Les MAP kinases sont des enzymes essentielles impliquées dans 7 voies de signalisation distinctes qui permettent à la cellule de répondre de manière adéquate aux stimuli extra-cellulaires. Chez les mammifères, les MAP kinases les mieux caractérisées sont Erk1/2, Jnk, p38 et Erk5. Ces enzymes jouent un rôle important dans l’embryogenèse, la prolifération et la différenciation cellulaire ainsi que dans la réponse au stress. Erk4 est un membre atypique de la famille MAP kinase. D’une part, la boucle d’activation de Erk4 possède un motif SEG au lieu du motif TXY, très conservé chez les MAP kinases. D’autre part, Erk4 possède une extension en C-terminal du domaine kinase qui n’est pas présente chez les MAP kinases classiques. Jusqu’à présent aucune fonction n’a été attribuée à Erk4. De plus, la voie de signalisation ainsi que le mode de régulation conduisant à l’activation de Erk4 ne sont pas connus. Le seul substrat de Erk4 identifié jusqu’à maintenant est la MAPKAP kinase MK5. L’impact fonctionnel de cette interaction n’est également pas connu. Afin d’en apprendre davantage sur la MAP kinase atypique Erk4, nous avons étudié le mécanisme d’activation de cette kinase ainsi que sa fonction physiologique par une approche de délétion génique chez la souris. En ce qui concerne l’activation de Erk4, nous avons montré que la boucle d’activation de Erk4 (S186EG) est constitutivement phosphorylée in vivo et que cette phosphorylation n’est pas modulée par les stimuli classiques des MAP kinases dont le sérum et le sorbitol. Cependant, nous avons observé que la phosphorylation de la S186 augmente en présence de MK5 et que cette augmentation est indépendante de l’activité kinase de l’une ou l’autre de ces kinases. De plus, nous avons établi que la phosphorylation de la boucle d’activation de Erk4 est requise pour l’interaction stable entre Erk4 et MK5 ainsi que pour l’activation, et la relocalisation cytoplasmique de MK5. Ainsi, notre étude a permis de révéler que Erk4 est régulée de manière différente des MAP kinases classiques et que la phosphorylation de la boucle d’activation de Erk4 joue un rôle essentiel dans la régulation de l’activité de MK5. Parallèlement, nos résultats mettent en évidence l’existence d’une “Erk4 kinase”, dont le recrutement et/ou l’activation semble être facilité par MK5. Afin identifier la fonction physiologique de Erk4, nous avons généré des souris Erk4-déficientes. L’inactivation génique de Erk4 est viable et les souris ne présentent aucune anomalie apparente. Dans le but d’expliquer l’absence de phénotype, nous avons regardé si l’expression de Erk3, le paralogue de Erk4, pouvait compenser la perte de Erk4. Notre analyse a révélé que l’expression de Erk3 dans les souris Erk4-/- n’augmente pas au cours du développement embryonnaire ou dans les tissus adultes afin de compenser pour la perte de Erk4. Par la suite, nous avons adressé la question de redondance entre Erk4 et Erk3. Dans notre laboratoire, les souris Erk3-déficientes ont également été générées et le phénotype de ces souris a récemment été analysé. Cette étude a révélé que l’inactivation génique de Erk3 entraîne un retard de croissance intra-utérin, un défaut de maturation pulmonaire et la mort néo-natale des souriceaux. Nous avons donc regardé la contribution de Erk4 dans ces phénotypes. L’analyse des souris Erk4-/- a révélé que l’inactivation de Erk4 n’entraîne pas de retard de croissance ou de maturation du poumon. De plus, nous avons montré que l’inactivation additionnelle de Erk4 dans les souris Erk3-/- n’accentue pas le phénotype des souris Erk3-déficientes. Ainsi, notre étude a révélé que contrairement à Erk3, Erk4 n’est pas essentielle au développement murin dans des conditions physiologiques. Parallèlement, nous avons montré que Erk4 et Erk3 possèdent des fonctions non-redondantes in vivo. / MAP kinases are essential enzymes implicated in 7 distinct signaling pathways that allow cells to respond appropriately to extracellular stimuli. In mammals, Erk1/2, Jnk, p38 and Erk5 are the best characterized