Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Biologia Animal, 2016. / Submitted by Fernanda Percia França (fernandafranca@bce.unb.br) on 2017-03-10T18:05:39Z No. of bitstreams: 1 2016_TainãRappPy-Daniel_Parcial.pdf: 977532 bytes, checksum: f1c0bbe9f6abd87299d6b2e7aae744a4 (MD5) / Approved for entry into archive by Raquel Viana(raquelviana@bce.unb.br) on 2017-04-06T21:53:25Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2016_TainãRappPy-Daniel_Parcial.pdf: 977532 bytes, checksum: f1c0bbe9f6abd87299d6b2e7aae744a4 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-04-06T21:53:25Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2016_TainãRappPy-Daniel_Parcial.pdf: 977532 bytes, checksum: f1c0bbe9f6abd87299d6b2e7aae744a4 (MD5) / Estudos de desenvolvimento são contribuições importantes para a interpretação de padrões evolutivos responsáveis pelas atuais linhagens filogenéticas. Os squamatas são um grupo altamente diversificado que ainda é pouco representado em investigações embriológicas. O presente estudo descreve a sequência de desenvolvimento in ovo de Tropidurus torquatus. Fêmeas grávidas foram coletadas por meio de laço em ambientes antropizados de Brasília, Brasil, e mantidas em terrários até o momento de oviposição. Uma vez ocorrida a desova, os ovos foram transferidos para uma incubadora com temperatura de 30ºC (± 0,1º C). Coletas diárias dos embriões foram realizadas desde o momento de oviposição até eclosão, a qual ocorreu após aproximadamente 75 dias, resultando em um total de 209 embriões obtidas em duas estações reprodutivas. Foram estabelecidos 15 estágios de desenvolvimento com base em características de morfologia externa amplamente utilizadas na literatura de lagartos, como estruturas visuais, arcos faríngeos, fusão dos primórdios faciais, desenvolvimento dos membros, pigmentação e escamas. A organogenese já estava em andamento no momento de oviposição, com embriões condizendo com o estágio 28 descrito em outros estudos. Comparações com outros lagartos mostram uma sequência embrionária conservada, contudo diferenças no tempo de desenvolvimento foram encontradas em características como os arcos faríngeos, sacos endolinfáticos, pigmentação e escamas. Ao contrário da maioria das series de desenvolvimento de lagartos, os membros pelvinos da espécie alvo se desenvolvem antes que membros torácicos. O desenvolvimento dos primórdios do falo e lábio cranial da cloaca são comparados com os de outros lagartos. O esqueleto de espécimes adultos foi descrito e serviu de base para as descrições de desenvolvimento esquelético. O condrocrânio de T. torquatus apresentou redução de elementos orbitotemporais como as tenias marginais e a pila antótica Os elementos dermais aparentemente possuem uma sequência de ossificação conservada entre lagartos, ocorrendo maiores variações no padrão de ossificação dos elementos condrais. As vértebras ossificaram-se em um gradiente crânio-caudal, mas mostraram uma dissociação em relação às costelas cuja ossificação não seguiu este gradiente. Um centro de ossificação independente para as costelas das vértebras sacrais e caudais não foi visualizado. Nos membros, constatamos a formação do uma condensação cartilagínea contínua em forma de “Y”, seguido pelo desenvolvimento do arcabouço dos membros que consiste na formação do eixo primário e arco digital. Os elementos autopodiais do membro pelvino desenvolveram-se com certa antecedência em relação aos membros torácicos. Todos os distais do carpo foram vistos, o distal do carpo I permanecendo em contato estreito com o seu respectivo metacarpo. O distal do carpo V não demonstrou uma conexão embrionária com dcIV. Quanto aos distais do tarso, apenas a condensação condrogênica do dtI não foi visualizada. Encontramos uma conexão embrionária entre o distal do tarso V e o distal do tarso IV, indicando que o dtV provavelmente não tem uma origem independente. Os distais do tarso II e V consistiram em condensações transitórias que logo se fusionaram aos seus metatarsos. Foi possível distinguir a participação de três elementos condrogênicos na formação do proximal do tarso: o fibular, o intermédio-central e o tibial. A sequência de ossificação do autopódio