Durant ces dernières décennies, les sources électromagnétiques se sont multipliées : l’exposition quotidienne de l’homme s’en est retrouvée considérablement accrue. L’étude des effets des champs sur l’organisme passe par une meilleure compréhension des phénomènes à l’échelle de la cellule, unité de base de l’être vivant. Nos objectifs dans le cadre de ce travail portent sur la caractérisation électrique des cellules et, plus précisément, des deux principaux compartiments cellulaires que représentent le cytoplasme et la membrane. A terme, l’objectif est de fournir les permittivités et conductivités de ces couches afin de renseigner les modèles qui seront utilisés pour la simulation de l’interaction champ-vivant. Lorsqu’une cellule est placée dans un champ électrique tournant (généré par des microélectrodes), elle tourne sur elle-même sous l’effet de polarisation des cellules : c’est le principe de l’électrorotation. Le sens et la vitesse de rotation dépendent des propriétés cellulaires et de la fréquence du champ. La mise au point d’une plateforme expérimentale dédiée et automatisée (génération du champ, acquisition et traitement des images, extraction des propriétés) a permis d’accéder aux propriétés électriques des différentes couches sur des levures et des liposomes à travers le tracé du spectre d’électrorotation. Plusieurs études ont permis de valider le fonctionnement de cette plateforme et d’évaluer l’impact des traitements thermique et enzymatique sur des levures ainsi que l’influence de la composition du milieu interne sur le spectre d’électrorotation de liposomes. Par ailleurs,une étude théorique portant sur l’identification paramétrique a montré qu’il est possible d’améliorer l’extraction de certains paramètres en se basant sur une analyse de sensibilité du spectre d’électrorotation à ces paramètres. La mise en place récente d’une salle de culture va permettre d’explorer une gamme plus large de cellules vivantes et d’étudier les effets de sources de champ magnétique sur celles-ci. / No abstract

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The field of sample enrichment is currently receiving a large amount of attention because it is essential to reduce the time required for many laboratory processes. Dielectrophoresis, or the motion of a polarized particle in the presence of a non-uniform electric field, has emerged as a promising method for biological sample concentration. By relying upon electrical properties that are intrinsic to a cell or microparticle, dielectrophoretic concentration avoids the need for sample preparation procedures which can greatly reduce the throughput of a system. Contactless Dielectrophoresis (cDEP) is a promising manifestation of dielectrophoresis in which the electrode structures that provide the non-uniform electric field are physically separated from the sample by a thin dielectric barrier. This work presents two methods for providing the high-voltage and high-frequency signal necessary to generate a non-uniform electric field in the sample channel of a cDEP device. The first method, an oscillator-based system, was able to produce DEP trapping and pearl-chaining of THP-1 and MCF-7 breast cancer cells in a cDEP device. The second method presented here utilizes an amplifier and transformer combination to generate very high voltages over a wide range of frequencies. Finally, electrorotation, or the spin imparted to a particle due to a rotating electric field has proven to be an extremely useful analysis of a cell's dielectric properties. A wideband, computer controlled function generator, outputting four sinusoidal waveforms in quadrature is presented. This device was able to produce outputs with the proper alignment over the range of 10 Hz to 100MHz. / Master of Science

Cloning by nuclear transfer using mammalian somatic cells has enormous potential application. However, cloning mammalian species through somatic cell nuclear transfer has been simply inefficient in all species in which live clones have been produced, such as ‘Dolly’ the sheep, and ‘Samrupa’ the buffalo. Most of the experiments resulted failure, and the success rate ranges from 0.1% to 3%. Developmental defects have been attributed to incomplete reprogramming of the somatic nuclei by the cloning process. Researchers have tried strategies to improve the efficiency of nuclear transfer. However, significant breakthroughs are yet to happen. The enucleation procedure consisting of extracting reprogrammable genetic material during nuclear transfer has been linked to inefficiencies due to manual error, lack of repeatability and decreased high throughput. Conventional manual enucleation process requires a series of complicated cell rotation in three-dimensional (3D) spaces using a blunt or sharp tipped pipette, and can puncture the cell during genetic material extraction. Current methods frequently damage the cell via physical or chemical contact, and thus have low throughput. Therefore, there is a need for simple, readily automated, non-contact methods for controlled cell rotation. Precise rotation of the suspended cells is one of the many fundamental manipulations in a wide range of biotechnological applications, such as cell injection and enucleation. Noticeably scarce from the existing rotation techniques is 3D rotation of cells on one single chip. To bridge this gap, this research presents a means of controlled cell rotation for bovine oocytes around both the in-plane (yaw) and out-of-plane (pitch) axes using a simple, low cost biochip fabricated using a mixture of conventional lithography and low-cost micro-milling. It uses a phase varying dielectrophoresis (DEP)-based electrorotation (EROT) biochip