Zusammenfassung der Arbeit Dissertation zur Erlangung des akademischen Grades Dr. med. Titel: Quantifizierung und zelluläre Lokalisation von Eisen in der Substantia nigra bei Patienten mit Parkinsonscher Erkrankung und gesunden Kontrollen eingereicht von Isabel Weigelt angefertigt an der Medizinischen Fakultät der Universität Leipzig Paul Flechsig Institut für Hirnforschung, Abteilung Molekulare und Zelluläre Mechanismen der Neurodegeneration betreut von PD Dr. Dr. Markus Morawski Prof. Dr. Thomas Arendt November 2019 Das Spurenelement Eisen ist aufgrund seiner Schlüsselrolle in der Neurotransmittersynthese oder der Myelinisierung essentiell für Neuronen. Sein ubiquitäres Vorkommen erfordert eine Regulierung der Eisenhomöostase in engen Grenzen. Hohe Konzentrationen an freiem Eisen sind jedoch in der Lage, über den Weg der Fenton-Reaktion das oxidative Stresslevel der Zelle drastisch zu erhöhen und die Bildung vermehrter reaktiver Sauerstoffspezies zu triggern; betroffene Zellen degenerieren. Eine Erhöhung der Eisenkonzentration wird bei zahlreichen neurodegenerativen Erkrankungen beschrieben, so auch bei Parkinsonscher Erkrankung (PD). Die aktuelle Datenlage zu quantitativen Eisenkonzentrationen in den verschiedenen Zelltypen innerhalb der menschlichen SN ist jedoch rar. Elementanalysen, vor allem von Eisen, bieten eine ideale Möglichkeit, um die Rolle des Eisens sowie der Eisenspeicherformen im Rahmen der Pathogenesemechanismen weiter zu entschlüsseln und so besser beurteilen zu können. Ziel der Arbeit war es, neben der Beschreibung typischer Veränderungen der Zellen bei PD die Verteilung der Haupteisenspeicherformen Ferritin und Neuromelanin darzustellen sowie eine eventuelle Kolokalisation mit Gliazellarten aufzudecken. Quantitativ sollte eine Bestimmung des Gesamteiseins und der differentiellen ortsaufgelösten zellulären Eisenkonzentration erfolgen, um direkte Veränderungen in den Eisenkonzentrationen zwischen Kontrollen und PD identifizieren zu können. Hierfür erfolgte zu qualitativen Analysezwecken zunächst eine klassische sowie Fluoreszenz-immunhistochemische Darstellung zellspezifischer Marker (anti-HuC/D, -IBA-1, -GFAP, -CNPase, -OLig2, -MBP, -Ferritin, -HLA) nach Standardprotokoll mit einer Ni-DAB Verstärkung. Histochemische Färbungen nach Perls und Turnbull wurden zum semiquantitativen Eisennachweis durchgeführt. Als Methode zur ortsaufgelösten quantitativen Eisenbestimmung kam die Ionenstrahlmikroskopie (Partikel-induzierte Röntgen-Emission, PIXE) zur Anwendung. Die wichtigsten Ergebnisse sind nachfolgend dargestellt: Immunhistochemie und Histochemie • Typische zelluläre Veränderungen bei PD konnten in Übereinstimmung mit bestehender Literatur immunhistochemisch bestätigt werden. So findet sich der höchste Neuronenverlust im Nigrosom 1, die Gliazellen zeigen deutliche Aktivierungszeichen hinsichtlich ihrer Verteilung und Morphologie. • Eine Kolokalisation von Ferritin mit Oligodendrozyten konnte sowohl über klassische Immunhistochemie als auch über eine Fluoreszenz-Doppelmarkierung gezeigt werden. • Bei PD nimmt die Dichte von Ferritin-positiven Oligodendrozyten zu. • Als Zeichen für eine Aktivierung der Oligodendrozyten bei PD sind die erhöhte Oigodendrozytendichte und degenerative Veränderungen der Myelinfasern in Kombination mit einer erhöhten MBP-Immunreaktivität denkbar. • Bei PD sind semiquantitativ höhere Bestände nicht-chelatierten Fe3+ nachweisbar, das flächenmäßig dargestellte eisenreiche Gebiet der SN zeigt in > 50% der Fälle mit PD eine größere