MAP kinases. These enzymes play important roles in embryogenesis, cell proliferation and differentiation and in response to cellular stresses. Erk4 is an atypical member of the MAP kinase family. First, its activation loop is composed of an SEG motif instead of the well conserved TXY motif found in MAP kinases. Second, Erk4 has a C-terminal extension following the kinase domain that is not present in classical MAP kinases. Despite its identification more than a decade ago, the function of Erk4 remains elusive. Moreover, the signaling pathway as well as the regulatory mechanism leading to Erk4 activation in still uncharacterized. The only identified substrate of Erk4 is the MAPKAP kinase MK5, but the functional relevance of this interaction is still unknown. To gain information about the atypical MAP kinase Erk4, we decided to study the activation mechanism of Erk4 and its physiological function using a gene targeted deletion approach in mice. Regarding the activation of Erk4, we showed that the activation loop of Erk4 (S186EG) is constitutively phosphosphorylated in vivo and that this phosphorylation is not modulated by classical MAP kinase stimuli such as serum and sorbitol. However, we observed that phosphorylation of S186 increases in the presence of MK5 and we showed that this increase is independent of the kinase activity of either kinases. Moreover, we established that phosphorylation of Erk4 activation loop is required for the stable interaction between Erk4 and MK5 as well as for the activation and cytoplasmic relocalisation of MK5. Thus, our study reveals that Erk4 is differently regulated than classical MAP kinases and that Erk4 activation loop phosphorylation is important for its role in the regulation of MK5 activity. In parallel, our results revealed the existence of an “Erk4 kinase” whose recruitment and/or activation seems to be facilitated by MK5. To gain information about the physiological function of Erk4 we generated Erk4 deficient mice. Gene-targeted inactivation of Erk4 is viable and these mice present no gross abnormality. To explain the absence of phenotype, we analyzed the expression of Erk3, the paralog of Erk4, to determine if it could compensate for the loss of Erk4. Our analysis revealed that Erk3 expression in Erk4-/- mice is not up-regulated during embryogenesis nor in adult mice tissues in order to compensate for the loss of Erk4. We next addressed the question of redundancy between Erk4 and Erk3. In our laboratory, Erk3-/- deficient mice were also generated and the phenotype of these mice was recently analyzed. This study revealed that gene inactivation of Erk3 leads to intra-uterine growth retardation, lung maturation defect and neo-natal lethality. We then investigated the contribution of Erk4 in these phenotypes. The analysis of Erk4-/- mice revealed that inactivation of Erk4 did not delay intra-uterine growth nor cause pulmonary maturation defect. Moreover, we showed that additional loss of Erk4 in Erk3-/-mice does not accentuate Erk3-deficient mice phenotype. Thus, this study reveals that, contrary to Erk3, Erk4 is dispensable for mice development under normal condition and that Erk4 and Erk3 have non-redundant functions in vivo.

Les MAP kinases sont des enzymes essentielles impliquées dans 7 voies de signalisation distinctes qui permettent à la cellule de répondre de manière adéquate aux stimuli extra-cellulaires. Chez les mammifères, les MAP kinases les mieux caractérisées sont Erk1/2, Jnk, p38 et Erk5. Ces enzymes jouent un rôle important dans l’embryogenèse, la prolifération et la différenciation cellulaire ainsi que dans la réponse au stress. Erk4 est un membre atypique de la famille MAP kinase. D’une part, la boucle d’activation de Erk4 possède un motif SEG au lieu du motif TXY, très conservé chez les MAP kinases. D’autre part, Erk4 possède une extension en C-terminal du domaine kinase qui n’est pas présente chez les MAP kinases classiques. Jusqu’à présent aucune fonction n’a été attribuée à Erk4. De plus, la voie de signalisation ainsi