Neste trabalho, usamos as técnicas espectroscópicas de UV-vis, dicroísmo circular (CD) e ressonância paramagnética eletrônica (RPE) para caracterizar as microperoxidases-8 e 9 e N-AcMP-9. As microperoxidases são produtos da digestão proteolítica de citocromo c, contendo em média dez resíduos de aminoácidos. Não possuindo o sexto ligante, o ferro hemínico neste caso apresenta-se no estado de alto spin. Nossos resultados mostram que a transição alcalina (pKa = 8,53) produz agregados de hemepeptídeos no estado de baixo spin, nos quais a molécula de água é deslocada pelo grupo N-terminal da cisteína de uma MP-8 vizinha. Para valores altos de pH ocorre uma desprotonação do anel imidazol da histidina que ocupa a quinta coordenação do ferro hemínico. Nessa condição de pH a MP-8 encontra-se em um equilíbrio de espécies agregadas no estado de alto e baixo spin. Uma espécie agregada é formada pela MP-8 pentacoordenada com o hitidinato ocupando a sexta coordenação. Já a outra espécie agregada é composta pela coordenação do grupo a-amino da cisteína e do íon hidróxido, ocupando a sexta e quinta coordenação do ferro hemínico, respectivamente. Quanto a N-AcMp-9, o estado de baixo spin é produzido pela desprotonação da água (pKa = 9,6) situada na sexta coordenação do ferro. Esses resultados estão de acordo com os encontrados para N-AcMP-8. Sobre a MP-9, o estado de baixo spin é obtido com o deslocamento da água pelo grupo a-amino terminal da lisina 13 de uma molécula vizinha. Acima do pH 85, o grupo c-amino da lisina 13 estabelece uma coordenação intra-cadeia. Os monômeros exibem OH- ou histidinato na quinta posição de coordenação. A coordenação intra-cadeia na MP-9 foi corroborada pela simulação de dinâmica molecular (MD). Vale mencionar que todos os resultados de CD e RPE foram simulados utilizando-se os programas CCA e QPOW, respectivamente. Realizamos também medidas de RPE pulsado do citocromo c em tampão fosfato pH 7,4 em SDS e em Cardiolipina com o objetivo de investigar o estado de baixo spin alternativo. Realizamos experimentos de eco com varredura de campo (Echo field sweep), ESEEM (Electron spin echo envelope modulation), e tempo de relaxação spin-rede T, para uma completa caracterização dos compostos acima citados / In this work we have used spectroscopic techniques such as UV-vis, circular dichroism, and electronic paramagnetic resonance to characterize the microperoxidases-8 and -9 and also N-AcMP-9. Microperoxidases are products of the proteolytic digestion of cytochrome c, containing an average of ten residues of aminoacids. Lacking the sixth ligand, the heminic iron is ín the high spin state. Our results show that the alkaline transition (pKa = 8,53) produces hemepeptideos aggregates in the low spin state, in which the water molecule is displaced by the Nterminal group of a nearby MP-8 cysteine. For high values of pH there is a deprotonation of the imidazole ring of the histidine that occupies the heminic iron\'s fifth coordination. In that pH MP-8 is found in equilibrium of aggregated species of high and low spin. An aggregated species if formed by the pentacoordinated MP-8 with the histidinate in the sixth coordination. The other aggregated species is composed by the coordination of the alpha-amino groups of cysteine and hydroxide ion, occupying the sixth and fifth coordination of heminic iron, respectively. As for NAcMp-9, the low spin state is produced by deprotonation (pKa=9.6) of the water located at the iron\'s sixth coordination. These results agree with others found for NAcMp-8. In MP-9 the low spin state is obtained displacing the water by the terminal alpha-amino group of Lysl3 in a nearby molecule. Above pH 8.5 the epsilon-amino group of Lysl3 coordinates intra-chain. The monomers exhibit OH- or histidinate in the fifth coordination. The intra-chain coordination of MP-9 was confirmed by molecular dynamics simulation. It is important to notice that all results from CD and EPR were simulated using the programs CCA and QPOW, respectively. We also made pulsed EPR measures of cytochrome c in fosfato buffer pH 7.4 in SDS and in cardiolipin, in order to investigate the alternative low spin state. We made experiments with echo field sweep, ESEEM and spin-lattice relaxation time TI for a complete characterization of the above mentioned mixture

Na maioria dos vertebrados o tridecapeptídeo alfa-MSH (hormônio estimulante do melanócito) é um hormônio fisiologicamente relevante na regulação da pigmentação da pele, causando escurecimento (Sawyer, et al., 1980; Jiang et al., 1995). O alfa-MSH também está envolvido em muitas outras funções, como crescimento fetal e comportamento (Castrucci, et al., 1990). No presente trabalho foi estudada a interação entre peptídeos melanotrópicos e membranas lipídicas sob as perspectivas da perturbação da fase lipídica e das modificações conformacionais dos peptídeos. Foram usados: dois tipos de vesículas (aniônica de DMPG - dimiristoil fosfatidil glicerol - e neutra de DMPC - dimiristoil fosfatidil colina) e dois peptídeos melanotrópicos (alfa-MSH e o análogo que apresenta maior atividade biológica, [Nle POT.4, D-Phe POT.7]-alfa-MSH (MSH-I). Por meio de ressonância paramagnética eletrônica (RPE) foram observadas alterações estruturais dos lipídios causadas pela interação dos peptídeos com a membrana aniônica. Todos os marcadores de spin usados, derivados do ácido esteárico, fosfolipídicos e derivado do colesterol, incorporados em vesículas de DMPG, na fase líquido-cristal, indicaram que os dois peptídeos induzem um decréscimo no movimento e/ou aumento da ordem das cadeias acilas, em todas as posições monitoradas. O efeito do análogo sobre os parâmetros dos espectros de RPE dos marcadores de spin foi mais evidente, e isto estaria indicando que penetra mais fundo na matriz lipídica. A dependência com o sal da interação peptídeo-lipídio demonstra que a atração eletrostática dos peptídeos carregados positivamente com as cabeças polares dos lipídios aniônicos foi necessária para uma efetiva associação dos peptídeos com a bicamada fosfolipídica. A necessidade da interação eletrostática também foi observada pela não-interação dos peptídeos com bicamadas neutras de DMPC. No desenvolvimento do trabalho foi calculado ) o coeficiente de partição baseado no efeito que estes peptídeos causam no espectro de RPE dos marcadores de spin intercalados na membrana. O coeficiente de partição obtido para peptídeo análogo, mais potente biologicamente, foi cerca