Orientadora: Prof. Dra. Marcella Pecora Milazzotto. / Dissertação (mestrado) - Universidade Federal do ABC, Programa de Pós-Graduação em Biotecnociência, 2015. / A morfologia e as taxas de clivagem e de blastocistos têm sido critérios utilizados para avaliação da competência embrionária. Entretanto, com o advento de novas biotecnologias tem-se tornado claro que a competência embrionária pode ser severamente comprometida sem alterações morfológicas perceptíveis. Estudos em embriões humanos propuseram avaliações morfológicas adicionais relacionadas ao momento das primeiras divisões celulares embrionárias (rápida e lenta) que parecem estar relacionadas com a viabilidade do embrião. No entanto, ainda não existem muitos dados dessa análise morfocinética em bovinos. A viabilidade embrionária também pode ser severamente comprometida pelo acúmulo de lipídeos nos embriões PIV, podendo inclusive prejudicar aplicações comerciais como a criopreservação. Com isso, o objetivo desse estudo foi caracterizar em embriões bovinos de cinéticas diferentes de desenvolvimento (rápido e lento) o padrão de metabolismo lipídico. Para tal, embriões produzidos in vitro foram analisados quanto a quantidade de lipídeos totais e caracterização de lipídeos de membrana nos estádios iniciais de clivagem (22hpi e 96hpi) e blastocisto. Para o estádio de blastocisto também foi incluído um grupo de embriões in vivo. Foi possível evidenciar menor quantidade de lipídeos totais pela coloração SUDAN BLACK B nos grupos lentos. As análises de MALDI-MS evidenciaram lipídeos de membrana com padrões distintos nos grupos rápidos e lentos nos estádios de clivagem e mórula. Já nos estádios de blastocistos os dados nos permitem inferir que o grupo de blastocisto lento parece estar mais próximo do grupo in vivo, pela semelhança na abundância/intensidade relativa no maior número de íons revelados pelas análises multivariadas. No entanto, o grupo lento ainda mostra alguma semelhança com o grupo rápido devido a exposição ao mesmo ambiente in vitro. / Embryo viability and competence have been evaluated by criteria such as morphology and cleavage and blastocyst rates. However, the advent and application of new biotechnologies have demonstrated that embryonic competence can be severely compromised without noticeable morphological changes. Human embryo studies proposed the use of additional morphological evaluations related to the moment of the first embryonic cell divisions and its kinetic (fast and slow), which appear to be relevant to the embryo viability. Nevertheless, there are still not enough data available related to the morphokinetic analysis of embryos in bovine cattle. Embryo viability can also be severely compromised by lipid accumulation in IVP (in vitro produced) embryos and can even harm commercial applications such as cryopreservation. Therefore, the aim of this study was to evaluate and characterize the pattern of lipid metabolism on bovine embryos with different developmental kinetics (fast and slow). For this goal, IVP embryos were analyzed considering the lipids total amount and membrane lipids characterization during the cleavage early stages (22hpi and 96hpi) and blastocyst stage. The study also included a group of in vivo embryos at the blastocyst stage. The results, using SUDAN BLACK B staining technique, showed a smaller amount of total lipids in the slow groups. The MALDI-MS analysis results showed different patterns of membrane lipids in the fast and slow groups in the cleavage and morulae stages. The data obtained at the blastocyst stage allow us to infer that the slow group is more similar to the in vivo group, since the results showed similarity in relative quantity/intensity in a greater number of ions revealed by multivariate analysis. However, the slow group still shows some similarity with the fast group due to the exposure to the same in vitro environment.

