Los sistemas de defensa de procariotas denominados CRISPR–Cas dan lugar a la formación de un complejo nucleoproteico compuesto por proteínas Cas y un ARN guía derivado de las regiones CRISPR que se encarga de interferir en la propagación de elementos genéticos móviles a través de la degradación mediada por nucleasas Cas de secuencias foráneas que coinciden con los ARN guía. La fácil reprogramación de la guía ha propiciado el desarrollo de un arsenal de herramientas para la modificación y manipulación de ácidos nucleicos, cuyas aplicaciones superan con creces la utilización implementada inicialmente para la proteína Cas9 de Streptococcus pyogenes como editor del ADN. En un intento de paliar las limitaciones encontradas en el uso de la Cas9 de S. pyogenes, que sigue siendo la herramienta CRISPR más empleada, el repertorio de nucleasas Cas disponibles ha aumentado considerablemente en los últimos años, en particular las pertenecientes a la clase 2. La actividad de corte inespecífico fuera de la diana, el requerimiento de un motivo concreto adyacente a la diana y su gran tamaño, que limita su administración celular, han motivado la búsqueda de nuevas nucleasas en datos genómicos y metagenómicos, así como la generación de variantes derivadas de proteínas nativas mediante evolución dirigida o ingeniería de proteínas. En la presente tesis, llevamos a cabo una búsqueda de sistemas CRISPR–Cas de clase 2 a partir de 10 metagenomas provenientes de tres ambientes previamente inexplorados en este sentido, dando como resultado la identificación de 107 sistemas pertenecientes a alguno de los subtipos descritos hasta la fecha. El análisis de las características de las proteínas Cas encontradas y su relación evolutiva con otras ortólogas empleadas en edición genética nos llevó a la selección de 9 candidatas para su caracterización funcional. Entre todas ellas, la proteína EH6Cas9 mostró actividad nucleasa sobre secuencias diana de ADN en E. coli, adyacentes al motivo 5’-NGG-3’. Con el fin de desarrollar una nueva herramienta de biología molecular, la simplificación del sistema nos llevó a diseñar un ARN guía sintético compatible con EH6Cas9. La caracterización bioquímica de la herramienta demostró que EH6Cas9 es una ADNasa metal dependiente, programable mediante guías de ARN, que muestra su máxima actividad frente a dianas adyacentes a la secuencia consenso 5’-NGGDT-3’ a temperaturas entre 25 °C y 37 °C. Finalmente, EH6Cas9 también demostró su aplicabilidad como herramienta de edición genética. En E. coli, EH6Cas9 mostró una gran eficacia como estrategia para la selección positiva de mutantes, mientras que en células de ratón indujo la formación de inserciones y deleciones en una secuencia diana, presentando características distintivas respecto a la Cas9 de S. pyogenes que la hacen especialmente indicada para aplicaciones de edición genética en eucariotas en las que se requiera una actividad nucleasa moderada y más restringida.

[ES] Los péptidos DEVIL/ROTUNDIFOLIA (DVL/RTFL) constituyen una familia de péptidos de pequeño tamaño codificados por la familia génica DVL/RTFL de 24 miembros en A. thaliana. Estos genes fueron caracterizados por los fenotipos que confiere su sobreexpresión, que provoca cambios pronunciados en la morfología de la planta con hojas de roseta más redondeadas, plantas de menor estatura, peciolos cortos e inflorescencias compactas. Estos fenotipos afectan de un modo fascinante a la morfología de los frutos, que varía según qué miembro de la familia se sobreexprese, demostrando tener un papel en el desarrollo de múltiples órganos de la planta. Se ha visto que los péptidos DVL/RTFL se localizan en la membrana plasmática y que comparten homología en sus secuencias, con un dominio conservado en el extremo C-terminal, estando además ampliamente conservados en el mundo vegetal. Tanto su localización como dominio funcional conservado resultan ser esenciales para su actividad. Sin embargo y, a pesar de los fenotipos sorprendentes causados por la sobreexpresión de diferentes genes DVL/RTFL, las líneas de pérdida de función no aportan información sobre la función biológica de la familia DVL/RTFL. En el laboratorio donde se ha realizado este trabajo, se ha avanzado en los últimos años en la caracterización de estos péptidos, su modo de interacción con la membrana celular