La transplantation d’hépatocytes dans le foie est un procédé séduisant pour corriger la fonction hépatique et permettre peut-être d’éviter la transplantation d’organe. Actuellement, la greffe de cellules hépatiques a été envisagée pour corriger le déficit métabolique des patients ayant une maladie hépatique métabolique héréditaire, dont le foie est par ailleurs normal. Les résultats des essais cliniques d’allotransplantation ou d’autotransplantation d'hépatocytes génétiquement modifiés montrent une prise de greffe insuffisante et, dans la plupart des études, un effet thérapeutique transitoire. Ces résultats ont incité à développer des modèles animaux précliniques pour tester des procédés facilitant la prise de greffe. L’intégration des hépatocytes dans les travées hépatocytaires et leur prolifération permet de préparer le foie à greffer par stimulation de la régénération hépatique. Ces deux procédés sont aujourd'hui utilisés en routine dans ces modéles expérimentaux: l’hépatectomie partielle ou l’embolisation portale. Néanmoins, ces deux techniques de stimulation de la régénération hépatique sont difficilement applicables à la pratique clinique car la résection chirurgicale du foie comporte des risques majeurs et l’embolisation portale "classique", c’est-à-dire l’obstruction des grosses veines sectorielles du foie, est responsable d'une embolisation anatomique avec une atrophie ou une destruction partielle de la partie du foie embolisé. Par ces procédés, certes la régénération est stimulée à hauteur de 20% mais seulement sur une partie du volume hépatique (environ 50%) avec diminution du volume accessible à la greffe sans compter les risques liés à l'atrophie ou à la resection chirurgicale du reste du foie.Nous avons donc proposé une nouvelle approche de stimulation de la régénération hépatique chez la souris. Nous avons utilisé une embolisation portale volumétrique à l’aide de microbilles allant très loin dans tout le foie. Il s’agit donc de l’embolisation d'un pourcentage du volume global hépatique sans altération anatomique (lobe) du foie. Ainsi, les traumatismes nécessaires à la préparation du foie pour augmenter la prolifération seront mieux répartis dans la totalité du foie et devraient avoir moins de conséquences sur la fonction hépatique, contrairement à l’embolisation partielle dite anatomique. Un autre effet serait la préservation de l’accessibilité à tout le volume du foie des cellules à greffer et non plus à la partie non embolisée du foie ce qui devrait d’augmenter le nombre de cellules injectées donc transplantées par une même préparation.Nous devons encore évaluer les repercutions hépatiques à long terme (>J21) des conditions d'embolisation volumétrique à plus fort taux de régénération mais qui implique des lésions de nécrose hépatique. Avant de passer sur des modéles cliniques, une évaluation de l’embolisation volumétrique sur un animal plus gros (rat ou maquaque) avec déficit métabolique est nécéssaire. Par ailleurs, cette nouvelle préparation du foie doit être optimisée pour une application clinique à moyen terme avec des injections séquentielles de microsphères et l’utilisation de microsphères résorbables, ce qui permettrait d’obstruer plus de sinusoïdes sans accumulation du matériel dans les branches portales, et ainsi augmenter le signal de régénération.Si ces résultats se confirment, notamment chez l’animal, ce nouveau procédé permettrait d’améliorer la prise de greffe de façon significative dans l’ensemble du parenchyme hépatique et de pouvoir transplanter un plus grand nombre de cellules. L’intérêt de cette technique peu invasive la rend d’autant plus applicable chez l’homme car l’architecture du foie est préservée. De réels progrès dans la thérapie cellulaire hépatique devront permettre dans le futur de mieux traiter les patients atteints de maladies métaboliques héréditaires. / Hepatocyte transplantation has been proposed as an alternative to orthotopic liver transplantation to treat metabolic liver diseases. This approach requires preconditioning of the host liver to enhance engraftment of transplanted hepatocytes. Different methods are currently used in preclinical models: partial hepatectomy, portal ligature or embolization, and radiotherapy or chemotherapeutic drugs. However, these methods carry high risks of complications and are problematic for use in clinical practice. Here, we developed an innovative method called volumetric (distal, partial and random) portal embolization (EPV), which preserves total liver volume.METHODS: Embolization was performed in the portal trunk of C57BL6 adult mice with polyester microspheres, to ensure a bilateral and distal distribution. The repartition of microspheres was studied by angiographic and histological analysis. Liver regeneration was evaluated by Ki67 labeling. Optimal conditions for EPV were determined and the resulting regeneration was compared with that following partial hepatectomy (70%). Labeled adult hepatocytes were then transplanted and engraftment was compared between embolized (n=19) and non embolized mice (n=8). Engraftment was assessed in vivo and histologically by tracking labeled cells at day 5. RESULTS: The best volumetric embolization conditions, which resulted in the regeneration of 5% of total liver, were 8x106 10µm microspheres infused with a 29 G needle directly into the portal trunk at 3.3ml/s. In these conditions, transplanted hepatocytes engraftment was significantly higher than in control conditions (3 vs 0.65%). CONCLUSIONS: EPV is a new, minimally invasive and efficient technique to prepare the host liver for cell transplantation.

