La maladie de la pourriture noire des Brassicacées est causée par la colonisation du système vasculaire des plantes par Xanthomonas campestris pv. campestris (Xcc). Cette bactérie, largement retrouvée sur les cinq continents, peut infecter de nombreuses espèces d'intérêts agronomiques et la plante modèle Arabidopsis. Malgré l'importance de cette maladie, la génétique et les bases moléculaires de la résistance à Xcc et de la résistance vasculaire en général restent méconnues et ont été le sujet de mes travaux de thèse. Des approches génétiques chez Arabidopsis ont permis d'identifier trois gènes (ZAR1, PBL2, RKS1) requis pour la résistance à Xcc et la reconnaissance de l'effecteur de type III XopAC de Xcc. Ces trois gènes codent respectivement une protéine de résistance canonique (famille des NLR) et deux kinases de la famille des RLCK. En collaboration avec l'équipe de J-M Zhou (Pékin), nous avons élucidé le mécanisme moléculaire de reconnaissance de XopAC: Un complexe de résistance préformé ZAR1-RKS1 reconnaît spécifiquement l'uridylylation de la kinase PBL2 par XopAC et induit la résistance à Xcc. Contrairement aux données existantes, la spécificité de reconnaissance du complexe de résistance n'est pas portée par la NLR mais par la kinase adaptateur RKS1. Ces résultats constituent la première description des mécanismes moléculaires sous tendant la résistance des brassicacées à Xcc et pourront servir de bases pour la mise en place de programmes rationnels d'amélioration variétale chez les Brassicacées cultivés. / Black rot disease of Brassicaceae is caused by the colonization of plant vasculature by Xanthomonas campestris pv. campestris (Xcc). This worldwide-distributed bacterium causes serious losses in brassica crops and also infects Arabidopsis. Despite of the economic importance of this disease, genetics and molecular bases of resistance to Xcc and vascular resistance in general is poorly understood. This topic was thus selected as my thesis project. Genetic approaches in Arabidopsis identified three genes (ZAR1, PBL2, RKS1) required for resistance to Xcc and the recognition of the Xcc type III effector XopAC. These three genes code for a canonical resistance protein of the NLR family and two kinases of the RLCK family, respectively. In collaboration with the group of J-M Zhou (Beijing), we uncovered the molecular mechanism of XopAC recognition: a preformed ZAR1-RKS1 resistance complex specifically recognizes PBL2 uridylylated by XopAC and triggers resistance to Xcc. In contrast to existing knowledge, the recognition specificity of the resistance complex is not conferred by the NLR but by the adaptor kinase RKS1. These results are the first description of the molecular mechanisms underlying Brassicaceae resistance to Xcc and pave the avenue for the rationale breeding of resistance in Brassica crops.

La bactériose vasculaire du riz (BLB) et bactériose non-vasculaire du riz (BLS), causées respectivement par Xanthomonas oryzae pv. oryzae (Xoo) et X. oryzae pv. oryzicola (Xoc), sont les deux plus importantes maladies bactériennes du riz. Ces maladies limitent le rendement de la production de riz dans les zones rizicoles en Asie et dans certaines régions d'Afrique. L'infection et la multiplication bactérienne dans les tissus de l'hôte dépendent souvent des facteurs de virulence de ces bactéries dont le type le système de sécrétion de type III (T3SS) et ses substrats. Dans cette thèse, nous avons identifié neuf effecteurs non-TAL (transcription Transcription activator-like) sécrétés par des effecteurs de type III de la souche chinoise 13751 de Xoo en utilisant le domaine d'induction HR de la protéine avirulente AvrBs1 comme gène reporter. Parmi eux, XopAE13751 a été expérimentalement confirmé pour la première fois comme étant un effecteur non-TAL. Ensuite, par l'analyse mutationnelle de ces gènes effecteurs identifiés dans Xoo, nous avons constaté que l'effecteur non-TAL XopR13751 était nécessaire pour la virulence de la souche chinoise de Xoo sur le riz hybride Teyou63. En parallèle, nous avons démontré que le gène rsmA (repressor of secondary metabolism) - comme le gène rsmAXoo de l'espèce chinoise Xoo 13751- régule positivement l'expression des gènes associés aux facteurs de virulence, tels que le système de sécrétion de type III, les enzymes extracellulaires et le DSF (diffusible signal factor). De plus, le gène effecteur non-TAL xopO s'est avéré être peu répandu chez les Xanthomonas puisqu'il est présent uniquement chez X. euvesicatoria (Xe) et Xoc mais est absent chez Xoo. En considérant les