de quatro vezes maior do que para o hormônio nativo. Para uma mesma concentração de peptídeo ligado à membrana, foi observado que o efeito do MSH-I sobre a estrutura da membrana é um pouco maior do que do alfa-MSH, o que estaria de acordo com uma possível penetração mais fundo na bicamada. Os espectros de dicroísmo circular (CD) em solução aquosa e no solvente indutor de alfa-hélice, o 2.2.2-trifluoroetanol (TFE) mostraram que os dois peptídeos têm estrutura um pouco diferentes em solução, embora apresentem mudanças conformacionais similares quando na presença de vesículas ou micelas carregadas negativamente. O maior efeito causado pelo análogo mais potente na estrutura da bicamada, quando comparado ao hormônio nativo, é discutido em termos de sua maior constante de associação e possibilidade de maior penetração na bicamada. Estes resultados estariam relacionados com a maior atividade e/ou prolongada ação do peptídeo análogo. / In most vertebrates the tridecapeptide -melanocyte stimulating hormone (-MSH) is physiologically relevant hormone regulating skin pigmentation, causing darkening (Sawyer, et al., 1980; Jiang et al., 1995). -MSH is also involved in many other biological functions, such as fetal growth and behavior (Castrucci, et all., 1990). The present work studies the interaction of -MSH and the biologically more active analog [Ne4, Dphe7]- -MSH with lipid vesicles by spin label electron spin resonance (Esr) spectroscopy and circular dichroism (CD). All spin labels used here, stearic acid, phospholipid and cholestane derivative labels, incorporated into anionic vesicles of DMPG (1,2-dimyritoyl-sn-glycero-3-phophoglycerol) in the liquid-cristiline phase, indicated that both peptides decrease the motional freedom of the acyl chains, at all monitored positions. The effect of the analog on the spin label ESR parameters was much more evident, and could indicate its farthest penetration into the lipid matrix. The salt dependence of the peptide- lipid interaction demonstrated that the electrostatic attraction of the positively charged residues of the peptides by the PG headgroups was necessary for an effective association of the peptides with phospholipid bilayers. The perturbation caused by the peptides on the lipid chain mobility was reduced as the ionic strength increased. Above 300 mM NaCl no perturbation could be detected. The electrostatic requirement was further evidenced by the absence of detectable binding of peptides to neutral lipid bilayers. Lipid partition coefficients were calculated based on the effect the peptides cause on the ESR spectra of spin labels incorporated in the membrane. For the biologically more potent peptide, the partition coefficient was found to be about 4-times greater than that of the native hormone. For the same concentration of the peptide bound to the membrane, MSH-I was found to cause a slightly greater effect on the membrane structure than -MSH, in accord with its possible deeper penetration into the bilayer. Cd spectra in aqueous solution and in the -helix inducing solvent 2.2.2-trifluoroethanol (TFE) showed that the two peptides have somewhat different structures in solution, though similar conformational changes occur in both peptides as a result of their interaction with negatively charged vesicles or micelles. The stronger effect caused by the more potent analog in the membrane structure, when compared to the native hormone, is discussed in terms of the higher peptide-lipid association constant and the possible deeper penetration into lipid bilayers. The results could be related to its greater activity and/or prolonged action of the peptide analog.

A melatonina (N-acetil 5-metoxi-triptamina) é um hormônio derivado do amino-ácido triptofano, secretado pela glândula pineal, estando relacionado com importantes processos biológicos e farmacológicos. O seu mecanismo de ação não é bem conhecido, entretanto é sabido que a melatonina não tem uma ação específica, podendo interagir com diversos tipos de células (Reitel, 1992, Bioessays, 14: 169-175), sugerindo que possa não existir um tecido ou célula-alvo específica, na qual a melatonina exerça a sua ação hormonal. Assim, é possível que a melatonina não interaja através de um receptor proteico específico de membrana e possa interagir com a célula via a fase lipídica membranar. O presente trabalho estuda a interação de melatonina com membranas lipídicas por espectroscopia de RPE (ressonância paramagnética eletrônica), utilizando o método do marcador de spin (Swartz, Bolton e Borg editores, Biological Applications of Electron Spin Resonance, 1972, Willey-Interscience, New York; Berliner, L.J. editor, Spin Labeling, 1976 (vol. 1) e 1979 (vol. 2), Academic Press, New York); e espectroscopia de fluorescência estática, pois a melatonina é uma molécula fluorescente. Os fosfolipídios utilizados nos sistemas modelo de membrana (lipossomos e vesículas unilamelares) foram principalmente o DMPG (dimiristoil fosfatidil glicerol) e DMPC (dimiristoil fosfatidil colina). Os sistemas estudados por RPE foram analisados por meio de medidas dos tempos de correlação rotacional perpendicular (R) e paralelo (R) ao eixo principal de rotação do radical nitróxido (Marsh, em Biological Magnetic Resonance, 255-303, e Bales, em Biological Magnetic Resonance, 77-130, editores Berliner e Reuben, 1989, vol. 8, Plenum Publishing, New York), parâmetro de ordem efetivo (Sef) e do parâmetro 2Amáx (Griffth e Jost, em Spin Labeling, 454- 523,editor Berliner, 1976, vol. 1, Academic Press, New York). Os resultados experimentais mostram que a melatonina: a) é solúvel em meio aquoso até a concentração de 5mM, ao contrário do que está na literatura, tendo sido desenvolvido um novo método para solubilizá-la; b) interage com membranas lipídicas provocando mudanças estruturais nas membranas. Esta interação ocorre próxima à região da cabeça polar, detectada pelos marcadores de spin utilizados, que monitoram diferentes regiões da bicamada lipídica; e pela fluorescência, que mostra que a melatonina não apresenta um deslocamento do máximo de emissão na presença de vesículas de DMPG ou DMPC; c) interage mais fortemente com membranas lipídicas de fosfolipídio com cabeça polar carregada negativamente (DMPG), do que de fosfolipídio com carga líquida igual a zero (DMPC). Este resultado mostrado tanto por RPE quanto por fluorescência. Essa diferença é discutida em termos da estrutura das membranas, através dos parâmetros R, Sef e 2Amáx, que