Le foie possède une capacité de régénération importante qui lui permet de reconstituer son volume suite à une agression. L’induction d’une régénération hépatique est réalisée en pratique courante en chirurgie hépatique afin de préparer le foie à une hépatectomie majeure. Elle est également utilisée dans de nombreux modèles animaux afin de favoriser la prise de greffe hépatocytaire au cours de la transplantation d’hépatocytes pour le traitement de maladies métaboliques héréditaires hépatiques. Les principaux objectifs de ce travail ont été d’étudier une méthode peu invasive pour induire une importante régénération hépatique : d’une part pour élargir les possibilités de prise en charge des patients nécessitant une hépatectomie, et d’autre part pour favoriser la prise de greffe des hépatocytes transplantés pour le traitement des maladies métaboliques héréditaires hépatiques.Dans un premier temps, nous avons mis au point chez le rat une technique d’embolisation portale partielle résorbable répétée (EPPRR) visant à entrainer un stimulus additionnel de régénération hépatique. Ces travaux ont validé le concept de la méthode d’EPPRR en montrant une augmentation de la prolifération hépatocytaire et une hypertrophie dans la partie du foie non embolisée.Ce protocole d’EPPRR a ensuite été appliqué dans un modèle préclinique de gros animal. Nous avons étudié chez le porc les conséquences de l’EPPRR et montré que cette technique était reproductible, bien tolérée, et qu’elle permettait une hypertrophie de la partie du foie non embolisée.Parallèlement, nous avons appliqué l’EPPRR avant transplantation d’hépatocytes chez le rat. A partir du foie de rats transgéniques exprimant la GFP (green fluorescent protein), nous avons pu isoler des hépatocytes GFP+. Ces cellules ont été transplantées dans le foie de rats receveurs GFP- en association avec une EPPRR. Nous avons montré que le stimulus de régénération répété provoqué par l’EPPRR permettait une augmentation de la prise de greffe.En conclusion, l’EPPRR est une technique peu invasive capable d’induire une régénérative hépatique efficace. Cette approche pourrait jouer un rôle dans la prise en charge des tumeurs hépatique et l’optimisation de la transplantation d’hépatocytes pour le traitement des maladies métaboliques héréditaires hépatiques. / The liver has an important regenerative capacity allowing reconstitution of the hepatic volume after an aggression. The induction of liver regeneration is used in routine clinical practice before liver surgery in order to prepare the liver for major hepatectomy. It is also used in numerous animal models in order to increase hepatocyte engraftment during hepatocyte transplantation for the treatment of inherited metabolic liver diseases. The main objective of this work was to evaluate a minimally invasive approach to induce substantial liver regeneration: firstly, to expand the therapeutic options for patients requiring an hepatectomy, and secondly to increase the engraftment of transplanted hepatocytes for the treatment of inherited metabolic liver diseases.In a first study, we developed in the rat model a technique of repeated reversible portal vein embolization (RRPVE) to induce an additional stimulus of liver regeneration. This study established the proof of concept of the RRPVE method, showing an increase in hepatocyte proliferation and hypertrophy in the non-embolized liver.This RRPVE protocol was then used in a preclinical model of large animal. We studied in swine the consequences of the RRPVE and showed that the procedure was reproducible, well tolerated, and allowed hypertrophy of the non-embolized liver.In parallel, we applied RRPVE before hepatocyte transplantation in the rat model. From the liver of transgenic rats expressing GFP (green fluorescent protein), we were able to isolate GFP+ hepatocytes. These cells were transplanted in the liver of recipient GFP- rats in association with RRPVE. We demonstrated that the repetition of the regeneration stimulus induced by RRPVE allowed increased hepatocyte engraftment.In conclusion, RRPVE is a minimally invasive technique able to induce efficient liver regeneration. This approach could play a part in the management of hepatic malignancies and the optimization of hepatocyte transplantation in the treatment of inherited metabolic liver diseases.

