e cafeína são amplamente consumidos pela população. Entretanto, a efetividade e, sobretudo, a segurança da associação dessas substâncias ainda não é conhecida, visto que estudos sobre o sinergismo farmacológico e toxicológico dessa associação ainda são praticamente inexistentes. Logo, o objetivo deste trabalho foi elucidar o perfil toxicológico agudo e subcrônico, incluindo avaliação do estresse oxidativo e de alterações fisiológicas, bem como o desenvolvimento de metodologias que permitam analisar e quantificar o teor dessas substâncias nos produtos comerciais. Para avaliação da toxicidade aguda, doses de 300, 350 e 400 mg/kg da associação de p-sinefrina, efedrina, salicina e cafeína (10:4:6:80) foram testadas via oral em camundongos machos e fêmeas. Foi possível observar redução da atividade locomotora, ptose (em todas as doses em ambos os sexos), convulsões (350 mg/kg em fêmeas e 400 mg/kg em machos e fêmeas), além de salivação, agitação, piloereção em fêmeas, bem como mortes em machos (350 e 400 mg/kg) oriunda de hemorragia cardiopulmonar. Redução na atividade locomotora foi confirmada através do teste de atividade locomotora espontânea em machos que mostrou diminuição significativa (p<0,01) em todos os grupos tratados, sendo o mesmo resultado observado quando do teste de temperatura corporal, havendo decréscimo da mesma em todas as doses testadas. O teste de rota-rod mostrou ocorrência de neurotoxicidade em machos tratados com 400 mg/kg. A DL50 da mistura foi estimada entre 350 e 400 mg/kg. No teste de avaliação da toxicidade subcrônica, ratos machos e fêmeas foram tratados por via oral com a mesma mistura por 28 dias consecutivos nas doses de 50, 75, 100 e 150 mg/kg. Avaliações hematológicas, bioquímicas e de marcadores de estresse oxidativo foram realizadas, observando-se ocorrência de peroxidação lipídica e de dano hepático e renal em ratos machos (100 e 150 mg/kg), além de diminuição da GSH em todos os machos tratados. Nas fêmeas não houve indicação de estresse oxidativo, mas sim, ocorrência de alterações hepáticas não conclusivas. O diferente perfil de toxicidade apresentado por machos e fêmeas sugere influência hormonal sobre os efeitos fármaco-toxicológicos da mistura. Os resultados obtidos mostraram que a associação de p-sinefrina, efedrina, salicina e cafeína, nas doses testadas, apresenta considerável perfil de toxicidade, tanto agudo quanto subcrônico, indicando a necessidade de testes toxicológicos mais detalhados para total elucidação dos efeitos, incluindo avaliações relacionadas à influência da presença de estrogênio, avaliações que permitam períodos mais longos de exposição e avaliação de outros marcadores de estresse oxidativo, visto o grande número de acidentes toxicológicos relatados após utilização de suplementos alimentares e compostos emagrecedores cujas formulações frequentemente contém essa associação de substâncias. Com base no desenvolvimento da metodologia de análise, a extração em fase sólida com cartuchos de troca iônica SCX, seguida de extracção líquido-líquido com clorofórmio, subsequente reação de derivatização com anidrido trifluoroacético e posterior análise em CG/DIC (e GC/EM para confirmação) pode ser considerada uma alternativa promissora para analisar simultaneamente sinefrina, efedrina e cafeína em suplementos alimentares e compostos emagrecedores. O método por CG/DIC foi validado pela definição da faixa de linearidade para as substâncias (50, 100, 200, 500, 1000 e 2000 ug/mL para octopamina efedrina e p-sinefrina e 250, 500, 1000, 2500, 5000 e 10000 ug/mL para cafeína), limite de detecção, limite de quantificação, precisão, exatidão, seletividade, especificidade e robustez. O método de análise desenvolvida pode ser utilizado no controle de qualidade de produtos, para identificar e quantificar estas substâncias em uma ampla variedade de matrizes. / Dietary supplements and weight loss compounds plant-based are indiscriminate and widespread use, mainly for the diversity of products available and easy acess to them, coupled with the false popular belief that “what is natural does not hurt”. Products containing p-synephrine associated to ephedrine, salicin and caffeine are largely consumed. However, the effectiveness and safety of this mixture is still unknown, since studies about pharmacological and toxicological synergism are still nonexistent. Therefore, the aim of this study was evaluate the acute and subchronic toxicological profile, including assessment of oxidative stress physiological alterations, as well as the development of methodologies to analyze and quantify these substances in commercial products. To acute toxicological evaluation, 300, 350 and 400 mg/kg doses of association of p-synephrine, ephedrine, salicin and caffeine (10:4:6:80 w/w) were tested by oral gavage in male and female mice and was possible to observed a reduction in locomotor activity and ptose (in all treated groups for both male and female mice), seizures (350 mg/kg in female and 400 mg/kg in male and female), besides salivation, agitation and piloerection in female. Deaths occurred in male (350 and 400 mg/kg) and necropsy showed cardiopulmonary hemorrhage. The decrease in locomotor activity was confirmed throught the spontaneous locomotor activity, in which the number of crossings significantly decreased (p<0.01) in all treated groups, being the similar result obtained in body temperature evaluation, reducing in the all same doses. The rotarod test showed neurotoxicity in male treated with 400 mg/kg. The LD50 of the mixture was estimated between 350 and 400 mg/kg. In subchronic toxicity evaluation, male and female rats were treated by oral gavage with the mixture for 28 consecutive days at doses of 50, 75, 100 and 150 mg/kg. Hematological, biochemical and oxidative stress biomarkers were performed and showed lipid peroxidation, and hepatic and renal damages in male rats (100 and 150 mg/kg) and reduction in GSH levels and all treated male groups. In females, there were no indications of oxidative stress, but were observed not conclusive hepatic enzyme changes. The different toxicity profile displayed by male and female rats suggests hormonal influence in mixture effects. All the results obtained showed that the association of p-synephrine, ephedrine, salicin and caffeine in tested doses has considerable toxicity both acute and subchronic profiles, indicating the need of more detailed investigations for elucidate all the effects, including assessments related to protector role of estrogen, and more longterm studies of exposure, besides evaluations of more oxidative biomarkers, since the large number of toxicological report cases related to these products whose formulations usually contain these substances´s combination. On the basis of analytical methodology development, the SPE with SCX stationary phases followed by liquid-liquid extraction with chloroform and subsequent derivatization with anhydride trifluoroacetic and GC/FID (and GC/MS confirmation) analysis can be considered a promising alternative to analyze simultaneously synephrine, ephedrine and caffeine in supplements and weight loss products. The GC/FID method was validated by defining the linearity (50, 100, 200, 500, 1000 and 2000 μg/mL to ephedrine, octopamine and p-synephrine and 250, 500, 1000, 2500, 5000 and 10000 μg/mL to caffeine), limit of detection, limit of quantification, precision, accuracy, selectivity, specificity and robustness. The analysis method developed can be used in quality control to identify and quantificate these substances in a wide range of matrices.