que le mode de régulation conduisant à l’activation de Erk4 ne sont pas connus. Le seul substrat de Erk4 identifié jusqu’à maintenant est la MAPKAP kinase MK5. L’impact fonctionnel de cette interaction n’est également pas connu. Afin d’en apprendre davantage sur la MAP kinase atypique Erk4, nous avons étudié le mécanisme d’activation de cette kinase ainsi que sa fonction physiologique par une approche de délétion génique chez la souris. En ce qui concerne l’activation de Erk4, nous avons montré que la boucle d’activation de Erk4 (S186EG) est constitutivement phosphorylée in vivo et que cette phosphorylation n’est pas modulée par les stimuli classiques des MAP kinases dont le sérum et le sorbitol. Cependant, nous avons observé que la phosphorylation de la S186 augmente en présence de MK5 et que cette augmentation est indépendante de l’activité kinase de l’une ou l’autre de ces kinases. De plus, nous avons établi que la phosphorylation de la boucle d’activation de Erk4 est requise pour l’interaction stable entre Erk4 et MK5 ainsi que pour l’activation, et la relocalisation cytoplasmique de MK5. Ainsi, notre étude a permis de révéler que Erk4 est régulée de manière différente des MAP kinases classiques et que la phosphorylation de la boucle d’activation de Erk4 joue un rôle essentiel dans la régulation de l’activité de MK5. Parallèlement, nos résultats mettent en évidence l’existence d’une “Erk4 kinase”, dont le recrutement et/ou l’activation semble être facilité par MK5. Afin identifier la fonction physiologique de Erk4, nous avons généré des souris Erk4-déficientes. L’inactivation génique de Erk4 est viable et les souris ne présentent aucune anomalie apparente. Dans le but d’expliquer l’absence de phénotype, nous avons regardé si l’expression de Erk3, le paralogue de Erk4, pouvait compenser la perte de Erk4. Notre analyse a révélé que l’expression de Erk3 dans les souris Erk4-/- n’augmente pas au cours du développement embryonnaire ou dans les tissus adultes afin de compenser pour la perte de Erk4. Par la suite, nous avons adressé la question de redondance entre Erk4 et Erk3. Dans notre laboratoire, les souris Erk3-déficientes ont également été générées et le phénotype de ces souris a récemment été analysé. Cette étude a révélé que l’inactivation génique de Erk3 entraîne un retard de croissance intra-utérin, un défaut de maturation pulmonaire et la mort néo-natale des souriceaux. Nous avons donc regardé la contribution de Erk4 dans ces phénotypes. L’analyse des souris Erk4-/- a révélé que l’inactivation de Erk4 n’entraîne pas de retard de croissance ou de maturation du poumon. De plus, nous avons montré que l’inactivation additionnelle de Erk4 dans les souris Erk3-/- n’accentue pas le phénotype des souris Erk3-déficientes. Ainsi, notre étude a révélé que contrairement à Erk3, Erk4 n’est pas essentielle au développement murin dans des conditions physiologiques. Parallèlement, nous avons montré que Erk4 et Erk3 possèdent des fonctions non-redondantes in vivo. / MAP kinases are essential enzymes implicated in 7 distinct signaling pathways that allow cells to respond appropriately to extracellular stimuli. In mammals, Erk1/2, Jnk, p38 and Erk5 are the best characterized MAP kinases. These enzymes play important roles in embryogenesis, cell proliferation and differentiation and in response to cellular stresses. Erk4 is an atypical member of the MAP kinase family. First, its activation loop is composed of an SEG motif instead of the well conserved TXY motif found in MAP kinases. Second, Erk4 has a C-terminal extension following the kinase domain that is not present in classical MAP kinases. Despite its identification more than a decade ago, the function of Erk4 remains elusive. Moreover, the signaling pathway as well as the regulatory mechanism leading to Erk4 activation in still uncharacterized. The only identified substrate of Erk4 is the MAPKAP kinase MK5, but the functional relevance of this interaction is still unknown. To gain information about the atypical MAP kinase Erk4, we decided