La transplantation d’hépatocytes est un procédé séduisant pour remplacer les cellules déficientes dans un foie anatomiquement normal. Dans les maladies métaboliques héréditaires hépatiques (MMHH), la thérapie cellulaire présente un potentiel espoir thérapeutique. Le remplacement d'un pourcentage restreint (5-10%) d’hépatocytes déficients par des hépatocytes normaux pourrait rétablir durablement la fonction métabolique. Les résultats des essais cliniques de transplantation d'hépatocytes génétiquement modifiés ou non sont moins concluants, montrent une prise de greffe insuffisante et, dans la plupart des études, un effet thérapeutique transitoire. L’efficacité limitée de la transplantation d’hépatocytes isolés dans le traitement des MMHH semble en partie liée au faible pourcentage de la masse hépatocytaire reconstituée par les hépatocytes définitivement greffés et fonctionnels. De nombreux modèles animaux ont été développés pour étudier les facteurs pouvant augmenter le nombre et le pourcentage d’hépatocytes transplantés et greffés. Cependant, la majorité de ces modèles ne sont pas transposables en clinique car ils présentent des risques importants ou mal évalués pour les patients. Les principaux objectifs de ce travail ont été d’étudier des moyens peu invasifs pour induire une régénération hépatique et une prise de greffe hépatocytaire significatives dans le but de développer une nouvelle approche de transplantation d’hépatocytes génétiquement modifiés ex vivo pour le traitement de l’hypercholestérolémie familiale. L’effet d’une embolisation portale partielle (EPP) réversible sur la prolifération hépatocytaire et la régénération hépatique a été évalué chez le macaque. A la différence de l’EPP par un produit non résorbable, il ne s’agit pas d’une approche potentiellement délétère à long terme. Une obstruction veineuse plus complète a été provoquée en utilisant le Curaspon®, une gélatine biodégradable, en forme de poudre. Nous avons démontré pour la première fois dans la littérature l’efficacité d’une EPP réversible à induire une importante prolifération hépatocytaire et régénération hépatique. Nos données suggèrent qu’une occlusion portale initiale et temporaire est suffisante pour déclencher les mécanismes responsables d’une régénération hépatique dans le foie non-embolisé. L’utilisation du Curaspon® en poudre peut être considérée comme la forme la plus évoluée d’EPP : très distale, résorbable, qui dure suffisamment pour induire l’hypertrophie hépatique. Cette technique pourrait être indiquée dans des situations cliniques nécessitant une régénération hépatique de courte durée (ex. le traitement des cancers du foie en plusieurs étapes) ou dans des cas qui ne nécessitent pas une résection hépatique, comme la transplantation d’hépatocytes pour le traitement de MMHH. Ces résultats nous ont permis d’évaluer cette approche dans notre protocole préclinique de thérapie génique pour le traitement de l’hypercholestérolémie familiale chez le primate, par autotransplantation d’hépatocytes génétiquement modifiés ex vivo par un vecteur lentiviral. Nous avons démontré que l’EPP réversible induit une régénération hépatique du foie non-embolisé et améliore notablement les résultats de la transplantation d’hépatocytes isolés génétiquement modifiés exprimant la GFP. Seize semaines après la transplantation, les hépatocytes transduits et greffés exprimaient le transgène contrôlé par le promoteur apo-AII humain. Notre protocole a montré pour la première fois chez un gros animal que l’EPP par un produit résorbable entraine avec des conditions de sécurité optimales une repopulation hépatique importante par des hépatocytes transduits par un vecteur lentiviral, et ceci même à distance de la transplantation hépatocytaire. Les résultats encourageants de ces travaux nous ont ouvert la voie pour avancer sur notre projet préclinique et envisager la