deux pathovars de X. oryzae, avec deux modes d'infection différents, xopO a été examiné comme un facteur de la spécificité du tissu par l'inactivation mutationnelle du gène dans Xoc et par l'expression du gène dans Xoo. Les résultats ont montré que xopO n'est pas la cause déterminante de la spécificité de tissu chez Xoc. Enfin, nous avons étudié les VNTRs (Variable Number of Tandem Repeats) comme outil de typage moléculaire rapide, fiable et rentable, pour améliorer le contrôle des épidémies et pour évaluer la structure de population des souches de Xoc. 28 loci candidats VNTR ont été prédits par le criblage de trois génomes de Xoc (souche philippine BLS256, souche chinoise GX01 et souche malienne MAI10). Des paires d'amorces pour l'amplification de PCR de chacun des 28 loci ont été conçues et testées à un pannel de 20 souches de Xoc provenant de l'Asie et de l'Afrique. Le séquençage des amplicons de PCR a confirmé 25 loci VNTR robustes et polymorphes communs entre les souches Xoc asiatiques et africaines. Un dendrogramme, construit à partir de la combinaison des 25 loci de VNTR (MLVA-25), a montré que la plupart des souches asiatiques sont clairement distinguables des souches africaines. Cependant, en accord avec de précédents rapports, une souche Malienne se distingue et semble être liée aux souches asiatiques, suggérant une introduction possible de souches sur le continent africain. Ce nouvel outil de typage basé sur les VNTR sera utile pour l'étude de structures de populations et pour la surveillance épidémiologique de Xoc. / Bacterial leaf blight (BLB) and Bacterial leaf streak (BLS), caused respectively by Xanthomonas oryzae pv. oryzae (Xoo) and X. oryzae pv. oryzicola (Xoc), are two most important bacterial diseases on rice, constraining severely the rice yield in the rice-growing areas in Asia and in parts of Africa. Successful infection and bacterial multiplication in host tissue often depend on virulence factors from these bacteria including type Ⅲ secretion system (T3SS) and its substrates. In this thesis, we identified nine type Ⅲ secreted non-TAL (Transcription activator-like) effectors of Xoo Chinese strain 13751 using HR-inducing domain of avirulence protein AvrBs1 as the reporter, among them, XopAE13751 was first found experimentally to be non-TAL effector. Subsequently, through mutational analysis of these identified effector genes in Xoo, we showed non-TAL effector XopR13751 was found to be required for full virulence of Xoo Chinese strain in hybrid rice Teyou63. In parallel, we demonstrated that rsmA (repressor of secondary metabolism)-like gene rsmAXoo of Xoo Chinese strain 13751 positively regulated the expression of genes associated with virulence factors such as type Ⅲ secretion system, extracellular enzymes and diffusible signal factor (DSF). Furthermore, non-TAL effector gene xopO was found to be narrowly distributed in Xanthomonas, which was only present in X. euvesicatoria (Xe) and Xoc, but not in Xoo. Based on the consideration of two X. oryzae pathovars carrying two different infection ways, xopO was tested in host and tissue specificity by analysis of mutational analysis of the gene in Xoc and expression of the gene in Xoo. The results showed that xopO of Xoc did not function as a determinant in host and tissue specificity. Finally, we explored Variable Number of Tandem Repeats (VNTRs) as a fast, reliable and cost-effective molecular typing tool, to better monitoring epidemics and assess the population structure of Xoc strains. 28 candidate VNTR loci were predicted by screening of three Xoc genome sequences (Philippine strain BLS256, Chinese strain GX01 and Malian strain MAI10). Primer pairs for PCR amplification of all 28 loci were designed and applied to a panel of 20 Xoc strains originating from Asia and Africa. Sequencing of PCR amplicons revealed 25 robust and polymorphic VNTR loci which are shared among Asian and African strains of Xoc. A dendrogram was constructed from 25 VNTR loci-combinating data (MLVA-25), indicating that most Asian strains were clearly discriminated from African strains. However, in agreement with previous reports, one strain from Mali appeared to be related to Asian strains, pointing to a possible introduction of strains to the African continent. A detailed analysis of the evolutionary relationships among a larger set of Xoc strains from China will be presented, considering different spatial scales. In conclusion, a new VNTR-based tool useful for studies of population structures and epidemiological monitoring of Xoc was successfully established.