descrevem descreve o grau de \"fluidez\" da bicamada; d) em membranas de DMPG, torna mais \"fluida\" na região da cabeça polar dos fosfolipídios da bicamada lipídica, tanto abaixo como acima da temperatura de transição de fase (Tf) das mesmas. A alteração da \"fluidez\" ocorre nesta região da bicamada, pois os marcadores de spin utilizados mostram que: i) O SSL (4-estereamida-1-oxil-2,2,6,6-tetrametil piperidina), que monitora a região da cabeça polar, acima da Tf , mostra que a presença de melatonina em DMPG provoca a diminuição de R; e abaixo da Tf, não é possível o cálculo do tempo de correlação rotacional, entretanto o efeito da melatonina é observado através da diminuição das larguras de linha do espectro. ii) O 5-SASL (5-doxil ácido esteárico) e 6-DPPC (1-palmitioil-2-(6-doxil ácido esteárico) fosfatidil colina), que monitoram uma região da cadeia de hidrocarbonetos ainda próxima à região da cabeça polar, mostram que nesta região, acima da Tf, a presença de melatonina não provoca alterações significativas na estrutura de bicamadas de DMPG ou DMPC; e abaixo da Tf, a presença da melatonina \"fluidifica\" a membrana provocando uma diminuição do parâmetro 2Amáx, somente em DMPG. iii) O 12-SASL (12-doxil ácido esteárico) que monitora principalmente uma região próxima ao final da cadeia, não mostra alterações em seu espectro com a presença da melatonina; e) por interagir com membranas lipídicas, pôde ter o seu coeficiente de partição determinado por medidas de RPE e fluorescência. Os coeficientes foram determinados por métodos diferentes. Por RPE foi baseado em Lissi e col. (1990, Biochem. Biophys. Acta, 1021: 46-50) e o por fluorescência foi baseado em Tabak e Borisevith (1992, Biochem. Biophys. Acta, 1116: 241-249). Os coeficientes determinados apresentaram uma grande discrepância, sendo baixo para RPE (P=30) e alto para fluorescência (P=1090), provavelmente devido à técnica utilizada, assunto que é discutido no trabalho. Os resultados de RPE e fluorescência, citados acima, confirmando que a melatonina interage com membranas lipidíca, associado ao fato de que a melatonina é bastante solúvel em meio aquoso, têm algumas implicações de cunho biológico que abrem a discussão sobre questões como a necessidade de um carregador do hormônio no plasma sanguíneo ou o mecanismo que leva o hormônio a atravessar a membrana plasmática e interagir no núcleo da célula (Tan e col, 1993, Cancer Letters, 70: 65-71). / Melatonin (N-acetyl 5-methoxy-tryptamine), a tryptophan derivative hormone, is the main product of secretion by pineal gland. It has been related with important biological and pharmacological processes, although its mechanism of action is not well known. Melatonin is known to interact with different types of cells, playing different roles (Reitel, 1992, Bioessays, 14: 169-175), suggesting that the molecule does not interact through a specific membrane protein receptor in a specific cell, and could possibly interact with the cell through its membrane lipid phase. The present work studies the melatonin interaction with model lipid membrane using EPR (Eletronic Paramagnetic Resonance) spectroscopy, using the spin label method (Swartz, Bolton e Borg editors, Biological Applications of Electron Spin Resonance, 1972, Willey-Interscience, New York; Berliner, L.J. editor, Spin Labeling, 1976, vol. 1 e 1979, vol. 2, Academic Press, New York); and steady state fluorescence spectroscopy, as melatonin is a fluorescence molecule. The phospholipids used (in liposomes and unilamelars vesicles) were mainly DMPG (dimiristoyl phosphatidyl choline) and DMPC (dimiristoyil phosphatidyl choline). The EPR signals were analized through the calculations of rotational correlation times prependicular (R) and paralel (R) to the molecule principal axis of rotation (Marsh, in Biological Magnetic Resonance, 255-303, and Bales, in Biological Magnetic Resonance, 77-130, Berliner & Reuben editors, 1989, vol. 8, Plenum Publishing, New York), efective order parameter (Sef) and 2Amáx parameter (Griffth e Jost, in Spin Labeling, 454-523, Berliner, L.J. editor, 1976, vol. 1, Academic Press, New York). The experimental results show that the melatonin: a) contrarily to the literature beliefs, is soluble in aqueous medium up to the concentration of 5mM, and a new solubility method is presented; b) interacts with lipid membranes, near the polar head group, changing bilayer structure. The hormone displays a stronger interaction with the negatively charged phospholipid (DMPG) than with the zwitterionic one (DMPC), as detected by both EPR and fluorescence techniques. As melatonin is a non charged molecule, that difference is discussed in terms of the lipids different packing (or degree of \"fluidity\"). c) increases DMPG membrane \"fluidity\", both above and below the lipid phase transition temperature (Tf). The changes on the packing of the lipids are mainly seen by the spin label SSL (4-stereamine-1 oxyl-2,2,2,6,6-tetrametyl piperidine), which monitors the lipid polar head region. Above Tf, melatonin decrease SSL R ; and below Tf, the decrease in \"fluidity\" is monitored via a decrease in the SSL EPR spectrum line width. The spin labels 5-SASL (5-doxyl stearic acid) and 6-DPPC (1-palmitoyl-2-(6-doxyl-stearic acid) phosphatidyl choline), which monitor the hydrocarbon chain region close to the membrane polar head group, show no change in the spectra parameters for temperatures above Tf. Below Tf, a decrease on 2Amax with the presence of melatonin is an indication of the hormone effect. The center of the bilayer is apparently not affected by the hormone as no change in the EPR spectrum of 12-SASL (12-doxyl-stearic acid) is detected, both above and below the lipid phase temperature. The melatonin partition coefficiente in lipid membranes was determined through EPR (Lissi et al., 1990, Biochem. Biophys. Acta, 1021: 46-50) and fluorescence (Tabak and Borisevith, 1992, Biochem. Biophys. Acta, 1116: 241-249) data, and found to be 30 and 1090, respectively. The different values obtained with the distinct methods are discussed. The results presented here, showing that melatonin is highly soluble in aqueous medium, through it can interact with lipid membranes, will certainly have consequences on the current biological discussions on the need of a melatonin-carrier in the blood stream or the mechanism that makes the hormone to cross the cell membrane and interact at the nucleus (Tan e col, 1993, Cancer Letters, 70: 65- 71).