O presente estudo buscou averiguar a relação de manejos nutricionais diferenciados no terço final de gestação associados ou não ao emprego de gonadotrofinas exógenas no pós-desmame com a manifestação da redução da segunda leitegada em fêmeas suínas. O experimento foi realizado no Laboratório de Pesquisa em Suínos (VNP-FMVZ-USP) Pirassununga/SP. Foram utilizadas 23 marrãs prenhes, sendo empregado o delineamento experimental inteiramente casualizado em arranjo fatorial de tratamentos, sendo um fator o manejo nutricional a partir de 75 &plusmn; 1,74 dias de gestação, fornecendo-se 2,9 kg/dia de ração de pré-lactação (P; 3.203 kcal EM/kg, 17,25% PB) ou 2,5 kg/dia de ração de gestação (G; 2.930 kcal EM/kg, 16,43% PB) e o segundo a aplicação hormonal - 600UI de eCG e, após 72 horas, 2,5mg de LH porcino - no dia do desmame (H) ou não (C). Semanalmente, entre o 82º dia de gestação e o dia do desmame, se averiguou o peso vivo dos animais e colheram-se amostras de sangue para avaliação de parâmetros de bioquímica sanguínea, sendo as fêmeas abatidas 4,55 ± 0,92 dias após a inseminação artificial pós-desmame para colheita e avaliação de embriões. Fêmeas do tratamento P apresentaram maior ganho de peso diário (p<0,050) em três das cinco semanas do terço final de gestação avaliadas, obtendo maior ganho de peso geral entre o 75º dia de gestação e a avaliação pré parto (p<0,001). Na fase de lactação, o tratamento P apresentou maior perda de peso na 1ª (p=0,038) e 3ª (p=0,061) semanas. Não foram observadas diferenças no tocante ao consumo de ração na lactação, desempenho da leitegada ou retorno a atividade reprodutiva pós-desmame. Na avaliação dos embriões, foi observada interação entre os fatores para a variável porcentagem de estruturas fecundadas (p=0,051), obtendo-se valores de 98,55%, 78,97%, 96,88% e 99,09% para GC, GH, PC e PH, respectivamente. Tal resultado sugere uma participação do estado metabólico sobre a resposta à hormonioterapia, devendo estes mecanismos serem objeto de estudos mais específicos. Animais submetidos ao protocolo hormonal apresentaram maior porcentagem de embriões na fase de mórula (p=0,050). As alterações de qualidade embrionária associadas à utilização de gonadotrofinas exógenas podem estar ligadas a mudanças no desenvolvimento folicular, levando a ovulação de oócitos de qualidade inferior e desenvolvimento alterado dos futuros embriões. Animais alimentados com ração de pré-lactação apresentaram maiores níveis de colesterol total e suas frações (HDL, LDL e VLDL) na fase de gestação, ligados à maior ingestão de nutrientes e substratos energéticos, e maiores concentrações de ácidos graxos não esterificados (AGNE) no momento do parto e durante a lactação, associados à maior mobilização de reservas corporais. No contexto experimental apresentado, pode-se inferir que o catabolismo na fase de lactação, quando moderado e acompanhado de maiores reservas no momento do parto, não interferiu significativamente no desempenho reprodutivo pós-desmame. A indução de quadros mais severos de catabolismo lactacional pode contribuir para o esclarecimento dos reflexos deste estado metabólico sobre a atividade reprodutiva de fêmeas suínas. / The present study evaluated the relationship between different nutritional managements in the last third of gestation associated or not with exogenous gonadotropins hormonal protocol at weaning and the manifestation of second litter reduction in female swine. The experiment was carried out in the Laboratory of Swine Research (VNP-FMVZ-USP) Pirassununga/SP. Twenty three (23) pregnant gilts were used in a completely random factorial design, with one factor being the nutritional management from 75 &plusmn; 1,74 days of gestation onward, feeding animals with 2,9 kg/day of a pre-lactation diet (P; 3.203 kcal ME/kg, 17,25% CP) or 2,5 kg/day of a gestation diet (G; 2.930 kcal ME/kg, 16,43% CP), and the second factor being the hormonal protocol 600IU of eCG and, after 72 hours, 2,5mg of porcine LH administration (H) or not (C) at weaning. Weekly, from day 82 of gestation until weaning, body weight were measured and blood samples were collected for determinations of serum bioquimical parameters. Females were slaughtered 4,55 ± 0,92 days after artificial insemination for embryo collection and evaluation. Animals in the P treatment showed higher body weight gains (p<0,050) un three of the five weeks evaluated in the late gestation, obtaining higher overall weight gain between days 75 of gestation and the pre partum evaluation (p<0,001). In the lactation period, treatment P showed higher weight losses in the 1st(p=0,038) and 3rd(p=0,061) weeks. No differences in feed consumption during lactation, litter performance and post weaning return to reproductive activity were observed. In the embryo evaluation, an interaction between factors was observed for the percentage of fecundated structures (p=0,051), with values of 98,55%, 78,97%, 96,88% e 99,09% for GC, GH, PC e PH, respectively. Such result indicates a effect of the metabolic state on the response to the hormonal therapy, with the need of further studying the mechanisms involved. Animals submitted to the hormonal protocol showed a higher percentage of embryos in the morula stage (p=0,050). Changes in embryo quality associated with the administration of exogenous gonadotropins might be linked to shifts in follicular growth, leading to the ovulation of oocites of lower quality and altered future embryo development. Females fed the pre-lactation diet had higher total cholesterol and fractions (HDL, LDL, VLDL) in the gestation period, which is linked to the higher consumption of energy yielding substances, and higher concentrations of non-sterified fatty acids (NEFA) during farrowing and lactation, which are related to more severe fat mobilization. In the context of the present experiment, the catabolism during lactation, when moderate and accompanied by higher body reserves at farrowing, did not significantly interfere with the post-weaning reproductive performance. The induction of more severe catabolic states might contribute to enhance our knowledge on the effects of this metabolic state on the reproductive outcome of sows.