y la determinación de sus patrones de expresión, así como en la identificación de mutantes de pérdida de función. Para continuar en estas direcciones, en este proyecto se generaron combinaciones de mutantes múltiples estables en diferentes genes DVL/RTFL combinando mutantes de inserción de T-DNA con mutantes generados por CRISPR/Cas9 (dvl3dvl5dvl6dvl1dvl4rtfl9dvl8dvl11rtfl11dvl19). A pesar de que la pérdida de función de múltiples genes DVL/RTFL no mostró fenotipos morfológicos evidentes, análisis transcriptómicos y proteómicos apoyaron la hipótesis de la elevada redundancia génica entre los miembros de esta familia y de que podrían tener un papel en la regulación de procesos como el crecimiento y desarrollo del tubo polínico o el crecimiento distal de la célula. Experimentos donde analizamos la germinación de polen, el crecimiento de tubo polínico o el desarrollo de pelos radiculares no mostraron que los péptidos DVL/RTFL afectaran de un modo significativo estos procesos , pero sí sugirieron que tienen un rol generalizado aportando estabilidad o robustez al proceso de morfogénesis vía elongación celular. Adicionalmente se llevaron a cabo estudios de topología de membrana que permitieron confirmar su localización en la membrana plasmática, de tal manera que estos péptidos no se integraban en la membrana, sino que estarían asociados a su interfase. La posibilidad de que la asociación se llevase a cabo a través de otras proteínas hizo que se comprobasen in planta interacciones de los péptidos DVL1 y DVL11 con proteínas candidatas identificadas en un escrutinio de doble híbrido de levadura y relacionadas con procesos de tráfico intra e intercelular, división y elongación celular. Su interacción confirmada con proteínas como SRC2, BSK6 o CDC48 llevó a estudiar la posible relación funcional con éstas y en especial con CDC48 por su implicación en procesos de división, expansión y diferenciación celular, sin obtener resultados concluyentes. Los escasos resultados obtenidos en Arabidopsis nos condujo a estudiar el papel del único homólogo DVL/RTFL en M. polymorpha. Tras generar y caracterizar líneas de pérdida de función y sobreexpresoras MpDVL, hemos podido confirmar la conservación funcional de los péptidos DVL/RTFL en especies de plantas tan alejadas evolutivamente, así como determinar que no se trata de péptidos esenciales para el desarrollo de la planta pero que sí parecen tener un papel en los procesos de morfogénesis vía elongación celular aportando robustez al sistema. Este trabajo pone de manifiesto que la necesidad de profundizar en el estudio de los péptidos DVL/RTFL. / [CA] Els pèptids DEVIL/ROTUNDIFOLIA (DVL/DVL) constitueixen una família de pèptids de xicoteta grandària codificats per la família gènica DVL/RTFL de 24 membres en A. thaliana. Aquests gens van ser caracteritzats pels fenotips que confereix la seua sobreexpressió, que provoca canvis pronunciats en la morfologia de la planta amb fulles de roseta més arredonides, plantes de menor alçada, pecíols curts i inflorescències compactes. A més, aquests fenotips afecten d'una manera fascinant a la morfologia dels fruits, que varia segons quin membre de la família es sobreexprese, demostrant tindre un paper en el desenvolupament de múltiples òrgans de la planta. També s'ha vist que els pèptids DVL/RTFL es localitzen en la membrana plasmàtica i que comparteixen homologia en les seues seqüències, amb un domini conservat en l'extrem C-terminal, estant a més àmpliament conservats en el món vegetal. Tant la seua localització com domini funcional conservat resulten ser essencials per a la seua activitat gènica adequada. No obstant això i, malgrat els fenotips sorprenents observats en la sobreexpressió de diferents gens DVL/RTFL, les línies de pèrdua de funció no aporten informació sobre la funció biològica de la família DVL/RTFL. En el laboratori on s'ha fet aquest treball, s'ha avançat en els últims anys en la caracterització d'aquests pèptids, la seua manera d'interacció amb la membrana cel·lular i la determinació dels seus patrons d'expressió, així com en la identificació de mutants de pèrdua de funció. Per a continuar en aquestes direccions, en aquest projecte es van generar combinacions de mutants múltiples estables en diferents gens DVL/RTFL combinant mutants d'inserció de T-DNA amb mutants generats per