Nesta tese, apresentamos três estudos envolvendo técnicas de ressonância paramagnética eletrônica (RPE) de onda contínua e pulsada nas bandas X e Q em vidros e nanocompósitos dopados com íons de metais de transição. O objetivo geral deste texto é evidenciar a complementariedade destas técnicas no estudo destes materiais. Os dois primeiros estudos focam-se em vidros e vitro-cerâmicas dopados com íons de metais de transição. O objetivo destes estudos é analisar o efeito dos tratamentos térmicos no espectro de RPE das amostras. O primeiro estudo trata de vidros fosfo-germanato dopados com íons de vanádio e os resultados de RPE de onda contínua mostram que, para a amostra sem tratamento térmico e para a amostra tratada em temperaturas menores do que 470 °C, apenas um sítio de vanádio é observado enquanto que, para as amostras tratadas com temperaturas acima de 470 °C, um segundo sítio de vanádio, mais distorcido do que anterior, aparece. Experimentos de ESEEM e HYSCORE observaram a interação entre os íons de vanádio e núcleos 31P próximos e pudemos estimar a máxima densidade de spin transferida pelo mecanismo through-bond e máxima distância média entre o íon paramagnético e os núcleos 31P. O segundo estudo trata de um vidro fluorosilicato dopado com íons Cu2+ e os resultados de RPE de onda contínua não mostram alterações relevantes no sítio paramagnético devido ao tratamento térmico. Experimentos de ESEEM e HYSCORE mostraram picos devido a interação desse íon com núcleos 19F, 207Pb, 111Cd e 113Cd. O terceiro estudo foca-se numa argila natural laminar contendo íons Cu2+ e moléculas de polioxietileno (PEO). O objetivo deste estudo é analisar a complexação do íon Cu2+ com as moléculas de PEO e moléculas de água no espaço interlaminar da argila. Os resultados de RPE de onda contínua não evidenciaram alterações na coordenação do íon Cu2+ através dos dois métodos de preparação propostos. Os experimentos de ESEEM E HYSCORE mostraram que, para o método onde o complexo PEO-Cu é inserido no espaço interlaminar da argila, o íon Cu2+ interage apenas com prótons em, pelo menos, duas conformações diferentes. Nossa hipótese é que observamos prótons tanto da molécula de PEO quanto de moléculas de água. No método onde moléculas de PEO são inseridas no espaço interlaminar da argila previamente preenchido com íons Cu2+, tal hipótese não pode ser feita. Ainda, observamos outro centro paramagnético nas amostras oriundo de vacâncias de oxigênio nas lâminas da argila. / This thesis contains three studies where X- and Q-Band continous-wave electron paramagnetic resonance (CW-EPR) and pulsed EPR techniques were applied in glasses and nanocomposites doped with transition metal ions. Our general goal is to show the complementarity of these techniques for the study of this materials. The first two studies focus on glasses and glass-ceramics doped with transition metal ions and the main goal is to analyse the effect of sample heat treatments on the EPR spectra. The first study focuses on phospho-germanate glasses and the CW-EPR results show that, for non-treated samples or for heat-treated samples at temperatures below 470°C, only one vanadium site is observed, while for samples heat-treated at higher temperatures a second, more ditorted site is produced. ESEEM and HYSCORE experiments observe the interaction between vanadium ions and near 31P nuclei. The maximum spin density transfer by the through-bond mechanism and maximum average distance between the two species could be estimanted. The second study focuses on fluorosilicate glasses doped with Cu2+ and the CW-EPR results show no relevant changes in the paramagnetic site upon heat treatment. ESEEM and HYSCORE experiments display peaks due to the interaction between Cu2+ ions and 19F, 207Pb, 111Cd e 113Cd nuclei. The third study focus on a natural bentonite clay containing copper ions and polioxiethilene (PEO) molecules. The main goal of this study is to analyze the complexation of the Cu2+ ions with the PEO and water molecules in the interlaminar space of the clays. CW-EPR results does not show any changes in the Cu2+ coordination caused by the two preparation methods proposed. ESEEM and HYSCORE experiments, however, showed that, for the method where the PEO-Cu complex is inserted in the interlaminar space, the paramagnetic ion interacts only with protons in at least two different conformations. Our hypothesis is that both protons from the PEO chain and water molecules are being observed. In the method where PEO molecules are inserted in the material, which was previosly filled with Cu2+ ions, no such assignment could be made. In addition, another paramagnetic center is observed and associated with oxigen vacancies in the sheets of the clay.