Ralstonia solanacearum, une béta-proteobactérie d'origine tellurique, est l'une des phytobactérioses les plus nuisibles au niveau mondial. Cette bactérie est capable d'infecter plus de 250 espèces différentes dont certaines présentent un intérêt économique majeur (tomate, pomme de terre, tabac). R. solanacearum est divisée en 4 phylotypes distincts présentant des origines géographiques différentes : I (asiatique), IIA et IIB (américain), III (africain), IV (indonésien). Parmi ces phylotypes, le phylotype I est en expansion démographique, hautement recombinogène, réparti mondialement et possède une large gamme d'hôtes. Il possède donc un fort potentiel évolutif (sensu McDonald et Linde, 2002). Afin de contrôler cette bactérie, la lutte génétique reste la méthode la plus prometteuse : elle consiste à déployer des cultivars possédant différents sources de résistance (i.e., des gènes de résistance). La variété d'aubergine AG91-25 (E6) possède un gène majeur de résistance (ERs1) lui permettant de contrôler certaines souches de R. solanacearum de phylotype I. Cependant, la gestion de cette résistance requiert d'étudier au préalable sa durabilité afin d'en éviter le contournement. Cette durabilité peut être estimée en étudiant le potentiel évolutif d'un agent pathogène face à cette source de résistance, ainsi qu'en décryptant les mécanismes moléculaires de l'interaction entre l'hôte (gène R) et le pathogène (effecteur de types trois). Afin d'étudier la dynamique évolutive de R. solanacearum sous une pression de sélection exercée par la variété résistante E6, nous avons mis en place un essai d'évolution expérimentale au champ. Cet essai est composé de trois couples de microparcelles d'aubergines résistantes E6 et d'aubergines sensibles E8, implantées deux fois par an, pendant trois ans (soit 5 cycles). Un schéma MLVA (« Multi-Locus VNTR Analysis ») composé de 8 loci minisatellites a été développé afin de caractériser les souches extraites de ces cycles de cultures. Ces VNTR sont spécifiques aux souches de R. solanacearum de phylotype I, hautement polymorphes et discriminants à toutes les échelles : mondiale, régionale et locale. Nos résultats démontrent une absence de contournement de la résistance d'E6 par les populations parcellaires de R. solanacearum, confirmant le caractère durable de cette résistance. Cette variété aurait fortement réduit les populations bactériennes du sol, ne leur permettant plus d'infecter l'hôte résistant. Parallèlement, 100% des plants d'E8 sont morts à partir du cycle 2. La maladie au sein des microparcelles semble progresser selon une dynamique de « plante-à-plante ». Une baisse de la diversité génétique a aussi été observée au cours des cycles de culture répétés d'E8, associée à l'augmentation en fréquence de deux haplotypes. Cependant, aucune structuration génétique claire n'a été observée à l'échelle de la parcelle entière ou de la microparcelle. En revanche, les données d'isolement par la distance semblent indiquer qu'une structure spatiale semble être en cours d'établissement. L'ensemble de nos résultats suggère une structure épidémique clonale de nos populations parcellaires. Nous nous sommes aussi intéressés à l'implication de 10 ET3 dans l'interaction R. solanacearum vs aubergine résistante (E6). La distribution des 10 ET3 candidats est variable au sein d'une collection de souches phylogénétiquement diverses (91 souches) : ripAJ et ripE1 sont les ET3 les plus partagés alors que ripP1 et ripP2 sont les moins fréquemment. Certains ET3 présentent peu (ripAJ) voire pas (ripE1 et ripP2) de polymorphisme de taille, alors que d'autres (ripAU) sont extrêmement polymorphes. Cependant la composition en effecteurs d'une souche ne semble pas être corrélée à un phénotype sur aubergine E6. Nous avons identifié le gène d'effecteur ripAX2 comme ayant une fonction d'avirulence sur aubergine résistante E6. Sa reconnaissance par E6 semble s'opérer au niveau de la zone