to study the activation mechanism of Erk4 and its physiological function using a gene targeted deletion approach in mice. Regarding the activation of Erk4, we showed that the activation loop of Erk4 (S186EG) is constitutively phosphosphorylated in vivo and that this phosphorylation is not modulated by classical MAP kinase stimuli such as serum and sorbitol. However, we observed that phosphorylation of S186 increases in the presence of MK5 and we showed that this increase is independent of the kinase activity of either kinases. Moreover, we established that phosphorylation of Erk4 activation loop is required for the stable interaction between Erk4 and MK5 as well as for the activation and cytoplasmic relocalisation of MK5. Thus, our study reveals that Erk4 is differently regulated than classical MAP kinases and that Erk4 activation loop phosphorylation is important for its role in the regulation of MK5 activity. In parallel, our results revealed the existence of an “Erk4 kinase” whose recruitment and/or activation seems to be facilitated by MK5. To gain information about the physiological function of Erk4 we generated Erk4 deficient mice. Gene-targeted inactivation of Erk4 is viable and these mice present no gross abnormality. To explain the absence of phenotype, we analyzed the expression of Erk3, the paralog of Erk4, to determine if it could compensate for the loss of Erk4. Our analysis revealed that Erk3 expression in Erk4-/- mice is not up-regulated during embryogenesis nor in adult mice tissues in order to compensate for the loss of Erk4. We next addressed the question of redundancy between Erk4 and Erk3. In our laboratory, Erk3-/- deficient mice were also generated and the phenotype of these mice was recently analyzed. This study revealed that gene inactivation of Erk3 leads to intra-uterine growth retardation, lung maturation defect and neo-natal lethality. We then investigated the contribution of Erk4 in these phenotypes. The analysis of Erk4-/- mice revealed that inactivation of Erk4 did not delay intra-uterine growth nor cause pulmonary maturation defect. Moreover, we showed that additional loss of Erk4 in Erk3-/-mice does not accentuate Erk3-deficient mice phenotype. Thus, this study reveals that, contrary to Erk3, Erk4 is dispensable for mice development under normal condition and that Erk4 and Erk3 have non-redundant functions in vivo.

Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Il y a 4 isoforme de p38 : α, β, δ, and γ. MK5, à l'origine identifié comme étant un régulateur de PRAK (Regulated/Activated Protein Kinase), est maintenant connu pour être activée par la protéine kinase p38 (qui est un mitogène activé par la protéine kinase, MAPK). Cette dernière est impliquée dans les mécanismes de fibrose et d'apoptose pendant l'hypertrophie cardiaque. De plus, MK5 est également activée par les MAPKs atypiques; ERK3 et ERK4. Bien qu’elles soient fortement exprimées dans le coeur, le rôle physiologique de MK5 et ERK3 demeure inconnu. Par conséquent, nous avons étudié l'effet de la constriction aortique transversale (TAC) – induisant un surcharge chronique de pression chez les souris hétèrozygotes knockout pour MK5 (MK5+/-) ou ERK3 (ERK3+/-) et pour leurs types sauvages (MK5+/+ et ERK3+/+). Deux sem post-TAC; le ratio de poids du coeur/poids corporel a été augmenté chez les 2 souris MK5+/- et MK5+/+. L'échocardiographie de la trans-thoracique démontre que la surcharge de pression a altéré la fonction diastolique du ventricule gauche chez MK5+/+, mais pas chez la souris MK5+/-. De plus, nous avons observé moins de dépôt de collagène, évalué par une coloration au trichrome de Masson, 2 et 3 sem post-TAC chez les souris MK5+/-. Parallèlement, le niveau de l’ARNm de collagène type1 alpha-1 a été significativement diminué dans les coeurs des souris MK5+/-, 2 et 3 sem post-TAC. De même, ERK3, mais pas ERK5 ni p38α, co-IP avec MK5 dans les 2 modèles des coeurs TAC; aigus ou chroniques. En revanche, l’ajout exogénique de GST-MK5 a abaissé ERK4 et p38α, mais pas ERK3 dans