Intracellular protein-protein interactions (PPIs) play a vital role in many biological processes. Although they are viewed as of high biological interest they prove difficult to explore as potential targets for drug discovery. Numerous studies have shown α- helical peptides 'locked' in their respective bioactive structure can greatly increase their performance by increasing their target affinity, resistance to proteolysis as well as facilitating cellular uptake. A striking feature of literature to date is how few studies utilise different stapling techniques when developing inhibitors for PPIs. Current methods generally exploit ruthenium catalysed ring closing metathesis (RCM) or copper catalysed alkyne/azide click (CuAAC) chemistry to generate geometrically constrained peptides. Even though these methods have shown great potential they both share a fundamental limitation as the chemistry can only be employed on small synthetic peptides and cannot be extended to larger proteins. Thiol-ene coupling (TEC) chemistry (Chapter 1) which is often described as a 'click' reaction due to its fast reaction rates, high yields, wide functional group tolerance and insensitivity to ambient oxygen and water has the potential to solve this challenge. Thiol-ene chemistry was investigated as an alternative stapling strategy by employing the naturally occurring amino acid L-cysteine (Cys) as a source of the thiyl radical and L-homoallylglycine (Hag), a non-natural amino acid shown to act as a methionine surrogate in protein synthesis to act as a source of an alkene functionality to form a potentially expressible thioether tether in Chapter 2. However, due to unsatisfactory results from the intramolecular thiol-ene cyclisation at the molar concentrations required for peptide or protein modification, and a promising new lead, the closely related thiol-yne reaction was investigated as an alternative in Chapter 3. Using a small library of peptides (14 mers) derived from α-Synuclein (αSyn), a protein mainly found in the presynaptic terminals in the brain and is believed to be key to the pathological progress of Parkinson's disease, a successful macrocyclisation was achieved between the side chains of cysteine (Cys) and homopropargylglycine (Hpg). Although the vinyl-thioether tether did not confer any helical conformation on the stapled peptides, the results clearly demonstrate a potential route for the development of expressible staples. Electron paramagnetic resonance (EPR) spectroscopy in combination with site-directed spin labelling (SDSL) of biomolecules has become a powerful tool for studying the structure and conformational dynamics of biomolecules. Typically, proteins are modified in a site-specific manner by utilising the side chains of cysteine residues to form disulphide bonds with spin active compounds, however, this strategy has its limitations. In Chapter 3 thiol-ene chemistry was investigated as an alternative biorthogonal method to spin label proteins and peptides. The newly synthesised sulfhydryl bearing nitroxide spin label was found to degrade upon exposure to radical promoting conditions, however, an alternative strategy was explored using more classical thiol-Michael chemistry to spin label dehydroalanine (Dha) modified peptides giving the desired spin labelled complex.

A melatonina (N-acetil 5-metoxi-triptamina) é um hormônio derivado do amino-ácido triptofano, secretado pela glândula pineal, estando relacionado com importantes processos biológicos e farmacológicos. O seu mecanismo de ação não é bem conhecido, entretanto é sabido que a melatonina não tem uma ação específica, podendo interagir com diversos tipos de células (Reitel, 1992, Bioessays, 14: 169-175), sugerindo que possa não existir um tecido ou célula-alvo específica, na qual a melatonina exerça a sua ação hormonal. Assim, é possível que a melatonina não interaja através de um receptor proteico específico de membrana e possa interagir com a célula via a fase lipídica membranar. O presente trabalho estuda a interação de melatonina com membranas lipídicas por espectroscopia de RPE (ressonância paramagnética eletrônica), utilizando o método do marcador de spin (Swartz, Bolton e Borg editores, Biological Applications of Electron Spin Resonance, 1972, Willey-Interscience, New York; Berliner, L.J. editor, Spin Labeling, 1976 (vol. 1) e 1979 (vol. 2), Academic Press, New York); e espectroscopia de fluorescência estática, pois a melatonina é uma molécula fluorescente. Os fosfolipídios utilizados nos sistemas modelo de membrana (lipossomos e vesículas unilamelares) foram principalmente o DMPG (dimiristoil fosfatidil glicerol) e DMPC (dimiristoil fosfatidil colina). Os sistemas estudados por RPE foram analisados por meio de medidas dos tempos de correlação rotacional perpendicular (R) e paralelo (R) ao eixo principal de rotação do radical nitróxido (Marsh, em Biological Magnetic Resonance, 255-303, e Bales, em Biological Magnetic Resonance, 77-130, editores Berliner e Reuben, 1989, vol. 8, Plenum Publishing, New York), parâmetro de ordem efetivo (Sef) e do parâmetro 2Amáx (Griffth e Jost, em Spin Labeling, 454- 523,editor Berliner, 1976, vol. 1, Academic Press, New York). Os resultados experimentais mostram que a melatonina: a) é solúvel em meio aquoso até a concentração de 5mM, ao contrário do que está na literatura, tendo sido desenvolvido um novo método para solubilizá-la; b) interage com membranas lipídicas provocando mudanças estruturais nas membranas. Esta interação ocorre próxima à região da cabeça polar, detectada pelos marcadores de spin utilizados, que monitoram diferentes regiões da bicamada lipídica; e pela fluorescência, que mostra que a melatonina não apresenta um deslocamento do máximo de emissão na presença de vesículas de DMPG ou DMPC; c) interage mais fortemente com membranas lipídicas de fosfolipídio com cabeça polar carregada negativamente (DMPG), do que de fosfolipídio com carga líquida igual a zero (DMPC). Este resultado mostrado tanto por RPE quanto por fluorescência. Essa diferença é discutida em termos da estrutura das membranas, através dos parâmetros R, Sef e 2Amáx, que descrevem descreve o grau de \"fluidez\" da bicamada; d) em membranas de DMPG, torna mais \"fluida\" na região da cabeça polar dos fosfolipídios da bicamada