Ausdehnung (Färbung nach Perls). Das Nigrosom 1 ist bei PD nicht mehr anhand einer schwächeren Farbreaktion im Vergleich zur gesamten SN auszumachen. Ionenstrahlmikroskopie • Mit dem Ionenstrahlmikroskop wurden erstmals selektiv gefärbte Zellarten in der humanen SN bei PD und Kontrollen hinsichtlich ihrer zellulären Eisenkonzentration vergleichend quantifiziert. • Das Gesamteisen im Nigrosom 1 beträgt bei den Kontrollen ca. 2,49 mmol/l, bei PD ca. 3,00 mmol/l. • Neuronen zeigen bei PD eine um ca. 107 % erhöhte Eisenkonzentration (KO: 1,98 mmol/l). • Mikrogliazellen vergrößern im Rahmen ihrer Aktivierung bei PD ihre zellulären Eisenbestände um ca. 26 % (KO: 3,19 mmol/l). • Die zelluläre Eisenkonzentration der Astrozyten ist bei PD nicht signifikant verändert (KO: 4,31 mmol/l; PD: 4,11 mmol/l). • Oligodendroglia weisen in Abhängigkeit des verwendeten Zellmarkers unterschiedliche zelluläre Eisenkonzentrationen auf. Olig2-positive Zellen akkumulieren bei PD im Durchschnitt 250% mehr Eisen (KO: 2,76 mmol/l), CNPase-positive Oligodendrozyten ca. 64 % mehr Eisen (KO: 1,81). • Neuromelanin ist bei PD infolge der Neurodegeneration zunehmend extrazellulär zu finden und deutlich stärker mit Eisen beladen (KO: 8,73 mmol/l; PD: 14,21 mmol/l). • Ferritin-positive Oligodendrozyten besitzen unter den Gliazellen den höchsten zellulären Eisengehalt (6,01 mmol/l). Bei PD sinkt die zelluläre Eisenkonzentration jedoch auf ca. 51 %, was eine Entleerung der Ferritinspeicher mutmaßen lässt. Eine Erhöhung der Eisenkonzentration ist in nahezu allen untersuchten Zellarten zu beobachten. Eine vermutete Entleerung der Ferritinspeicher impliziert in Kombination mit der steigenden zellulären Eisenkombination letztlich eine Vergrößerung des LIP der Zellen in der SN bei PD. Diese Hypothese wird durch die bei PD entschieden intensiver ausfallende Perls-Färbung zum Nachweis nicht-chelatierten Fe3+ gestützt. Eisen kommt unumstritten eine nicht zu vernachlässigende Rolle bei neurodegenerativen Prozessen zu. Die Quantifizierung von Eisen in verschiedenen Zelltypen gibt Aufschluss über die Veränderung der Eisenkonzentrationen bei PD. Dennoch bleiben genaue Mechanismen, die zu einem Anstieg des Eisens führen, Gegenstand weiterer Forschungen.:1 Einleitung 1 1.1 Eisen 1 1.1.1 Überblick über den systemischen Eisenstoffwechsel 1 1.1.2 Eisenverteilung und Eisenstoffwechsel im Gehirn 2 1.1.3 Der labile Eisenpool 4 1.2 Parkinsonsche Erkrankung 5 1.2.1 Symptomatik und Pathogenese 5 1.2.2 Äthiopathogenese 6 1.2.3 Substantia nigra 7 1.2.3.1 Topografie und Gliederung des Kerngebietes 7 1.2.3.2 Zellverlust innerhalb der Substantia nigra bei Parkinsonscher Erkrankung 9 1.2.3.3 Einbindung der Substantia nigra in die Basalganglienschleife 11 1.2.4 Veränderungen der Gliazellen bei Parkinsonscher Erkrankung 11 1.2.4.1 Veränderungen der Mikroglia 11 1.2.4.2 Veränderungen der Astroglia 13 1.2.4.3 Veränderungen der Oligodendroglia und der Myelinfasern 14 1.2.5 Eisen – Spurenelement mit Schlüsselrolle in der Pathogenese des M. Parkinson? 