réalisation d’une étude clinique de phase I/II pour le traitement de l’hypercholestérolémie familiale. / Hepatocyte transplantation is an attractive process for replacing deficient cells in an anatomically normal liver. In metabolic liver diseases, cell therapy could be an interesting alternative to orthotopic liver transplantation. The replacement of a small percentage (5-10%) of deficient hepatocytes by normal hepatocytes could restore the metabolic defect at a long term. Data from clinical studies of hepatocyte autotransplantation or allotransplantation, genetically modified or not, provided poor results, insufficient cell engraftment in the liver parenchyma and, in the majority of cases, a transient therapeutic effect. The limited efficacy of hepatocyte transplantation in metabolic liver diseases is mainly due to the poor percentage of engrafted and finally functional hepatocytes. Numerous animal models have been developed in order to study the factors that could increase the number and the percentage of transplanted and engrafted hepatocytes. However, the majority of these models cannot be used in patients since they present important risks for them. The aim of this work was to evaluate less invasive procedures for inducing liver regeneration and significant hepatocyte engraftment in order to develop a new approach of transplantation of ex vivo genetically modified hepatocytes for the treatment of familial hypercholesterolemia. The effect of reversible portal vein embolization (PVE) on liver regeneration and hepatocyte proleferation was evaluated in monkeys. In contrast to PVE by a permanent embolizing agent, reversible PVE has not a long term deleterious effect on embolized liver. A more complete venous occlusion was obtained by using the powdered form of an absorbable gelatin sponge (Curaspon®). We showed for the first time in the literature the safe and successful use of reversible PVE for inducing significant hepatocyte proliferation and liver regeneration. Our data support that an initial occlusion of the portal branch, even if not permanent, is sufficient to start the mechanisms of liver regeneration in the contralateral lobe. Embolization with Curaspon® powder could be considered to be the ultimate form of embolization: very distal, reversible and lasting sufficiently in order to induce substantial liver hypertrophy. Our findings suggest that this method could reliably be used for clinical purposes, particularly in situations in which short-term regeneration is required (i.e. multi-step management of hepatic malignancies) or in cases where resection of the liver is not finally necessary, such as in hepatocyte transplantation for the treatment of metabolic liver diseases. These promising results on reversible PVE allowed us to evaluate this approach in our preclinical study of gene therapy for the treatment of familial hypercholesterolemia in macaques. Our protocol consisted of an autotransplantation of ex vivo genetically modified hepatocytes by a lentiviral vector. We showed that reversible PVE induces liver regeneration of the non-embolized liver segments and improves considerably hepatocyte transplantation of genetically modified cells expressing Green Fluorescent Protein (GFP). Sixteen weeks after transplantation, transduced engrafted hepatocytes expressed the transgene, which was under control of the human apo-AII promoter. Our protocol showed for the first time in a big animal that PVE by an absorbable agent leads safely to an important and long-term repopulation of the liver by lentivirally transduced hepatocytes. The extremely encouraging results of this work opened our way advancing in our preclinical study and preparing a phase I/II clinical trial for the treatment of familial hypercholesterolemia based on our protocol of autotransplantation of ex vivo genetically modified hepatocytes by a lentiviral vector.