CRISPR/Cas9 (dvl3dvl5dvl6dvl1dvl4rtfl9dvl8dvl11rtfl11dvl19). A pesar que la pèrdua de funció de múltiples gens DVL/RTFL no va mostrar fenotips morfològics evidents, anàlisis transcriptòmics i proteòmics van donar suport a la hipòtesi de l'elevada redundància gènica entre els membres d'aquesta família i que a més tenen un paper en la regulació de processos com són la morfogènesi, el creixement i desenvolupament del tub pol·línic o el creixement distal de la cèl·lula. Experiments de germinació de pol·len, creixement de tub pol·línic o desenvolupament de pèls radiculars duts a terme van demostrar que els pèptids DVL/RTFL no tenien un paper significatiu en aquests processos, però sí que van suggerir que tenen un rol generalitzat aportant estabilitat o robustesa al procés de morfogènesi via elongació cel·lular. Addicionalment es van dur a terme estudis de topologia de membrana que van permetre confirmar la seua localització en la membrana plasmàtica, de tal manera que aquests pèptids no s'integraven en la membrana si no que estarien associats a la seua interfase. La possibilitat que aquesta associació es duguera a terme a través d'altres proteïnes va fer que es comprovaren in planta interaccions dels pèptids DVL1 i DVL11 amb proteïnes candidates extretes d'un escrutini de doble híbrid de llevat i relacionades amb processos de trànsit intra i intercel·lular, divisió i elongació cel·lular. La seua interacció confirmada amb proteïnes com SRC2, BSK6 o CDC48 va portar a estudiar la possible relació funcional amb aquests i especialment amb CDC48 per la seua implicació en processos de divisió, expansió i diferenciació cel·lular, sense obtindre resultats concloents. Els escassos resultats obtinguts en Arabidopsis ens va conduir a estudiar el paper de l'únic homòleg DVL/RTFL en M. polymorpha. Després de generar i caracteritzar línies de pèrdua de funció i de sobreexpressió MpDVL, hem pogut confirmar la conservació funcional dels pèptids DVL/RTFL en espècies de plantes tan allunyades evolutivament, així com determinar que no es tracta de pèptids essencials per al desenvolupament de la planta però que sí que semblen tindre un paper en els processos de morfogènesis via elongació cel·lular aportant robustesa al sistema. / [EN] DEVIL/ROTUNDIFOLIA (DVL/DVL) peptides constitute a family of small peptides encoded by the 24-member DEVIL/ROTUNDIFOLIA (DVL/RTFL) gene family in Arabidopsis thaliana. These genes were characterized by the phenotypes conferred by their overexpression, which causes pronounced changes in plant morphology with round rosette leaves, shorter plants, short petioles, and compact inflorescences. In addition, these phenotypes dramatically affect fruit morphology, which varies depending on which family member is overexpressed, proving to play a role in the development of multiple plant organs. It has also been shown that DVL/RTFL peptides are located in the plasma membrane, that they share sequence homology, mostly in a conserved C-terminal domain, and that they are also widely conserved among land plants. Both the localization at the membrane and conserved functional domain are essential for proper gene activity. However, despite the surprising overexpression phenotypes observed, the loss-of-function mutants do not provide information on the DVL/RTFL biological function. In the lab where this work has been carried out, progress has been made in the characterization of these peptides, determining how they interact with the plasma membrane, how they are expressed and accumulated, as well as identifying loss-of-function mutants. To continue in these directions, in this project we have generated combinations of multiple stable DVL/RTFL mutants by combining T-DNA insertion mutants with mutants generated by CRISPR/Cas9 (dvl3 dvl5 dvl6 dvl1 dvl4 rtfl9 dvl8 dvl11 rtfl11 dvl19). Even though the loss of function of multiple DVL/RTFL genes did not show evident morphological phenotypes, transcriptomic and proteomic analyzes supported the hypothesis of a high gene redundancy among the members of this family and suggested that they might have a role in the regulation of processes such as pollen tube growth and development or cell tip growth. However, pollen germination, pollen tube growth or root hair development experiments did not demostrate that DVL/RTFL peptides had a significant