15 1.3 Methodische Einleitung 18 1.3.1 Quantifizierungsmöglichkeiten von Eisen 18 2 Fragestellung und Zielsetzung 20 3 Material und Methoden 22 3.1 Material 22 3.1.1 Humanes Probenmaterial 22 3.1.2 Chemikalien 24 3.1.3 Reagenzien 25 3.1.4 Geräte und Verbrauchsmaterialien 27 3.2 Methoden 28 3.2.1 Gewebefixierung 28 3.2.2 Paraffineinbettung 28 3.2.3 Herstellung der Paraffinschnitte 29 3.2.4 Färbungen und Immunhistochemie 29 3.2.5 „Avidin-Biotin-Complex“-Methode für die Immunhistochemie 30 3.2.6 Darstellung verschiedener Gehirnzelltypen mit der ABC-Methode 33 3.2.6.1 Darstellung von Neuronen mittels anti-Humanem Neuronalem Protein (anti-HuC/D) 33 3.2.6.2 Darstellung von Astroglia mittels anti-Glial Fibrillary Acidic Protein (anti-GFAP) 34 3.2.6.3 Darstellung von Mikroglia mittels anti-HLA-DP,-DQ,-DR und anti-IBA-1 34 3.2.6.4 Darstellung von Oligodendroglia mittels anti-CNPase und anti-Olig2 34 3.2.6.5 Darstellung von Myelin mittels anti-Myelin Basic Protein (anti-MBP) 35 3.2.6.6 Darstellung von Ferritin mittels anti-Ferritin Heavy Chain (Y-16) 35 3.2.7 Fluoreszenz-Immunhistochemie 35 3.2.8 Histochemische Färbungen zum semiquantitativen Eisennachweis 37 3.2.8.1 Färbung nach Perls zum Nachweis von Fe3+ 37 3.2.8.2 Färbung nach Turnbull zum Nachweis von Fe2+ 38 3.2.9 Identifikation anatomischer Regionen der Substantia nigra und Anfertigung der Abbildungen 39 3.2.10 Ionenstrahlmikroskopie 39 3.2.10.1 Technische Aspekte der Ionenstrahlmikroskopie 40 3.2.10.2 Analysemethoden am LIPSION 43 3.2.10.3 Grundlagen der protoneninduzierten Röntgenemission (PIXE) 44 3.2.10.4 Grundlagen der Rutherford-Rückstreuung (RBS) 45 3.2.10.5 Probenpräparation für die Nanosonde 45 3.2.10.6 Kombination von Immunhistochemie und Ionenstrahlmikroskopie 46 3.2.10.7 Der Messvorgang an der Nanosonde 47 3.2.10.8 Auswertung der experimentell ermittelten Daten 49 3.2.11 Quantitative MR-Bildgebung 53 3.2.12 Statistische Auswertung 53 4 Ergebnisse 54 4.1 Immunhistochemie 54 4.1.1 Darstellung von Neuronen mittels anti-Humanem Neuronalem Protein (anti HuC/D) 54 4.1.2 Darstellung von Astroglia mittels anti-Glial Fibrillary Acidic Protein (anti GFAP) 56 4.1.3 Darstellung von Myelin mittels anti-Myelin Basic Protein (anti MBP) 58 4.1.4 Darstellung von Mikroglia mittels anti-ionized calcium binding adaptor molecule 1 (anti IBA 1) und anti HLA DP, DQ, DR 60 4.1.5 Darstellung von Oligodendroglia mittels anti-CNPase und anti-Olig2 64 4.1.6 Darstellung von Ferritin-reaktiven Zellen mittels anti-Ferritin Heavy Chain (Y-16) 66 4.1.7 Fluoreszenz-Doppelmarkierung zur Darstellung der zellulären Lokalisation immunhistochemisch detektierter Ferritinbestände (Ferritin - IBA-1, Ferritin - GFAP, Ferritin - Olig2) 68 4.2 Semiquantitativer Eisennachweis 70 4.2.1 Nachweis von Fe3+ nach Perls (DAB) 70 4.2.2 Nachweis von Fe2+ nach Turnbull 73 4.3 Ionenstrahlmikroskopie 76 4.3.1 Ortsaufgelöste Elementdarstellung und Bestimmung der Eisenkonzentration in ausgewählten Regionen von Interesse 76 4.3.2 Eisenkonzentration verschiedener Gehirnzelltypen im Nigrosom 1 79 4.3.3 Eisenkonzentration ausgewählter Eisenspeicherformen im Nigrosom 1 81 4.3.4 Gesamteisenkonzentration im Nigrosom 1 sowie Anteil der untersuchten Zellarten und Eisenspeicherformen am Gesamteisen 82 4.3.5 Elementprofile ausgewählter Zellarten mit deren Eisenspeicherformen 83 4.4 Kurzzusammenfassung der Ergebnisse 86 4.4.1 Klassische Immunhistochemie, Histochemie und Fluoreszenz-IHC 86 4.4.2 Ionenstrahlmikroskopie 86 5 Diskussion 88 5.1 Methodische und vergleichende Betrachtungen 88 5.1.1 Hirngewebe 88 5.1.2 Ionenstrahlmikroskopie 88 5.1.3 Immunhistochemie 92 5.2 Diskussion der Ergebnisse 93 5.2.1 Quantifizierung von Eisen im Nigrosom 1 der SNpc 93 5.2.2 Degeneration dopaminerger Neuronen innerhalb der Substantia nigra 100 5.2.3 Veränderungen der Gliazellen bei Morbus Parkinson 100 5.2.4 Interpretationsmöglichkeiten der Perls-Färbung 104 5.3 Ausblick 106 6 Zusammenfassung 108 7 Literaturverzeichnis 111 8 Eigenständigkeitserklärung 132 9 Lebenslauf 133 10 Danksagung 135