lipídica, tanto abaixo como acima da temperatura de transição de fase (Tf) das mesmas. A alteração da \"fluidez\" ocorre nesta região da bicamada, pois os marcadores de spin utilizados mostram que: i) O SSL (4-estereamida-1-oxil-2,2,6,6-tetrametil piperidina), que monitora a região da cabeça polar, acima da Tf , mostra que a presença de melatonina em DMPG provoca a diminuição de R; e abaixo da Tf, não é possível o cálculo do tempo de correlação rotacional, entretanto o efeito da melatonina é observado através da diminuição das larguras de linha do espectro. ii) O 5-SASL (5-doxil ácido esteárico) e 6-DPPC (1-palmitioil-2-(6-doxil ácido esteárico) fosfatidil colina), que monitoram uma região da cadeia de hidrocarbonetos ainda próxima à região da cabeça polar, mostram que nesta região, acima da Tf, a presença de melatonina não provoca alterações significativas na estrutura de bicamadas de DMPG ou DMPC; e abaixo da Tf, a presença da melatonina \"fluidifica\" a membrana provocando uma diminuição do parâmetro 2Amáx, somente em DMPG. iii) O 12-SASL (12-doxil ácido esteárico) que monitora principalmente uma região próxima ao final da cadeia, não mostra alterações em seu espectro com a presença da melatonina; e) por interagir com membranas lipídicas, pôde ter o seu coeficiente de partição determinado por medidas de RPE e fluorescência. Os coeficientes foram determinados por métodos diferentes. Por RPE foi baseado em Lissi e col. (1990, Biochem. Biophys. Acta, 1021: 46-50) e o por fluorescência foi baseado em Tabak e Borisevith (1992, Biochem. Biophys. Acta, 1116: 241-249). Os coeficientes determinados apresentaram uma grande discrepância, sendo baixo para RPE (P=30) e alto para fluorescência (P=1090), provavelmente devido à técnica utilizada, assunto que é discutido no trabalho. Os resultados de RPE e fluorescência, citados acima, confirmando que a melatonina interage com membranas lipidíca, associado ao fato de que a melatonina é bastante solúvel em meio aquoso, têm algumas implicações de cunho biológico que abrem a discussão sobre questões como a necessidade de um carregador do hormônio no plasma sanguíneo ou o mecanismo que leva o hormônio a atravessar a membrana plasmática e interagir no núcleo da célula (Tan e col, 1993, Cancer Letters, 70: 65-71). / Melatonin (N-acetyl 5-methoxy-tryptamine), a tryptophan derivative hormone, is the main product of secretion by pineal gland. It has been related with important biological and pharmacological processes, although its mechanism of action is not well known. Melatonin is known to interact with different types of cells, playing different roles (Reitel, 1992, Bioessays, 14: 169-175), suggesting that the molecule does not interact through a specific membrane protein receptor in a specific cell, and could possibly interact with the cell through its membrane lipid phase. The present work studies the melatonin interaction with model lipid membrane using EPR (Eletronic Paramagnetic Resonance) spectroscopy, using the spin label method (Swartz, Bolton e Borg editors, Biological Applications of Electron Spin Resonance, 1972, Willey-Interscience, New York; Berliner, L.J. editor, Spin Labeling, 1976, vol. 1 e 1979, vol. 2, Academic Press, New York); and steady state fluorescence spectroscopy, as melatonin is a fluorescence molecule. The phospholipids used (in liposomes and unilamelars vesicles) were mainly DMPG (dimiristoyl phosphatidyl choline) and DMPC (dimiristoyil phosphatidyl choline). The EPR signals were analized through the calculations of rotational correlation times prependicular (R) and paralel (R) to the molecule principal axis of rotation (Marsh, in Biological Magnetic Resonance, 255-303, and Bales, in Biological Magnetic Resonance, 77-130, Berliner & Reuben editors, 1989, vol. 8, Plenum Publishing, New York), efective order parameter (Sef) and 2Amáx parameter (Griffth e Jost, in Spin Labeling, 454-523, Berliner, L.J. editor, 1976, vol. 1, Academic Press, New York). The experimental results show that the melatonin: a) contrarily to the literature beliefs, is soluble in aqueous medium up to the concentration of 5mM, and a new solubility method is presented; b) interacts with lipid membranes, near the polar head group, changing bilayer structure. The hormone displays a stronger interaction with the negatively charged phospholipid (DMPG) than with the zwitterionic one (DMPC), as detected by both EPR and fluorescence techniques. As melatonin is a non charged molecule, that difference is discussed in terms of the lipids different packing (or degree of \"fluidity\"). c) increases DMPG membrane \"fluidity\", both above and below the lipid phase transition temperature (Tf). The changes on the packing of the lipids are mainly seen by the spin label SSL (4-stereamine-1 oxyl-2,2,2,6,6-tetrametyl piperidine), which monitors the lipid polar head region. Above Tf, melatonin decrease SSL R ; and below Tf, the decrease in \"fluidity\" is monitored via a decrease in the SSL EPR spectrum line width. The spin labels 5-SASL (5-doxyl stearic acid) and 6-DPPC (1-palmitoyl-2-(6-doxyl-stearic acid) phosphatidyl choline), which monitor the hydrocarbon chain region close to the membrane polar head group, show no change in the spectra parameters for temperatures above Tf. Below Tf, a decrease on 2Amax with the presence of melatonin is an indication of the hormone effect. The center of the bilayer is apparently not affected by the hormone as no change in the EPR spectrum of 12-SASL (12-doxyl-stearic acid) is detected, both above and below the lipid phase temperature. The melatonin partition coefficiente in lipid membranes was determined through EPR (Lissi et al., 1990, Biochem. Biophys. Acta, 1021: 46-50) and fluorescence (Tabak and Borisevith, 1992, Biochem. Biophys. Acta, 1116: 241-249) data, and found to be 30 and 1090, respectively. The different values obtained with the distinct methods are discussed. The results presented here, showing that melatonin is highly soluble in aqueous medium, through it can interact with lipid membranes, will certainly have consequences on the current biological discussions on the need of a melatonin-carrier in the blood stream or the mechanism that makes the hormone to cross the cell membrane and interact at the nucleus (Tan e col, 1993, Cancer Letters, 70: 65- 71).