platform, which has an open-top sub-millimetre square chamber enclosed by four sidewall electrodes and two bottom electrodes to induce torque to rotate the cells about two axes, thus 3D cell rotation for the first time. Before fabrication, phase varying DEP-based rotational electric field simulations were carried out in the designed rotation chamber. For this analysis, initial rotational fields are characterised for both in-plane and out-of-plane axes using multi-physics finite element software. Electrode shape and chamber design were optimised using realistic parameters for the medium and electrode material properties. Results showed remarkable promise to rotate dielectric particles in rotational field strengths of the order of 104 V/m. From simulations, a basic biochip design was optimised. Within the fabricated biochip, controlled rotations around the in-plane and out-of-plane axes were demonstrated, and the electric field activation frequency range and electrokinetic properties of the bovine oocytes were characterised. Rotation was measured via video image processing with data included on electronic annex. Results show controllable rotation in steps of 5 degrees around both axes with the same chip. In experiments, the maximum rotation rate reached 150°/s in yaw axis and 45-50°/s during pitch axis, while a smooth, stable and controllable rotation rate was found below 30-40°/s. Optimum rotation rates are found for inputs of 10 Vp-p at 500-800 kHz AC frequency for yaw-axis rotation, and 10-20 Vp-p and 10-100 kHz for pitch-axis rotation. In addition, zona intact and zona free oocytes are shown to have electrical equivalence and found no noticeable difference, generalising the bio-chips capability and results. Further, experimental results were used to validate the numerical solid shell model used in design and it was found that the bovine oocytes are highly polarizable than the surrounding medium. Finally, the dielectric properties of the oocytes were fully characterised enabling further design optimization in future, if desired. The biochip was successfully designed, optimised and experimentally validated, and successful rotation of bovine oocytes in 3D spaces was demonstrated. These results create a platform tool for biologists to utilise enucleation with high throughput efficiency and ease. In summary, this simple, transparent, low-cost, open-top, and biocompatible biochip platform, allows further function modules to be integrated and is the foundation for more powerful cell manipulation systems. In brief key novel aspects of the research were: • Rotation of suspended spherical oocytes in multiple axes (3D rotation) was obtained by AC induced electric fields. • An open top biochip was successfully fabricated to enable further processing of the rotated cell in 3D spaces. • Bovine oocyte dielectric spectra were analysed in both in-plane and out-of-plane axes for the first time. • Bovine oocytes were determined to behave as solid spherical spheres, rather than single spherical shells.

abstract: Due to heterogeneity at the cellular level, single cell analysis (SCA) has become a necessity to study cellomics for the early detection of diseases like cancer. Development of single cell manipulation systems is very critical for performing SCA. In this thesis, electrorotation (ROT) chips to trap and rotate single cells using electrokinetic forces have been developed. The ROT chip mainly consists of a set of closely spaced metal electrodes (60µm interspacing between opposite electrodes) that forms a closed electric field cage (electrocage) when driven with high frequency AC voltages. Cells were flowed through a microchannel to the electrocage where they could be precisely trapped, levitated and rotated in 3-D along the axis of interest. The dielectrophoresis based ROT chip design and relevant electrokinetic effects have been simulated using COMSOL 3.4 to optimize the design parameters. Also, various semiconductor technology fabrication process steps have been developed and optimized for better yield and repeatability in the manufacture of the ROT chip. The ROT chip thus fabricated was used to characterize rotation of single cells with respect to the control parameters namely excitation voltage, frequency and cell line. The longevity of cell rotation under electric fields has been probed. Also, the Joule heating inside the ROT chip due to applied voltage has been characterized to know the thermal stress on the cells. The major advantages of the ROT chip developed are precise electrorotation of cells, simple design and straight forward fabrication process. / Dissertation/Thesis / M.S. Electrical Engineering 2012

Le travail rapporté dans ce manuscrit s’inscrit dans la perspective de mieux comprendre les propriétés électriques des tissus biologiques dans la gamme de fréquence allant de 10 kHz à 100 MHz. La connaissance de ces propriétés est essentielle pour évaluer les effets du champ électromagnétique sur le corps humain en cas d’exposition involontaire mais aussi pour diagnostiquer un changement physiologique quand le tissu est exposé volontairement. De nombreux travaux ont été effectués pour mesurer les propriétés électriques des différents tissus mais le comportement électrique relevé n’est pas toujours bien compris en raison de la complexité de la structure du tissu. De plus, on constate une grande variabilité dans les données rapportées dans la littérature. Pour mieux appréhender le comportement électrique du tissu, la démarche originale proposée dans ce manuscrit consiste à partir de l’échelle de la cellule. Ainsi la première partie du manuscrit est consacrée à la caractérisation électrique de cellule