hypocotylaire. / Ralstonia Solanacearum is a soilborn beta-proteobacterium responsible of bacterial wilt on Solanaceaous crops. This bacterium is considered as one of the most harmful plant disease worldwide. This bacterium possesses the ability to infect more than 250 different species, including crops with major economic importance (tomato, potato, tobacco, eucalyptus…). R. solanacearum is divided into four phylotypes originated from different areas: I (Asian), IIA and IIB (American), III (African), IV (Indonesian). Among these phylotype, phylotype I is currently in demographic expansion, is highly recombinogenic and has a wide hosts range. Thus, altogether, these characteristics demonstrated that this phylotype has a high evolutionary potential (sensu McDonald and Linde, 2002). In order to control this bacterium, genetic plant resistance seems to be the most promising method. This method consists in using cultivars with different source of resistance such as resistance genes and/or resistant QTLs. The AG91-25 (E6), an eggplant cultivar possessing a major resistance gene (ERs1), is capable to control some of phylotype I strains of R. solanacearum. However, in order to optimize the management of this resistance and to avoid its fast breakdown, we need to deeply investigate the durability of this resistant gene. Durability can be estimated by studying the evolutionary potential of our pathogen faced to E6 source of resistance and by understanding the molecular mechanisms underlying the interaction between the host (R gene) and its pathogene (Type III Effector – T3E). In order to study R. solanacearum evolutionary dynamics under selective pressure from E6 resistant cultivar, we set up an experimental evolution trial in the field. This trial consisted of three couples of resistant (E6) and susceptible eggplants (E8) microplots, implanted twice a year during three years, hence consisting of 5 cycles. A Multi-Locus VNTR Analysis (MLVA) scheme, consisting of 8 minisatellite loci, was developed in order to characterize the strains extracted from these crop cycles. These VNTRs were specific to R. solanacearum phylotype I strains, they were highly polymorphic and discriminatory at different scale: globally, regionally and locally.Our results showed no breakdown of E6 resistance by R. solanacearum populations, which confirms that this resistance is durable. It seemed that this cultivar reduced the soil bacterial population, preventing bacterial population to infest the resistant host. At the same time, 100% of the E8 plants have died, starting at cycle 2. Bacterial wilt seemed to spread with a “plant-to-plant” dynamics within each microplot. Genetic diversity reduction was also observed during the successive cycle of susceptible eggplant, associated with the increase of frequency of two main haplotypes. However, we failed to identify a clear genetic structuration, neither at the plot scale nor at the microplot scale. Nevertheless, isolation-by-distance data seemed to show that a spatial structure is currently establishing. Altogether, our results suggested that our plot populations appeared to have a clonal epidemic structure.We also looked into 10 T3Es' involvement in the interaction between R. solanacearum and the resistant eggplant (E6). Their distribution was completely different within a collection of phylogenetically diverse strains (91 strains): ripAJ and ripE1 are the most shared T3Es whereas ripP1 and ripP2 were the less common T3E whithin our collection of strains. Some T3Es showed few (ripAJ) or no length polymorphism at all (ripE1 and ripP2) whereas some other (ripAU) are extremely polymorphic. Nevertheless, the T3E effector repertoire did not seemed to be correlated to a specific phenotype on E6 eggplant. Its recognition by E6 seemed to occur in the hypocotyle region rather than in the mesophyll, highlighting a possible organ-specificity of the interaction between ERs1 and ripAX2.