les lysâtes de coeur de souris. Par contre, GST-ERK3 et GST-p38α ne démontrent aucune co-IP avec MK5. Ces données suggèrent que dans le coeur seul ERK3, et non ERK4 ou p38α, est capable d’interagir avec, et réguler MK5. A niveau physiologique MK5 interagit entièrement avec ERK3 et par conséquent MK5 n’est pas disponible pour lier les protéines exogéniques. Les souris hétérozygotes pour ERK3 (ERK3+/-) ont également démontré une réduction ou une absence de collagène et une faible expression d’ARNm du collagène type1 alpha1, 3 sem post-TAC. Ces résultats démontrent un important rôle pro-fibrotique de la signalisation MK5-ERK3 pendant une surcharge chronique de pression.Nous avons également démontré 5 variant d'épissage de (MK5.1-5), y compris la forme originale (MK5.1). MK5.2 et MK5.5 subissent une délétion de 6 paires de base dans l’exon 12 : MK5.3 manque l'exon 12 : MK5.4 et MK5.5 manquent les exons 2-6. L'expression des ARNm des différents variant d'épissage a été vérifiée par PCR en temps réel (qPCR). Bien que l’expression est ubiquitaire, l'abondance relative de chaque variant était tissu-spécifique (coeur, rein, pancréas, muscle squelettique, poumon, foie, et cerveau). En plus, l'abondance relative des variant d’épissage varie pendant la surcharge de pression et le développement postnatal du coeur. En outre, l'immunofluorescence a indiqué que MK5.1-5.3 se localise au noyau alors que MK5.4-5.5 est situé au niveau cytoplasmic dans les cellules HEK 293 non stimulées. Suite à une stimulation avec l'anisomycin, un activateur de p38 MAPK, MK5.1-5.3 se translocalise du noyau au cytoplasme alors qu’une petite fraction de MK5.4-5.5 translocalise vers le noyau. Ces variant d'épissage peuvent diversifier la signalisation de MK5-ERK3 dans coeur, mais leur rôle exact oblige des recherches supplémentaires. Excepté l’isoforme δ, toutes les isoformes de p38 sont exprimées dans le coeur et la forme α est considérée comme étant l'isoforme dominante. L’analyse par qPCR et immunobuvardage de type western ont démontré que p38α et p38γ sont les deux isoformes prédominantes alors que p38β et p38δ sont exprimées aux mêmes niveaux dans le coeur de rat adulte. L'immunofluorescence a démontré que p38α et p38γ se trouvent dans le cytoplasme et le noyau. Cependant, suite à la surcharge par TAC, p38γ s'est accumulé dans noyau tandis que la distribution de p38α est demeurée inchangée. Ainsi, l'abondance de p38γ et sa translocalisation nucléaire suite à la surcharge de pression indique un rôle potentiel dans l'expression génique pendant le remodelage cardiaque. En conclusion, nous avons mis en évidence pour la première fois un rôle pro-fibrotique pour la signalisation MK5-ERK3 pendant une surcharge chronique de pression. D'ailleurs, les niveaux comparables d'expression de p38γ avec p38α, et la localisation différentielle de p38γ pendant la surcharge aiguë ou chronique de pression suggèrent différents rôles possibles pour ces isoformes pendant le remodelage hypertrophique cardiaque. / There are 4 isoforms of p38 MAP kinase: α, β, γ, and δ. p38 signaling has been implicated in fibrosis and apoptosis during cardiac hypertrophy. MK5, originally identified as a p38 Regulated/Activated Protein Kinase (PRAK), is known to be downstream of p38 mitogen activated protein kinase (MAPK). Although highly expressed in the heart, the physiological roles of MK5 remain unknown. To determine if MK5 plays a role in mediating detrimental effects downstream of p38, we studied the effect of transverse aortic constriction (TAC)-induced chronic pressure overload in mice heterozygous for a knockout of MK5 (MK5+/-). Moreover, as MK5 is also activated by the atypical MAPKs, ERK3 and ERK4, the effects of TAC were also studied in ERK3+/- mice. Wild-type (MK5+/+; ERK3+/+) littermates were used as controls. Two wks post-TAC, heart weight/body weight ratios were significantly and similarly increased in both MK5+/- and MK5+/+ hearts. Trans-thoracic echocardiography revealed that pressure overload impaired left ventricular diastolic function in