role in these processes, but they suggested that they may have a general role in providing stability or robustness to the morphogenesis process via cell elongation. Additionally, membrane topology studies were carried out to confirm their location in the plasma membrane, in such a way that these peptides were not integrated but would be associated with the membrane interface. The possibility that this association was carried out through other proteins led to the in planta verification of DVL1 and DVL11 peptide interactions with candidate proteins identified in a previous yeast two-hybrid screening and related to intracellular and intercellular trafficking processes cell division and elongation. The confirmed interaction with proteins such as SRC2, BSK6 or CDC48 led us to study the possible functional relationship with these, and especially with CDC48 due to its involvement in cell division, expansion, and differentiation processes, but unfortunately, we did not obtain conclusive results. The unconclussive results obtained in Arabidopsis led us to study the role of the unique DVL/RTFL homologue in Marchantia polymorpha. After generating and characterizing MpDVL loss-of-function and overexpression lines, we have been able to confirm the functional conservation of the DVL/RTFL peptides in so evolutionarily distant plant species, as well as to determine that they are not essential for plant development, but they seem to have a role in the morphogenesis processes via cell elongation, providing robustness to the system. This work highlights the need of furthering the study of DVL/RTFL peptides to discover the mechanism by which they participate in plant development processes and to determine their biological function in depth. / Esta Tesis Doctoral ha sido financiada por la Generalitat Valenciana con una Subvención para la Contratación de Personal Investigador Predoctoral (ACIF/2018/260), el Ministerio de Ciencia e Innovación (proyectos BIO2015-64531-R y RTI2018-099239-B-I00), la Generalitat Valenciana (proyecto PROMETEU/2019/004) y el ExpoSeed H2020-MSCA-RISE-2015-691109 / Alarcia García, A. (2024). Los péptidos DEVIL: estudio de su papel en el control de la proliferación celular y la morfogénesis de las plantas [Tesis doctoral]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/202903

Tesis por compendio / [ES] En el contexto actual de cambio climático, resulta urgente desarrollar nuevas tecnologías de fitomejoramiento que garanticen el suministro de alimentos a una población en rápido crecimiento. La reciente aparición de herramientas basadas en las repeticiones palindrómicas cortas agrupadas y regularmente interespaciadas (del acrónimo CRISPR en inglés) y sus proteínas asociadas (Cas) ha revolucionado la edición genómica dirigida, resultando muy prometedora tanto para la biología vegetal básica como para la mejora de cultivos. Los sistemas CRISPR-Cas más comunes incluyen una endonucleasa Cas y un ARN guía que determina específicamente la secuencia diana a editar en el genoma. El suministro de los componentes de reacción CRISPR-Cas a una célula vegetal es un paso crucial que influye notablemente en la velocidad y la eficiencia de edición. Los enfoques convencionales se basan en el suministro de dichos componentes mediante tecnologías de transformación o la expresión transitoria en protoplastos, siendo ambos procesos laboriosos que pueden acarrear problemas legales. Alternativamente, estudios recientes han destacado el potencial de virus de ARN para ser utilizados como vectores de expresión transitoria de los componentes de reacción CRISPR-Cas en plantas, también conocido como edición genómica inducida por virus (VIGE en inglés). Puesto que la aplicabilidad de cada vector viral se encuentra limitada por sus propiedades moleculares y un rango específico de plantas huésped, esta Tesis ha tenido como objetivo principal expandir y mejorar las herramientas disponibles para el VIGE. En primer lugar, diseñamos un vector derivado del Virus X de la patata (PVX; género Potexvirus; familia Alphaflexiviridae) para suministrar múltiples ARNs guía a una línea transformada de Nicotiana benthamiana que expresaba constitutivamente la nucleasa Cas9 de Streptococcus pyogenes. Mediante el vector derivado de PVX, conseguimos editar genes endógenos de la planta huésped de manera