humaines de type HEK (Human Embryonic Kidney) par électrorotation. La mise en oeuvre de cette technique a permis d’extraire les propriétés électrique de la membrane et du cytoplasme des cellules HEK. La deuxième partie du manuscrit se focalise sur la création d’agrégats de cellules à partir de cellules HEK isolées. Deux techniques ont été essayées. La première s’appuie sur la nature des jonctions intercellulaires. Même si elle donne des résultats, cette approche n’est pas satisfaisante dans la mesure où on ne peut contrôler ni la forme ni la taille des agrégats. L’autre technique consiste à utiliser un champ électrique pour manipuler les cellules par diélectrophorèse. Un microsystème a été conçu à cet effet avec un réseau d’électrodes quadripolaires. On a ainsi pu obtenir des agrégats permanents de cellules HEK ayant une taille et une forme contrôlée. La dernière partie du manuscrit porte sur l’étude du comportement électrique des agrégats de cellules par le biais de simulations numériques de spectres d’électrorotation. La comparaison du comportement électrique d’une cellule isolée et celui d’un agrégat de cellules montre que le milieu extra cellulaire influe fortement sur la réponse électrique de l’agrégat ; la différence de taille entre les cellules de même que la présence de jonctions intercellulaires ne semblent pas avoir un impact significatif. Ces résultats de simulation devront être appuyés par des études expérimentales. / The work reported in this manuscript aims at understanding the electrical properties of biological tissues in the frequency range between 10 kHz and 100 MHz. Knowing these properties is essential to assess the effects of involuntary exposure of human body to electromagnetic fields, but also to diagnose a physiological change when the tissue is exposed voluntarily. Many studies have been conducted to measure the electrical properties of different tissues but existing data are not well understood because of the complexity of tissues structure. Moreover, there is considerable variability of data among studies evaluating these properties. To better understand the electrical behavior of tissues, the original approach proposed in this manuscript consists in investigating their properties starting from the cell scale. The first part of the manuscript is dedicated to the electrical characterization of HEK 293 (HumanEmbryonic Kidney) cells by electrorotation. This technique has been used to extract the electrical properties of the membrane and the cytoplasm of HEK cells. The second part of the manuscript focuses on creating cell aggregates from isolated HEKcells. Two approaches have been proposed. The first one was based on the nature of intercellular junctions. This approach led to the formation of aggregates of irregularsize and shape. The other technique consisted in using an electric field to perform dielectrophoresis-assisted cell assembly. A microsystem comprising quadrupole electrodes was designed for this purpose. Permanent aggregates of HEK cells having a controlled size and shape could be obtained using this approach. The last part of the manuscript focuses on study of the electrical behavior of the cell aggregates through numerical simulations of electrorotation spectra. The confrontation between results obtained for a single cell and those obtained for an aggregate tend to show that the extracellular medium influences strongly the electrical response of the aggregate ; Conversely, the difference in size between the cells as well as the presence of intercellular junctions does not seem to have had a notable impact. These simulation results will have to be supported by experimental studies.

Durant ces dernières décennies, les sources électromagnétiques se sont multipliées : l'exposition quotidienne de l'homme s'en est retrouvée considérablement accrue. L'étude des effets des champs sur l'organisme passe par une meilleure compréhension des phénomènes à l'échelle de la cellule, unité de base de l'être vivant. Nos objectifs dans le cadre de ce travail portent sur la caractérisation électrique des cellules et, plus précisément, des deux principaux compartiments cellulaires que représentent le cytoplasme et la membrane. A terme, l'objectif est de fournir les permittivités et conductivités de ces couches afin de renseigner les modèles qui seront utilisés pour la simulation de l'interaction champ-vivant. Lorsqu'une cellule est placée dans un champ électrique tournant (généré par des microélectrodes), elle tourne sur elle-même sous l'effet de polarisation des cellules : c'est le principe de l'électrorotation. Le sens et la vitesse de rotation dépendent des propriétés cellulaires et de la fréquence du champ. La mise au point d'une plateforme expérimentale dédiée et automatisée (génération du champ, acquisition et traitement des images, extraction des propriétés) a permis d'accéder aux propriétés électriques des différentes couches sur des levures et des liposomes à travers le tracé du spectre d'électrorotation. Plusieurs études ont permis de valider le fonctionnement de cette plateforme et d'évaluer l'impact des traitements thermique et enzymatique sur des levures ainsi que l'influence de la composition du milieu interne sur le spectre d'électrorotation de liposomes. Par ailleurs,une étude théorique portant sur l'identification paramétrique a montré qu'il est possible d'améliorer l'extraction de certains paramètres en se basant sur une analyse de sensibilité du spectre d'électrorotation à ces paramètres. La mise en place récente d'une salle de culture va permettre d'explorer une gamme plus large de cellules vivantes et d'étudier les effets de sources de champ magnétique sur celles-ci.