não refletiu a sequência condrogênica de desenvolvimento do eixo primário e do arco digital. Exemplos de ossificações pós-embrionárias incluem a diminuição na área da fontanela parietal, ossificação de elementos do autopódio torácico, surgimento de centros de ossificações secundários nas epífises dos ossos longos e fusão dorsal dos arcos vertebrais e da sutura neurocentral. Espera-se que o presente estudo possa contribuir como fonte de dados para futuras investigações evolutivas e de desenvolvimento relacionadas à tropidurídeos e squamatas. / Developmental studies are an important contribution to the interpretation of evolutionary patterns responsible for extant phylogenetic lineages. Squamates are a highly diverse group that is still underrepresentated in embryological investigations. The present study describes the sequence of in ovo development of Tropidurus torquatus. Gravid females were collected by noose in antropized surroundings of Brasília, Brazil, and maintained in terrariums until oviposition. Once deposition occurred, eggs were transferred to a 30ºC (± 0,1º C) temperature incubator. Daily collection of embryos were accomplished from oviposition to hatching, which took place after approximately 75 days, resulting in a total of 209 embryos obtained in two reproductive seasons. Fifteen developmental stages were established based on external morphological characteristics widely used in lizard literature such as visual structures, pharyngeal arches, facial primordial fusion, limb development, pigmentation and scales. Organogenesis was already in progression at the moment of oviposition, at which embryos resemble stage 28 of other studies. Comparisons with other lizards show a conserved embryonic sequence, however developmental timing differences were found in features such as the pharyngeal arches, endolymphatic sacs, pigmentation and scales. The order of T. torquatus fore- and hindlimb formation differs from that most commonly observed in lizards. The development of the phallic and cranial lip of the cloaca anlages are compared with that of other lizards. The adult skeleton of T. torquatus was describes and served as a guide for the developmental descriptions. The chondrocranium of T. torquatus presented reduction of orbitotemporal elements such as the teania marginalis and pila antotica. Dermal elements apparently show a conserved ossification sequence amongst lizards, main variations occurring in the ossification sequence of chondral elements. Vertebrae ossify in a cranial-caudal gradient, but are dissociated from the ossification of the ribs which do not follow this gradient. An independent center of ossification for the sacral and caudal ribs was not visualized. In the limbs, a continuous cartilaginous condensation forming a “Y” was first seen, followed by the development of the limb understructure which consists in the formation of the primary axis and the digital arch. The autopodial elements of the hindlimbs developed slightly earlier than the forelimbs. All distal carpals were seen, distal carpal I remaining in close contact with its metacarpal. The dcV did not show an embryonic connection with dcIV. In regard to the distal tarsals, only the chondrogenic condensation of distal tarsal I was not visualized. We found an embryonic connection between distal tarsal V and distal tarsal IV, indicating that dtV is probably not a de novo condensation. The distal tarsal II and V consisted in transitory condensations that rapidly fused with their respective metatarsal. Three chondrogenic elements were identified as constituents of the tarsus: fibular, intermedium-central and tibial. The sequence of ossification of the autopodium did not reflect the chondrogenic sequence of primary axis development. Examples of post-embryonic ossifications include a reduction in the area of the parietal fontanel, ossification of forelimb autopodial elements, development of secondary centers of ossifications of long bone epiphysis and dorsal fusion of vertebral arches and neurocentral sutures. The present study intends to contribute as a source of data for future investigations concerned with the evolution and development of tropidurids and squamates.

Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Ciências da Saúde, Programa de Pós-Graduação em Ciências da Saúde, 2015. / Submitted by Fernanda Percia França (fernandafranca@bce.unb.br) on 2015-11-19T17:18:56Z No. of bitstreams: 1 2015_LauraVanessaMourãoGulart.pdf: 1266298 bytes, checksum: cfa73ee576ff7b692bad82afcbbcaa82 (MD5) / Approved for entry into archive by Guimaraes Jacqueline(jacqueline.guimaraes@bce.unb.br) on 2015-12-30T14:37:24Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2015_LauraVanessaMourãoGulart.pdf: 1266298 bytes, checksum: cfa73ee576ff7b692bad82afcbbcaa82 (MD5) / Made available in DSpace on 2015-12-30T14:37:24Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2015_LauraVanessaMourãoGulart.pdf: 1266298 bytes, checksum: cfa73ee576ff7b692bad82afcbbcaa82 (MD5) / A produção de embriões in vitro é uma biotécnica importante para a reprodução e constitui-se como ferramenta valiosa para estudos de interações de gametas e/ou embriões e, com isso, torna-se cada vez mais excelente modelo não somente para averiguações sobre aspectos sanitários, como também relacionados a processos tóxicos e interações presentes no ambiente in vitro. O objetivo deste estudo foi testar e analisar o efeito dos diferentes meios de maturação oocitária in vitro (MEMB e MEMO) associados ou não FSH em concentrações de 1 e 10ng/ml, sobre a produção de blastocistos bovinos e a expressão de genes relacionados a competência e metabolismo embrionário (GLUT1, GLUT4, PDH, G6PDH, GAPDH, COX2, CDX, HSP70, BAX e BCL2). Em todos os experimentos, oócitos foram obtidos de abatedouro, coletados de vacas adultas e maturados em meio controle (TCM199) e meios testes (MEMO, MEMO+1FSH, MEMO+10FSH, MEMB, MEMB+1FSH, MEMB+10FSH). No Experimento 1, os oócitos foram fertilizados e cultivados até o estágio de blastocisto, avaliando e correlacionando a adição de FSH com 1ng/mL ou 10ng/mL nos meios MEMB e MEMO. No experimento 2, avaliou-se a expressão dos genes GLUT1, GLUT4, PDH, G6PDH, GAPDH, COX2, CDX, HSP70, BAX e BCL2 em embriões oriundos da maturação em meios diferentes suplementados ou não com FSH (1 ou 10ng/mL). No experimento 1, os resultados demonstraram que a dose de FSH 10ng/mL no meio MEMO+10FSH diminui a produção de embriões; e nos meios MEMO e MEMO+1FSH a produção de embriões é a mesma. Nos meios MEMB com 1FSH e 10FSH não houve diferença na produção de embriões. Já no meio MEMB sem FSH a produção de embriões foi igual ao do grupo controle TCM199. A expressão de GLUT4, GLUT1, PDH, COX2 e BAX em embriões maturados em meios de maturação controle e nos grupos de meios definidos não foi diferente. O gene G6PDH foi expresso em baixa abundância nos meios TCM199, MEMB+FSH e MEMO. Nos meios MEMB e MEMO+FSH ocorre um aumento do gene G6PDH, sendo estes semelhantes. A abundância de GAPDH nos meios TCM199 e MEMB+FSH é menor; e nos meios MEMB, MEMO e MEMO+FSH é maior. Nos genes HSP70 não há significância entre MEMB e MEMB+FSH, e sim entre MEMO e MEMO+FSH. Nos genes CDX apenas o MEMB esta elevado, o MEMO não é detectado, e no MEMO+FSH foi pouco expresso. Em relação ao BCL2 o TCM199 foi o mais abundantemente expresso e semelhante aos meios MEMO e MEMO+FSH. Já com os meios MEMB e MEMB+FSH são poucos expressos. Concluiu-se que a produção de embriões no meio MEMO foi menor que nos outros tratamentos; e o meio MEMB produz a mesma taxa de embriões que o grupo controle. A adição de FSH aos meios de maturação diminui a produção de embriões no MEMB, e leva, na maioria das vezes baixa expressão de marcadores de competência. / The production of in vitro embryos is an important biotechnical technique for reproduction and it constitutes a valuable tool for studies of interactions of gametes and / or embryos and, therefore, it becomes increasingly an excellent model not only for check ups concerning sanitary aspects, but also when it is related to toxic processes and actual interactions in the in vitro environment. The objective of this study was to test and analyze the effect of different oocyte maturation mediums in vitro (MEMB and MEMO) either associated or not FSH at concentrations of 1 and 10 ng / ml, on the production of bovine blastocysts and the expression of genes related to competence and embryonic metabolism (GLUT1, GLUT4, PDH, G6PDH, GAPDH, COX2, CDX, HSP70, BAX