Espectros de Ressonância Paramagnética Eletrônica de Ni POT. 2+ diluídos em monocristais de Zn(FB IND 4)IND 2 6 H IND 2O foram registrados na banda X, entre 77 e 300 K. Os cristais foram crescidos nas concentrações de Ni POT 2+ de 0,5; 0,8; 1,5, 3,9. 5; 15; 33; 53; 75 78; 85; 88; 92; 98 e 100%. Desenvolvemos um método de medi da de concentração de Ni POT 2+, por espectrofotometria, para a determinação da concentração real, pois verificamos que nos cristais a proporção de Ni POT 2 + é sempre maior que na solução utilizada para o crescimento . Do espectro, obtivemos a largura da 2ª linha do níquel, H IND z2 e verificamos que na região de temperaturas altas a largura de linha, para todas as concentrações, obedece à lei H IND ms = a + bT POT 2. O primeiro termo varia com a concentração, por representar a contribuição da interação spin-spin e o termo bT POT 2, que é a contribuição da relaxação spin- rede, mantém-se praticamente constante com a concentração, como era de se esperar. As análises dos espectros indicaram que eles resultam da superposição de várias linhas e, para compreendermos as estruturas do espectro aplicamos , pela primeira vez , um modelo teórico que denominamos Modelo de Pares. Tal aplicação nos permitiu redeterminar, tanto os parâmetros da Hamiltoniana de Spin, D e g, quanto as larguras de linha das linhas componentes. Com a largura de linha das linhas componentes desta estrutura, pudemos obter os parâmetros de interação spin- spin, a. A aplicação do Modelo de Pares indica que a contribuição da interação spin- spin é de natureza basicamente dipolar. A análise geral dos dados experimentais mostra que os resultados experimentais obtidos concordam com os modelos teóricos existentes. / Electron Paramagnetic Resonance (EPR) spectra of Ni 2+ diluted in single crystals of Zn(BF4) 26H2O were obtained in the X- band between 77 and 300 K. Samples were grown with Ni2+ concentrations of 0.5; 0.8; 1,5; 3.9 ; 5; 15; 33; 53; 75; 78; 85; 88; 92; 98 and 100%. These values were determined by an optical absorption method developped for the present work . Analysis of the maximum slope line width of the second line (Hz2) has been shown that it obeys the H = a + bT2 law. The a parameter which is associated with the spin-spin interaction changes with concentration while the coefficient of the quadratic term bT which represents the spin-latice relaxation contribution remains, pratically, the same for all the specimens. Careful analysis of thermal and concentration variations of the spectra indicated that they are formed by superposition of several lines. The structure of these lines was studied applying, for the first time, a theoretical model considering interacting pairs of magnetic ions. This model enabled us to determine the D and g spin Hamiltonian parameters, and the individual line whidth which gave the nature of the spin- spin interact i on basically of dipolar origin. Finally we concluded that our experimental results agree with available theoretical models.

Na maioria dos vertebrados o tridecapeptídeo alfa-MSH (hormônio estimulante do melanócito) é um hormônio fisiologicamente relevante na regulação da pigmentação da pele, causando escurecimento (Sawyer, et al., 1980; Jiang et al., 1995). O alfa-MSH também está envolvido em muitas outras funções, como crescimento fetal e comportamento (Castrucci, et al., 1990). No presente trabalho foi estudada a interação entre peptídeos melanotrópicos e membranas lipídicas sob as perspectivas da perturbação da fase lipídica e das modificações conformacionais dos peptídeos. Foram usados: dois tipos de vesículas (aniônica de DMPG - dimiristoil fosfatidil glicerol - e neutra de DMPC - dimiristoil fosfatidil colina) e dois peptídeos melanotrópicos (alfa-MSH e o análogo que apresenta maior atividade biológica, [Nle POT.4, D-Phe POT.7]-alfa-MSH (MSH-I). Por meio de ressonância paramagnética eletrônica (RPE) foram observadas alterações estruturais dos lipídios causadas pela interação dos peptídeos com a membrana aniônica. Todos os marcadores de spin usados, derivados do ácido esteárico, fosfolipídicos e derivado do colesterol, incorporados em vesículas de DMPG, na fase líquido-cristal, indicaram que os dois peptídeos induzem um decréscimo no movimento e/ou aumento da ordem das cadeias acilas, em todas as posições monitoradas. O efeito do análogo sobre os parâmetros dos espectros de RPE dos marcadores de spin foi mais evidente, e isto estaria indicando que penetra mais fundo na matriz lipídica. A dependência com o sal da interação peptídeo-lipídio demonstra que a atração eletrostática dos peptídeos carregados positivamente com as cabeças polares dos lipídios aniônicos foi necessária para uma efetiva associação dos peptídeos com a bicamada fosfolipídica. A necessidade da interação eletrostática também foi observada pela não-interação dos peptídeos com bicamadas neutras de DMPC. No desenvolvimento do trabalho foi calculado ) o coeficiente de partição baseado no efeito que estes peptídeos causam no espectro de RPE dos marcadores de spin intercalados na membrana. O coeficiente de partição obtido para peptídeo análogo, mais potente biologicamente, foi cerca de quatro vezes maior do que para o hormônio nativo. Para uma mesma concentração de peptídeo ligado à membrana, foi observado que o efeito do MSH-I sobre a estrutura da membrana é um pouco maior do que do alfa-MSH, o que estaria de acordo com uma possível penetração mais fundo na bicamada. Os espectros de dicroísmo circular (CD) em solução aquosa e no solvente indutor de alfa-hélice, o 2.2.2-trifluoroetanol (TFE) mostraram que os dois peptídeos têm estrutura um pouco diferentes em solução, embora apresentem mudanças conformacionais similares quando na presença de vesículas ou micelas carregadas negativamente. O maior efeito causado pelo análogo mais potente na estrutura da bicamada, quando comparado ao hormônio nativo, é discutido em termos de sua maior constante de associação e possibilidade de maior penetração na bicamada. Estes resultados estariam relacionados com a maior atividade e/ou prolongada ação do peptídeo análogo. / In most vertebrates the tridecapeptide -melanocyte stimulating hormone (-MSH) is physiologically relevant hormone regulating skin pigmentation, causing darkening (Sawyer, et al., 1980; Jiang et al., 1995). -MSH is also involved in many other biological functions, such as fetal growth and behavior (Castrucci, et all., 1990). The present work studies the interaction of -MSH and the biologically more active analog [Ne4, Dphe7]- -MSH with lipid vesicles by spin label electron spin resonance (Esr) spectroscopy and circular dichroism (CD). All spin labels used here, stearic acid, phospholipid and cholestane derivative labels, incorporated into anionic vesicles of DMPG (1,2-dimyritoyl-sn-glycero-3-phophoglycerol) in the liquid-cristiline phase, indicated that both peptides decrease the motional freedom of the acyl chains, at all monitored positions. The effect of the analog on the spin label ESR parameters was much more evident, and could indicate its farthest penetration into the lipid matrix. The salt dependence of the peptide- lipid interaction demonstrated that the electrostatic attraction of the positively charged residues of the peptides by the PG headgroups was necessary for an effective association of the peptides with phospholipid bilayers. The perturbation caused by the peptides on the lipid chain mobility was reduced as the ionic strength increased. Above 300 mM NaCl no perturbation could be detected. The electrostatic requirement was further evidenced by the absence of detectable binding of peptides to neutral lipid bilayers. Lipid partition coefficients were calculated based on the effect the peptides cause on the ESR spectra of spin labels incorporated in the membrane. For the biologically more potent peptide, the partition coefficient was found to be about 4-times greater than that of the native hormone. For the same concentration of the peptide bound to the membrane, MSH-I was found to cause a slightly greater effect on the membrane structure than -MSH, in accord with its possible deeper penetration into the bilayer. Cd spectra in aqueous solution and in the -helix inducing solvent 2.2.2-trifluoroethanol (TFE) showed that the two peptides have somewhat different structures in solution, though similar conformational changes occur in both peptides as a result of their interaction with negatively charged vesicles or micelles. The stronger effect caused by the more potent analog in the membrane structure, when compared to the native hormone, is discussed in terms of the higher peptide-lipid association constant and the possible deeper penetration into lipid bilayers. The results could be related to its greater activity and/or prolonged action of the peptide analog.