Die Elektrorotation von fixierten Erythrozyten wurde im Frequenzbereich von 16 Hz bis 33 MHz untersucht. Zwischen 16 Hz und 1 kHz zeigen die fixierten Erythrozyten eine Rotation parallel zur Feldrichtung mit einer maximalen Rotationsgeschwindigkeit zwischen 30 Hz und 70 Hz. Es wurde sowohl die Abhängigkeit von der äußeren Leitfähigkeit untersucht als auch von der Oberflächenladung. Die experimentellen Resultate erwiesen sich als konsistent mit einer erst kürzlich entwickelten Theorie zur Elektrorotation im niederfrequenten Bereich (LFER). Sie zeigen, daß die Elektrorotation im niederfrequenten Bereich von der Oberflächenladung und -leitfähigkeit entscheidend mitbestimmt werden kann. Fixierte Thrombozyten wurden mittels Elektrorotation im Frequenzbereich von 16 Hz bis 33 MHz untersucht. Zur Interpretation der Daten wurde ein theoretisches Modell weiterentwickelt, welches die innere vesikuläre Struktur der Thrombozyten berücksichtigt, und mit dem niederfrequenten Modell zur Elektrorotation superponiert. In Lösungen mit Dextran unterschiedlicher Molekulargewichte und Konzentrationen wurde sowohl die elektrophoretische Mobilität als auch Elektrorotation von fixierten Erythrozyten untersucht. Es konnte gezeigt werden, daß sich im niederfrequenten Bereich Depletionschichten an Hand von Elektrorotationsspektren erfassen lassen. Diese Daten bestätigen auch die Theorie zur LFER. Messungen der elektrophoretischen Mobilität von nativen Erythrozyten wurden in Lösungen mit dem Polyelektrolyten Polystyrensulfonat in Anhängigkeit vom Molekulargewicht und der Salzkonzentration durchgeführt. Es zeigte sich, daß das Polymer zum einen reversibel adsorbiert und zum anderen einen deutlichen Depletioneffekt herbeiführt. Im letzten Teil der Arbeit wurde ein Verfahren entwickelt, welches die Herstellung von Polyelektrolyt-Kapseln auf der Grundlage von biologischen Zellen ermöglicht, welche in Form und Größe identisch mit den verwendeten biologischen Templaten sind. / Electrorotation of fixed red blood cells (RBC) has been investigated in a frequency range between 16 Hz and 33 Mhz. Between 16 Hz and 1 kHz fixed red blood cells undergo co-field rotation with a maximum of rotation betwen 30 and 70 Hz. The rotation was studied as a function of electrolyte conductivity and surface charge density. These observations are consistent with a recently developed theory of the low frequency electrorotation (LFER) and demonstrate that the surface charge and the surface conductivity can play a significant role in this frequency range. Fixed platalets were investigated by means of electrorotation in the frequency range from 16 Hz to 33 Mhz. For the interpretation of the data a model which takes into account the inner structure of the platalets was developed and added to the theory which describes the rotation in the low frequency range. In solutions with Dextran and fixed platalets the electrophoretic mobility as well as the electrorotation was measured. It was shown that in the low frequency range depletion layers are detectable. Furthermore this results verify the LFER theory. Measurements of the electrophoretic mobility of native RBC were carried out in solutions of the polyelectrolyte Polystyrenesulfonate in dependence on the molecular weight and the ionic strength. It was shown that the polymer adsorbs reversible and forms a significant depletion effect. In the last part of this work a method was developed, which allows the construction of polyelectrolyte caspules with biological cells as template, which are identical in size and shape with the templates used.