and BCL2). In all experiments, oocytes were obtained from a slaughterhouse, collected from adult cows and matured in control medium (TCM199) and medium tests (MEMO MEMO + 1FSH, MEMO + 10FSH, MEMB, MEMB + 1FSH, MEMB + 10FSH). In Experiment 1, the oocytes were fertilized and cultured up to the blastocyst stage, assessing and correlating the addition of FSH with 1 ng / ml or 10 ng / mL in MEMB and MEMO mediums. In experiment 2, the expression of GLUT1 gene, GLUT4, PDH, G6PDH, GAPDH, COX2, CDX, HSP70, BAX and BCL2 was evaluated in embryos from maturation in different medium either supplemented or not with FSH (1 or 10 ng / mL) . In experiment 1, the results demonstrated that the FSH dose of 10 ng / ml in the medium MEMO + 10FSH decreases the production of embryos; and in the mediums MEMO and MEMO + 1FSH the production of embryos is the same. In the MEMB medium with 1FSH and 10FSH there was no difference in embryo production. But in the MEMB medium without FSH, the embryo production was the same as the one in the TCM199 control group. The expression of GLUT4, GLUT1, PDH, COX2 and BAX in embryos matured in control maturation medium and defined medium groups was no different. The G6PDH gene was expressed in low abundance in TCM199 MB + FSH and MEMO mediums. In the MEMB and MEM + FSH mediums, an increase of the G6PDH gene happens, and they are similar. The abundance of GAPDH in TCM199 and MEMB + FSH mediums is lower; and in the MEMB, MEMO and MEMO + FSH mediums is higher. In the HSP70 genes there is no significance between MEMB and MEMB + FSH, but there is some difference between MEMO and MEMO + FSH. In the CDX genes, only the MEMB is high, MEMO is not detected, and the MEMO + FSH was little expressed. Concerning the BCL2, the TCM199 was the most expressed and it was similar to the MEMO and MEMO + FSH mediums. But with the MEMB and MEMB + FSH mediums, they are little expressed. It was concluded that the production of embryos in the MEM medium was lower than the other treatments; and the MEMB medium produces the same rate of embryos than that of the control group. The addition of FSH to the maturation mediums decreases the production of embryos in the MEMB and leads in most cases to low expression of competence markers.

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Faculdade em Agronomia e Veterinária, 2016. / Submitted by Camila Duarte (camiladias@bce.unb.br) on 2016-09-14T19:07:12Z No. of bitstreams: 1 2016_LuziaRenatadeOliveiraDias.pdf: 585188 bytes, checksum: c1d67f8ad9c30dc53f569fab1b6a16a0 (MD5) / Approved for entry into archive by Raquel Viana(raquelviana@bce.unb.br) on 2016-10-24T11:06:28Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2016_LuziaRenatadeOliveiraDias.pdf: 585188 bytes, checksum: c1d67f8ad9c30dc53f569fab1b6a16a0 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-10-24T11:06:28Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2016_LuziaRenatadeOliveiraDias.pdf: 585188 bytes, checksum: c1d67f8ad9c30dc53f569fab1b6a16a0 (MD5) / A criopreservação de embriões produzidos in vitro (PIV) é afetada pelas altas concentrações de gotículas lipídicas que se acumulam no interior dos blastômeros. A remoção parcial de lipídios intracitoplasmáticos, por estímulo da lipólise química no citoplasma celular ou pela diminuição da captação e síntese de ácidos graxos pelas células, pode ser uma alternativa para melhorar a criopreservação desses embriões. Neste sentido, objetivou-se estimar o efeito de alguns agentes delipidantes, L-carnitina e o isômero trans-10 cis-12 do ácido linoleico conjugado (CLA), durante o cultivo na quantidade, qualidade e conteúdo lipídico de embriões bovinos produzidos in vitro. Foram utilizados 2.448 ovócitos de grau 1 e 2 obtidos de ovários de abatedouro, que foram maturados in vitro por 24h a 38,5ºC, 5% de CO2. Após a co-incubação dos complexos cumulus ovócitos (COC) com os espermatozoides (16-18 horas), os possíveis zigotos foram distribuídos em quatro tratamentos: T1) Controle (n=616): meio fluido de oviduto sintético (SOF), suplementado com 5% de soro fetal bovino (SFB); T2) L-carnitina (n=648): meio SOF suplementado com 5% de SFB, acrescido de 0,6 mg mL-1de L-carnitina; T3) CLA (n=627): meio SOF suplementado com 5% de SFB, acrescido de 100 μM de trans-10 cis-12 CLA; e