MK5+/+, but not in MK5+/- hearts. In addition, less collagen deposition, assessed by Masson trichrome staining, was observed in MK5+/- hearts 2 and 3 wks post-TAC. Furthermore, TAC-induced increases in collagen alpha1 type1 mRNA levels were significantly lower in MK5+/- hearts at both 2 and 3 wks post-TAC. Immunoprecipitation of MK5 resulted in co-immunoprecipitation of ERK3 but not ERK4 or p38α in either acute or chronic sham-operated and TAC hearts. In contrast, exogenous GST-MK5 pulled down endogenous ERK4 and p38α, but not ERK3, from mouse heart lysates. Neither exogenous GST-ERK3 nor GST-p38α pulled down MK5. These results suggest that MK5 associates with, and is regulated by ERK3, but not ERK4 or p38α in heart. At physiological expressional levels, all MK5 was bound to ERK3 and hence not available to bind exogenous protein. Along similar lines, mice heterozygous for an ERK3 knockout (ERK3+/-) also showed reduced or absent collagen deposition and lower collagen alpha1 type1 mRNA levels 3 wks post-TAC. This data suggests an important pro-fibrotic role of MK5-ERK3 signaling during chronic pressure overload.We also demonstrated the existence of 5 splice variants of (MK5.1-5), including the originally published form (MK5.1). MK5.2 and MK5.5 had a 6 base pair deletion in exon 12: MK5.3 lacked exon 12: and MK5.4 and MK5.5 lacked exons 2-6. Subsequently, expression of the splice variants at the mRNA level was quantified by real time qPCR. Although ubiquitously expressed, the relative abundance of each variant was tissue-specific (heart, kidney, pancreas, skeletal muscle, lung, liver, and brain). Additionally, the relative abundance of MK5 splice variants changed in the heart during pressure overload and post-natal development. Furthermore, immunofluorescence revealed MK5.1-5.3 localized to the nucleus and MK5.4-5.5 to the cytoplasm in unstimulated HEK 293 cells. Upon stimulation with anisomycin, which activates p38 MAPK, MK5.1-5.3 translocated from the nucleus to the cytoplasm and small amounts of MK5.4-5.5 relocated to the nucleus. These splice variants may further diversify MK5-ERK3 signaling in the heart, but their exact role awaits further investigation. With the exception of p38δ, all p38 isoforms are expressed in the heart and α is considered to be the prominent isoform in this tissue. qPCR and western blot analysis revealed p38α and p38γ to be the predominant isoforms and p38β and p38δ are expressed at comparable levels in the adult heart. Confocal immunofluorescence studies revealed p38α and p38γ in both the cytoplasm and nucleus. However, in response to TAC, p38γ accumulated in the nucleus whereas the distribution of p38α remained unaffected. The high abundance of p38γ and its nuclear accumulation during chronic pressure overload suggest that this isoform may play a role in gene expression during pathological cardiac remodeling. In conclusion, we have shown for the first time a pro-fibrotic role for MK5-ERK3 signaling during chronic pressure overload. Moreover, comparable expression levels of p38γ with p38α, and differential localization of p38γ during acute or chronic pressure overload, suggest these isoforms play different roles during cardiac remodeling.

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Il y a 4 isoforme de p38 : α, β, δ, and γ. MK5, à l'origine identifié comme étant un régulateur de PRAK (Regulated/Activated Protein Kinase), est maintenant connu pour être activée par la protéine kinase p38 (qui est un mitogène activé par la protéine kinase, MAPK). Cette dernière est impliquée dans les mécanismes de fibrose et d'apoptose pendant l'hypertrophie cardiaque. De plus, MK5 est également activée par les MAPKs atypiques; ERK3 et ERK4. Bien qu’elles soient fortement exprimées dans le coeur, le rôle physiologique de MK5 et ERK3 demeure inconnu. Par conséquent, nous avons étudié l'effet de la constriction aortique transversale (TAC) – induisant un surcharge chronique de pression chez les souris hétèrozygotes knockout pour MK5 (MK5+/-) ou ERK3 (ERK3+/-) et pour