La transplantation d'hépatocytes est un procédé séduisant pour remplacer les cellules déficientes dans un foie anatomiquement normal. Dans les maladies métaboliques héréditaires hépatiques (MMHH), la thérapie cellulaire présente un potentiel espoir thérapeutique. Le remplacement d'un pourcentage restreint (5-10%) d'hépatocytes déficients par des hépatocytes normaux pourrait rétablir durablement la fonction métabolique. Les résultats des essais cliniques de transplantation d'hépatocytes génétiquement modifiés ou non sont moins concluants, montrent une prise de greffe insuffisante et, dans la plupart des études, un effet thérapeutique transitoire. L'efficacité limitée de la transplantation d'hépatocytes isolés dans le traitement des MMHH semble en partie liée au faible pourcentage de la masse hépatocytaire reconstituée par les hépatocytes définitivement greffés et fonctionnels. De nombreux modèles animaux ont été développés pour étudier les facteurs pouvant augmenter le nombre et le pourcentage d'hépatocytes transplantés et greffés. Cependant, la majorité de ces modèles ne sont pas transposables en clinique car ils présentent des risques importants ou mal évalués pour les patients. Les principaux objectifs de ce travail ont été d'étudier des moyens peu invasifs pour induire une régénération hépatique et une prise de greffe hépatocytaire significatives dans le but de développer une nouvelle approche de transplantation d'hépatocytes génétiquement modifiés ex vivo pour le traitement de l'hypercholestérolémie familiale. L'effet d'une embolisation portale partielle (EPP) réversible sur la prolifération hépatocytaire et la régénération hépatique a été évalué chez le macaque. A la différence de l'EPP par un produit non résorbable, il ne s'agit pas d'une approche potentiellement délétère à long terme. Une obstruction veineuse plus complète a été provoquée en utilisant le Curaspon®, une gélatine biodégradable, en forme de poudre. Nous avons démontré pour la première fois dans la littérature l'efficacité d'une EPP réversible à induire une importante prolifération hépatocytaire et régénération hépatique. Nos données suggèrent qu'une occlusion portale initiale et temporaire est suffisante pour déclencher les mécanismes responsables d'une régénération hépatique dans le foie non-embolisé. L'utilisation du Curaspon® en poudre peut être considérée comme la forme la plus évoluée d'EPP : très distale, résorbable, qui dure suffisamment pour induire l'hypertrophie hépatique. Cette technique pourrait être indiquée dans des situations cliniques nécessitant une régénération hépatique de courte durée (ex. le traitement des cancers du foie en plusieurs étapes) ou dans des cas qui ne nécessitent pas une résection hépatique, comme la transplantation d'hépatocytes pour le traitement de MMHH. Ces résultats nous ont permis d'évaluer cette approche dans notre protocole préclinique de thérapie génique pour le traitement de l'hypercholestérolémie familiale chez le primate, par autotransplantation d'hépatocytes génétiquement modifiés ex vivo par un vecteur lentiviral. Nous avons démontré que l'EPP réversible induit une régénération hépatique du foie non-embolisé et améliore notablement les résultats de la transplantation d'hépatocytes isolés génétiquement modifiés exprimant la GFP. Seize semaines après la transplantation, les hépatocytes transduits et greffés exprimaient le transgène contrôlé par le promoteur apo-AII humain. Notre protocole a montré pour la première fois chez un gros animal que l'EPP par un produit résorbable entraine avec des conditions de sécurité optimales une repopulation hépatique importante par des hépatocytes transduits par un vecteur lentiviral, et ceci même à distance de la transplantation hépatocytaire. Les résultats encourageants de ces travaux nous ont ouvert la voie pour avancer sur notre projet préclinique et envisager la réalisation d'une étude clinique de phase I/II pour le traitement de l'hypercholestérolémie familiale.