T4) L-carnitina+CLA (n=597): meio SOF suplementado com 5% de SFB, acrescido de 0,6 mg mL-1de L-carnitina e 100 μM de trans-10 cis-12 CLA. As taxas de clivagem e blastocisto foram avaliadas no dia 2 e dia 7 de cultivo e, os blastocistos expandidos (Bx) foram armazenados para quantificação de lipídios utilizando o corante Sudan Black B. Os dados de produção de embriões foram analisados pelo teste Chi-quadrado (P<0,05) e os de quantificação de lipídios por análise de variância (ANOVA) (P<0,05). A taxa de clivagem foi semelhante (P>0,05) entre todos os tratamentos (T1=95±4,3; T2=95±3,5; T3=95±3,7 e T4=95±3,1). A taxa de blastocisto foi superior (P<0,05) no grupo controle do que nos demais tratamentos que não diferiram (P>0,05) entre si tanto no D6 (T1=19±2,7; T2=13±2,4; T3=14±2,6 e T4=13±2,6), quanto no D7 (T1=49±3,5; T2=39±3,0; T3=42±3,9 e T4=39±3,9). Não foi observada diferença entre os tratamentos (P>0,05) quanto à velocidade de desenvolvimento, sendo que em todos os grupos a maioria dos embriões de D7 encontravam-se no estágio de blastocisto expandido. Os embriões do T2 apresentaram menor quantidade de lipídios no citoplasma do que os de T1 (P=0,0138) e de T3 (P=0,0261), sendo que os do T4 foram semelhantes (P>0,05) aos demais tratamentos. Os resultados obtidos indicaram que a suplementação com agentes delipidantes não afeta a qualidade, mas afeta negativamente a produção de embriões. Entretanto, a presença de L-carnitina durante o cultivo in vitro (CIV) diminuiu a quantidade de lipídios sugerindo que sua utilização pode resultar em embriões com maior resistência a criopreservação. ________________________________________________________________________________________________ ABSTRACT / Cryopreservation of in vitro produced (IVP) embryosis affected by the high concentrations of lipid droplets that accumulate inside the blastomeres. Therefore, the partial removal of intracytoplasmic lipids by chemical lipolysis stimulation or by decreasing uptake or synthesis of fatty acids by cells can be an alternative to improve cryopreservation of IVP embryos. For that, this study aimed to evaluate the effect of some delipidant agents, L-carnitine and the trans-10 cis-12 isomer conjugated linoleic acid (CLA), during culture on the quantity, quality and lipid content of bovine embryos produced in vitro. A total of 2,448 oocytes graded 1 and 2, obtained from slaughterhouse ovaries were matured in vitro for 24 hours at 38.5 ° C, 5% CO2. After co-incubation (16-18 hours) of sperm and cumulus oocyte complex (COC), the presumptive zygotes were distributed into four treatments: T1) Control (n=616): sinthect oviduct fluid (SOF) medium supplemented with 5% bovine calf serum (FCS); T2) L-carnitine (n=648): SOF medium supplemented with 5% FCS plus 0.6 mg ml-1 of L-carnitine; T3) CLA (n=627): SOF medium supplemented with 5% FCS plus 100 uM trans-10 cis 12 CLA; and T4) L-carnitine + CLA (n=597): SOF medium supplemented with 5% FCS plus 0.6 mg ml-1 of L-carnitine and 100 uM of trans-10 cis-12 CLA. The cleavage and blastocyst rates were evaluated on day 2 and day 7 of culture, and expanded blastocysts (Bx) were stored for lipid quantification by Sudan Black B stain. Embryo production data were analyzed by Chi-square test (P<0.05) and lipids quantification by analysis of variance (ANOVA) (P<0.05). Cleavage rate was similar (P>0.05) among all treatments (T1=95±4.3; T2=95±3.5; T3=95±3.7 e T4=95±3.1). Blastocyst rate was higher (P<0.05) on the control group than the other treatments, wich were similar (P>0.05) among on D6 (T1=19 ± 2.7; T2=13±2.4; T3=14±2.6 and T4=13±2.6) and on D7 (T1=49±3.5; T2=39±3.0; T3=42±3.9 and T4=39±3.9). There was no difference between treatments (P>0.05) on the development speed, and for all treatments the majority of D7 embryos were already on expanded blastocyst stage. Embryos from T2 showed lower cytoplasmic lipids than those from T1 (P=0.0138) and T3 (P=0.0261), being T4 similar to all treatments. The results suggested that supplementation with delipidant agents had not affected quality but had negatively affected embryo production. However, the presence of L-carnitine during in vitro culture (CIV) decreased the amount of lipids, suggesting that its use can result in bovine IVP embryos more resistant to cryopreservation.