eficiente, IV produciendo casi un 80% de modificaciones en tejidos de plantas adultas. Curiosamente, PVX permitió la expresión simultánea de matrices de ARNs guía no espaciados, lo cual resultó en la edición de múltiples genes en pocos días. Obtuvimos progenies editadas con una alta tasa de mutaciones bialélicas hereditarias tanto de plantas regeneradas a partir de tejido infectado como de semillas de plantas infectadas; en este último caso, el ARN guía fue previamente fusionado a un módulo de ARN móvil. Dado que PVX no se transmite por semillas, todas las plántulas editadas estaban libres de virus. A fin de expandir las estrategias basadas en virus de plantas para una edición genómica sin transformación, seguidamente desarrollamos un sistema de dos vectores virales compatibles para el suministro simultáneo de todos los componentes de reacción CRISPR-Cas en la planta. Modificamos el Virus del grabado del tabaco (TEV; género Potyvirus; familia Potyviridae) para que expresase una nucleasa Cas12a y, en combinación con el envío de ARN guía mediante PVX, logramos la edición sin transformación de una línea de N. benthamiana que expresaba constitutivamente la NIb del potyvirus. Además, demostramos que un único vector PVX era capaz de proporcionar la actividad de NIb, así como de suministrar el ARN guía para la edición genómica en plantas silvestres. En conjunto, el trabajo realizado en esta Tesis contribuye a la expansión de las herramientas actuales para VIGE. La amplia gama de huéspedes que poseen tanto PVX como TEV, particularmente entre solanáceas, postula a ambos virus como candidatos muy prometedores para futuras aplicaciones en genómica funcional y mejora de cultivos. / [CA] En el context actual de canvi climàtic, resulta urgent desenvolupar noves tecnologies de fitomillorament que garantisquen el subministrament d'aliments a una població en ràpid creixement. La recent aparició d'eines basades en les repeticions palindròmiques curtes agrupades i regularment interespaiades (de l'acrònim CRISPR en anglés) i les seues proteïnes associades (Cas) ha revolucionat l'edició genòmica dirigida, resultant molt prometedora tant per a la biologia vegetal bàsica com per a la millora de cultius. Els sistemes CRISPR-Cas més comuns inclouen una endonucleasa Cas i un ARN guia que determina específicament la seqüència diana a editar en el genoma. El subministrament dels components de reacció CRISPR-Cas a una cèl·lula vegetal és un pas crucial que influeix notablement en la velocitat i l'eficiència d'edició. Els enfocaments convencionals es basen en el subministrament d'aquests components mitjançant tecnologies de transformació o l'expressió transitòria en protoplasts, sent tots dos processos laboriosos que poden implicar problemes legals. Alternativament, estudis recents han destacat el potencial de virus d'ARN per a ser utilitzats com a vectors d'expressió transitòria dels components de reacció CRISPR-Cas en plantes, també conegut com a edició genòmica induïda per virus (VIGE en anglés). Com que l'aplicabilitat de cada vector viral es troba limitada per les seues propietats mol·leculars i un rang específic de plantes hoste, aquesta Tesi ha tingut com a objectiu principal expandir i millorar les eines disponibles per al VIGE. En primer lloc, dissenyem un vector derivat del Virus X de la creïlla (PVX; gènere Potexvirus; família Alphaflexiviridae) per a subministrar múltiples ARNs guia a una línia transformada de Nicotiana benthamiana que expressava constitutivament la nucleasa Cas9 de Streptococcus pyogenes. Mitjançant el vector derivat de PVX, aconseguim editar gens endògens de la planta hoste de manera eficient, produint quasi un 80% de modificacions en teixits de plantes adultes. Curiosament, PVX va permetre l'expressió VI simultània de matrius d'ARNs guia no espaiats, la qual cosa va resultar en l'edició de múltiples gens en pocs dies. Vam obtindre progènies editades amb una alta taxa de mutacions bial·lèliques hereditàries tant de plantes regenerades a partir de teixit infectat com de llavors de plantes infectades; en aquest últim cas, l'ARN guia va ser prèviament fusionat a un mòdul d'ARN mòbil. Atés que PVX no es transmet per llavors, totes les plàntules editades estaven lliures de virus. A fi d'expandir les estratègies basades en virus de plantes per a una edició genòmica sense