Orientadora: Prof. Dra. Marcela Pecorá Milazzotto / Dissertação (mestrado) - Universidade Federal do ABC, Programa de Pós-Graduação em Biotecnociência, 2016. / Diferenças na tensão de oxigênio durante o cultivo in vitro (CIV) interferem diretamente no desenvolvimento embrionário. O cultivo de embriões em elevada tensão de O2 pode induzir o estresse oxidativo pelo acúmulo de espécies reativas de oxigênio (EROs), afetando negativamente o desenvolvimento inicial por causar alteração na expressão gênica, fragmentação do DNA, interferência nos estado de pluripotência, apoptose, alterações epigenéticas, entre outros fatores que causam danos às células embrionárias. O objetivo desse estudo foi avaliar o efeito de diferentes tensões de oxigênio durante a CIV no desenvolvimento e padrão transcricional de embriões bovinos, avaliando-se os mesmos no estágio de blastocisto e em embriões com 8-16 células, momentos em que a ativação do genoma e reprogramação epigenética aumentam a fragilidade desses embriões. Para esse propósito, embriões bovinos foram produzidos in vitro (PIV) seguindo protocolos convencionais em duas tensões distintas de oxigênio, fisiológica (5%) e atmosférica (20%). Na primeira etapa do trabalho, blastocistos expandidos (BX) foram submetidos à análise de expressão gênica por RT-qPCR pelo Biomark HD System (Fluidigm, US), usando 74 ensaios TaqMan específicos para Bos taurus. A produção embrionária e quantificação de transcritos foram comparadas com a aplicação do Teste-T (=5%). Não houve diferença na taxa de clivagem entre os grupos, mas a taxa de BX foi maior no grupo 5%O2. Diferenças significativas foram observadas em genes relacionados à resposta ao estresse oxidativo, fatores de transcrição dependentes do DNA e relacionados com várias vias funcionais, como desenvolvimento embrionário, pluripotência e diferenciação celular, proliferação celular e apoptose. Para a verificação dos dois últimos efeitos, foi feita a coloração diferencial de BX e contagem do número de células da MCI e TE. O grupo 5%O2 apresentou um maior número total de células, bem como de células da MCI e TE. Foi analisada ainda a concentração de EROs nestes embriões, com uma maior concentração observada nos embriões produzidos em 20% de O2. Na segunda etapa do estudo, foi feita novamente a análise de expressão gênica RT-qPCR pelo Biomark HD System, com o uso de novos ensaios TaqMan, em amostras de embriões sexados de 8-16 células e BX dos dois grupos. Foram observadas diferenças significativas em genes relacionados à resposta ao estresse oxidativo, fatores de transcrição dependentes do DNA e relacionados a mecanismos epigenéticos, nos dois estágios analisados. Considerando os resultados observados nas duas etapas do estudo, podemos concluir que a PIV de embriões bovinos em tensão atmosférica afeta a expressão de genes envolvidos em várias vias da biologia celular embrionária e pode afetar o seu desenvolvimento, qualidade e viabilidade. / Differences in oxygen tension during in vitro culture (IVC) direct impacts the embryo development. Embryo culture in high oxygen (O2) levels can induce oxidative stress through the accumulation of reactive oxygen species (ROS), negatively affecting early embryo development, causing changes in gene expression, DNA fragmentation, interference in pluripotency state, increased apoptosis, among other factors that harm embryo cells. The aim of this study was to evaluate the effect of different O2 tensions during IVC on development and transcriptional status of bovine embryos on blastocysts and 8-16 cells stages, development moments where the genome activation and epigenetic reprogramming increase the fragility of this embryos. For this