Espectros de Ressonância Paramagnética Eletrônica de Ni POT. 2+ diluídos em monocristais de Zn(FB IND 4)IND 2 6 H IND 2O foram registrados na banda X, entre 77 e 300 K. Os cristais foram crescidos nas concentrações de Ni POT 2+ de 0,5; 0,8; 1,5, 3,9. 5; 15; 33; 53; 75 78; 85; 88; 92; 98 e 100%. Desenvolvemos um método de medi da de concentração de Ni POT 2+, por espectrofotometria, para a determinação da concentração real, pois verificamos que nos cristais a proporção de Ni POT 2 + é sempre maior que na solução utilizada para o crescimento . Do espectro, obtivemos a largura da 2ª linha do níquel, H IND z2 e verificamos que na região de temperaturas altas a largura de linha, para todas as concentrações, obedece à lei H IND ms = a + bT POT 2. O primeiro termo varia com a concentração, por representar a contribuição da interação spin-spin e o termo bT POT 2, que é a contribuição da relaxação spin- rede, mantém-se praticamente constante com a concentração, como era de se esperar. As análises dos espectros indicaram que eles resultam da superposição de várias linhas e, para compreendermos as estruturas do espectro aplicamos , pela primeira vez , um modelo teórico que denominamos Modelo de Pares. Tal aplicação nos permitiu redeterminar, tanto os parâmetros da Hamiltoniana de Spin, D e g, quanto as larguras de linha das linhas componentes. Com a largura de linha das linhas componentes desta estrutura, pudemos obter os parâmetros de interação spin- spin, a. A aplicação do Modelo de Pares indica que a contribuição da interação spin- spin é de natureza basicamente dipolar. A análise geral dos dados experimentais mostra que os resultados experimentais obtidos concordam com os modelos teóricos existentes. / Electron Paramagnetic Resonance (EPR) spectra of Ni 2+ diluted in single crystals of Zn(BF4) 26H2O were obtained in the X- band between 77 and 300 K. Samples were grown with Ni2+ concentrations of 0.5; 0.8; 1,5; 3.9 ; 5; 15; 33; 53; 75; 78; 85; 88; 92; 98 and 100%. These values were determined by an optical absorption method developped for the present work . Analysis of the maximum slope line width of the second line (Hz2) has been shown that it obeys the H = a + bT2 law. The a parameter which is associated with the spin-spin interaction changes with concentration while the coefficient of the quadratic term bT which represents the spin-latice relaxation contribution remains, pratically, the same for all the specimens. Careful analysis of thermal and concentration variations of the spectra indicated that they are formed by superposition of several lines. The structure of these lines was studied applying, for the first time, a theoretical model considering interacting pairs of magnetic ions. This model enabled us to determine the D and g spin Hamiltonian parameters, and the individual line whidth which gave the nature of the spin- spin interact i on basically of dipolar origin. Finally we concluded that our experimental results agree with available theoretical models.

<p>In natural oxygen-producing photosynthesis solar energy is stored as chemical energy, in carbohydrates, fats and amino acids, using water as electron source. The large transmembrane protein complex, PSII, is the key enzyme in the light-driven reactions. Water oxidation is accomplished by a triad in PSII in which the Mn-cluster plays an important role. In the artificial photosynthetic system, nature’s photosynthesis will be mimicked such that hydrogen, a sustainable energy source, can be produced from solar energy and water alone. Since water oxidiation requires the catalytic activity of a Mn-cluster in photosynthesis, different artificially constructed manganese complexes are investigated. </p><p>The dinuclear ([Mn₂(II,III)L(µ-OAc)₂]ClO₄), where L is the X-anion of 2-(<i>N,N</i>-Bis(2-methylpyridyl)aminomethyl)-6-(<i>N</i>-(3,5-ditert-butylbenzyl-2-hydroxy)-<i>N</i>-(pyridylmethyl)aminomethyl)-4-methylphenol, an unsymmetric ligand with two coordinating phenolate groups, has been studied. The two Mn-ions are linked via a mono-µ-oxo bridge and two acetate ligands. Q-band Electron Paramagnetic Resonance was conducted on the Unsymmetric Mn₂(II,III) Complex. Aquired results show that the complex has a 2600 Gauss broad signal (11 400-14 000 Gauss) with 14-17 lines at g~2 and hyperfines of 120 Gauss. This is consistent with previous X-band studies. Q-band spectra of the Unsymmetric Mn(II,III) display increased hyperfine resolution compared to Qband spectra of the symmetric complex, Mn₂(bpmp)(µ-OAC)₂. This is noticeable since Unsymmetric Mn2(II,III) and Mn₂ (bpmp)(µ-OAC)₂ partly overlap in low-frequency experiments (X-band EPR). </p><p>Further investigations are yet to be expected. Nevertheless, the conducted thesis study provides important knowledge in the futuristic goal of building an artificial super-complex.</p>