transformació, seguidament desenvolupem un sistema de dos vectors virals compatibles per al subministrament simultani de tots els components de reacció CRISPR-Cas en la planta. Modifiquem el Virus del gravat del tabac (TEV; gènere Potyvirus; família Potyviridae) perquè expressara una nucleasa Cas12a i, en combinació amb l'enviament d'ARN guia mitjançant PVX, aconseguim l'edició sense transformació d'una línia de N. benthamiana que expressava constitutivament la NIb del potyvirus. A més, vam demostrar que un únic vector PVX era capaç de proporcionar l'activitat de NIb, així com de subministrar l'ARN guia per a l'edició genòmica en plantes silvestres. En conjunt, el treball realitzat en aquesta Tesi contribueix a l'expansió de les eines actuals per a VIGE. L'àmplia gamma d'hostes que posseeixen tant PVX com TEV, particularment entre solanàcies, postula a tots dos virus com a candidats molt prometedors per a futures aplicacions en genòmica funcional i millora de cultius. / [EN] Innovative breeding technologies are urgently needed to ensure food supply to a rapidly growing population in the face of climate change. The recent emergence of tools based on the clustered, regularly interspaced, short palindromic repeats (CRISPR) and CRISPR-associated (Cas) proteins has revolutionized targeted genome editing, thus holding great promise to both basic plant science and precision crop breeding. Most common CRISPR-Cas arrangements include a Cas endonuclease and a single guide RNA (sgRNA) that determines the specific target sequence to edit in the genome. The delivery of CRISPR-Cas reaction components within a plant cell is a crucial step that greatly influences editing speed and efficiency. Conventional approaches rely on supplying editing reaction components by transformation technologies or transient delivery to protoplasts, both of which are laborious processes that can raise legal concerns. Alternatively, recent studies have highlighted the potential of plant RNA viruses as transient delivery vectors of CRISPR-Cas reaction components, following the so-called virus-induced genome editing (VIGE). Since the applicability of each viral vector is limited to its molecular biology properties and a specific host range, the main objective of this Thesis has been to expand and improve the available toolbox for VIGE. First, we engineered a vector derived from Potato virus X (PVX; genus Potexvirus; family Alphaflexiviridae) to deliver multiple sgRNAs in a Nicotiana benthamiana transformed line constitutively expressing Streptococcus pyogenes Cas9. Using the PVX derived vector, host endogenous genes were efficiently targeted, producing nearly 80% indels in the tissues of adult plants. Interestingly, PVX allowed the simultaneous expression of unspaced sgRNA arrays, achieving highly efficient multiplex editing in a few days. We obtained edited progeny with a high rate of heritable bi-allelic mutations either from plants regenerated from infected tissue or infected plant seeds; in the latter II case, the sgRNA was previously fused to a mobile RNA module. Hence, since PVX is not seed-transmitted, all edited seedlings were virus-free. Aiming to expand the virus-based toolbox for transformation-free editing, we next developed a two-compatible virus vector system for the simultaneous delivery of all CRISPR-Cas reaction components in the plant. Tobacco etch virus (TEV; genus Potyvirus; family Potyviridae) was engineered to express a Cas12a nuclease, and in combination with PVX-assisted sgRNA delivery, we achieved successful transformation-free genome editing in a N. benthamiana line constitutively expressing potyviral NIb. Moreover, we demonstrated that a single PVX vector can supply the potyviral NIb activity as well as perform sgRNA delivery for genome editing in wild-type plants. Altogether, the work performed in this Thesis contributes to the enrichment of the current VIGE toolbox. The wide host range that both PVX and TEV possess, particularly among solanaceous species, postulates them as promising candidates for future applications in VIGE-mediated functional genomics and precision breeding. / Uranga Ruiz De Eguino, M. (2022). Engineering Viral Vectors for CRISPR-Cas Mediated Genome Editing in Plants [Tesis doctoral]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/183374 / Compendio