leurs types sauvages (MK5+/+ et ERK3+/+). Deux sem post-TAC; le ratio de poids du coeur/poids corporel a été augmenté chez les 2 souris MK5+/- et MK5+/+. L'échocardiographie de la trans-thoracique démontre que la surcharge de pression a altéré la fonction diastolique du ventricule gauche chez MK5+/+, mais pas chez la souris MK5+/-. De plus, nous avons observé moins de dépôt de collagène, évalué par une coloration au trichrome de Masson, 2 et 3 sem post-TAC chez les souris MK5+/-. Parallèlement, le niveau de l’ARNm de collagène type1 alpha-1 a été significativement diminué dans les coeurs des souris MK5+/-, 2 et 3 sem post-TAC. De même, ERK3, mais pas ERK5 ni p38α, co-IP avec MK5 dans les 2 modèles des coeurs TAC; aigus ou chroniques. En revanche, l’ajout exogénique de GST-MK5 a abaissé ERK4 et p38α, mais pas ERK3 dans les lysâtes de coeur de souris. Par contre, GST-ERK3 et GST-p38α ne démontrent aucune co-IP avec MK5. Ces données suggèrent que dans le coeur seul ERK3, et non ERK4 ou p38α, est capable d’interagir avec, et réguler MK5. A niveau physiologique MK5 interagit entièrement avec ERK3 et par conséquent MK5 n’est pas disponible pour lier les protéines exogéniques. Les souris hétérozygotes pour ERK3 (ERK3+/-) ont également démontré une réduction ou une absence de collagène et une faible expression d’ARNm du collagène type1 alpha1, 3 sem post-TAC. Ces résultats démontrent un important rôle pro-fibrotique de la signalisation MK5-ERK3 pendant une surcharge chronique de pression.Nous avons également démontré 5 variant d'épissage de (MK5.1-5), y compris la forme originale (MK5.1). MK5.2 et MK5.5 subissent une délétion de 6 paires de base dans l’exon 12 : MK5.3 manque l'exon 12 : MK5.4 et MK5.5 manquent les exons 2-6. L'expression des ARNm des différents variant d'épissage a été vérifiée par PCR en temps réel (qPCR). Bien que l’expression est ubiquitaire, l'abondance relative de chaque variant était tissu-spécifique (coeur, rein, pancréas, muscle squelettique, poumon, foie, et cerveau). En plus, l'abondance relative des variant d’épissage varie pendant la surcharge de pression et le développement postnatal du coeur. En outre, l'immunofluorescence a indiqué que MK5.1-5.3 se localise au noyau alors que MK5.4-5.5 est situé au niveau cytoplasmic dans les cellules HEK 293 non stimulées. Suite à une stimulation avec l'anisomycin, un activateur de p38 MAPK, MK5.1-5.3 se translocalise du noyau au cytoplasme alors qu’une petite fraction de MK5.4-5.5 translocalise vers le noyau. Ces variant d'épissage peuvent diversifier la signalisation de MK5-ERK3 dans coeur, mais leur rôle exact oblige des recherches supplémentaires. Excepté l’isoforme δ, toutes les isoformes de p38 sont exprimées dans le coeur et la forme α est considérée comme étant l'isoforme dominante. L’analyse par qPCR et immunobuvardage de type western ont démontré que p38α et p38γ sont les deux isoformes prédominantes alors que p38β et p38δ sont exprimées aux mêmes niveaux dans le coeur de rat adulte. L'immunofluorescence a démontré que p38α et p38γ se trouvent dans le cytoplasme et le noyau. Cependant, suite à la surcharge par TAC, p38γ s'est accumulé dans noyau tandis que la distribution de p38α est demeurée inchangée. Ainsi, l'abondance de p38γ et sa translocalisation nucléaire suite à la surcharge de pression indique un rôle potentiel dans l'expression génique pendant le remodelage cardiaque. En conclusion, nous avons mis en évidence pour la première fois un rôle pro-fibrotique pour la signalisation MK5-ERK3 pendant une surcharge chronique de pression. D'ailleurs, les niveaux comparables d'expression de p38γ avec p38α, et la localisation différentielle de p38γ pendant la surcharge aiguë ou chronique de pression suggèrent différents rôles possibles pour ces isoformes pendant le remodelage hypertrophique cardiaque. / There are 4 isoforms of p38 MAP kinase: α, β, γ, and δ. p38 signaling has been implicated in fibrosis and apoptosis during cardiac hypertrophy. MK5, originally identified as a p38 Regulated/Activated Protein Kinase (PRAK), is known to be downstream of p38 mitogen activated protein kinase (MAPK). Although highly expressed in the heart, the physiological roles of MK5 remain unknown. To determine if MK5 plays a role in mediating detrimental effects downstream of p38, we studied the effect of transverse aortic constriction (TAC)-induced chronic pressure overload in mice heterozygous for a knockout of MK5 (MK5+/-). Moreover, as MK5 is also activated by the atypical MAPKs, ERK3 and ERK4, the effects of TAC were also studied in ERK3+/- mice. Wild-type (MK5+/+; ERK3+/+) littermates were used as controls. Two wks post-TAC, heart weight/body weight ratios were significantly and similarly increased in both MK5+/- and MK5+/+ hearts. Trans-thoracic echocardiography revealed that pressure overload impaired left ventricular diastolic function in MK5+/+, but not in MK5+/- hearts. In addition, less collagen deposition, assessed by Masson trichrome staining, was observed in MK5+/- hearts 2 and 3 wks post-TAC. Furthermore, TAC-induced increases in collagen alpha1 type1 mRNA levels were significantly lower in MK5+/- hearts at both 2 and 3 wks post-TAC. Immunoprecipitation of MK5 resulted in co-immunoprecipitation of ERK3 but not ERK4 or p38α in either acute or chronic sham-operated and TAC hearts. In contrast, exogenous GST-MK5 pulled down endogenous ERK4 and p38α, but not ERK3, from mouse heart lysates. Neither exogenous GST-ERK3 nor GST-p38α pulled down MK5. These results suggest that MK5 associates with, and is regulated by ERK3, but not ERK4 or p38α in heart. At physiological expressional levels, all MK5 was bound to ERK3 and hence not available to bind exogenous protein. Along similar lines, mice heterozygous for an ERK3 knockout (ERK3+/-) also showed reduced or absent collagen deposition and lower collagen alpha1 type1 mRNA levels 3 wks post-TAC. This data suggests an important pro-fibrotic role of MK5-ERK3 signaling during chronic pressure overload.We also demonstrated the existence of 5 splice variants of (MK5.1-5), including the originally published form (MK5.1). MK5.2 and MK5.5 had a 6 base pair deletion in exon 12: MK5.3 lacked exon 12: and MK5.4 and MK5.5 lacked exons 2-6. Subsequently, expression of the splice variants at the mRNA level was quantified by real time qPCR. Although ubiquitously expressed, the relative abundance of each variant was tissue-specific (heart, kidney, pancreas, skeletal muscle, lung, liver, and brain). Additionally, the relative abundance of MK5 splice variants changed in the heart during pressure overload and post-natal development. Furthermore, immunofluorescence revealed MK5.1-5.3 localized to the nucleus and MK5.4-5.5 to the cytoplasm in unstimulated HEK 293 cells. Upon stimulation with anisomycin, which activates p38 MAPK, MK5.1-5.3 translocated from the nucleus to the cytoplasm and small amounts of MK5.4-5.5 relocated to the nucleus. These splice variants may further diversify MK5-ERK3 signaling in the heart, but their exact role awaits further investigation. With the exception of p38δ, all p38 isoforms are expressed in the heart and α is considered to be the prominent isoform in this tissue. qPCR and western blot analysis revealed p38α and p38γ to be the predominant isoforms and p38β and p38δ are expressed at comparable levels in the adult heart. Confocal immunofluorescence studies revealed p38α and p38γ in both the cytoplasm and nucleus. However, in response to TAC, p38γ accumulated in the nucleus whereas the distribution of p38α remained unaffected. The high abundance of p38γ and its nuclear accumulation during chronic pressure overload suggest that this isoform may play a role in gene expression during pathological cardiac remodeling. In conclusion, we have shown for the first time a pro-fibrotic role for MK5-ERK3 signaling during chronic pressure overload. Moreover, comparable expression levels of p38γ with p38α, and differential localization of p38γ during acute or chronic pressure overload, suggest these isoforms play different roles during cardiac remodeling.