purpose, bovine embryos were produced in vitro by conventional protocols in two different oxygen tensions, physiological (5%) and atmospheric (20%). In the first phase of this study, expanded blastocysts (BX) were subjected to gene expression analysis by RT-qPCR with Biomark HD System (Fluidigm, San Francisco, CA, US), using 74 TaqMan assays specific for Bos taurus. Embryonic development and quantification of transcripts were compared by Student t-test considering =5%. There was no difference in the cleavage rate between the groups, but the blastocyst rate was higher in the 5% O2 group. A significant difference was observed in genes related to oxidation-reduction processes, DNA-dependent transcription factors and factors related to distinct functional pathways, such as embryo development, pluripotency and cell differentiation, cell proliferation and apoptosis. To verify these last two effects ICM and TE from expanded blastocysts were differentially stained and the number of cells was assessed. The low O2 tension group had a higher number of total cells, as well as TE and ICM cells. DCF staining was also made to evaluate the ROS concentration, with results showing a higher presence of ROS on embryos cultured at 20% O2. In the second phase of the study a new gene expression analysis by RT-qPCR with Biomark HD System was made, using new TaqMan assays, on samples of sexed embryos with 8-16 cells and blastocysts for both groups. Significant differences were observed again in genes related to oxidation-reduction processes, DNA-dependent transcription factors and also in genes related to epigenetic mechanisms in both embryo stages analyzed. Taken together, these results allow us to conclude that the production of IVP embryos at atmospheric O2 tension affects the expression of genes involved in multiple cell biology pathways that can affect embryo development, quality and viability.

O presente estudo buscou averiguar a relação de manejos nutricionais diferenciados no terço final de gestação associados ou não ao emprego de gonadotrofinas exógenas no pós-desmame com a manifestação da redução da segunda leitegada em fêmeas suínas. O experimento foi realizado no Laboratório de Pesquisa em Suínos (VNP-FMVZ-USP) Pirassununga/SP. Foram utilizadas 23 marrãs prenhes, sendo empregado o delineamento experimental inteiramente casualizado em arranjo fatorial de tratamentos, sendo um fator o manejo nutricional a partir de 75 &plusmn; 1,74 dias de gestação, fornecendo-se 2,9 kg/dia de ração de pré-lactação (P; 3.203 kcal EM/kg, 17,25% PB) ou 2,5 kg/dia de ração de gestação (G; 2.930 kcal EM/kg, 16,43% PB) e o segundo a aplicação hormonal - 600UI de eCG e, após 72 horas, 2,5mg de LH porcino - no dia do desmame (H) ou não (C). Semanalmente, entre o 82º dia de gestação e o dia do desmame, se averiguou o peso vivo dos animais e colheram-se amostras de sangue para avaliação de parâmetros de bioquímica sanguínea, sendo as fêmeas abatidas 4,55 ± 0,92 dias após a inseminação artificial pós-desmame para colheita e avaliação de embriões. Fêmeas do tratamento P apresentaram maior ganho de peso diário (p<0,050) em três das cinco semanas do terço final de gestação avaliadas, obtendo maior ganho de peso geral entre o 75º dia de gestação e a avaliação pré parto (p<0,001). Na fase de lactação, o tratamento P apresentou maior perda de peso na 1ª (p=0,038) e 3ª (p=0,061) semanas. Não foram observadas diferenças no tocante ao consumo de ração na lactação, desempenho da leitegada ou retorno a atividade reprodutiva pós-desmame. Na avaliação dos embriões, foi observada interação entre os fatores para a variável porcentagem de estruturas fecundadas (p=0,051), obtendo-se valores de 98,55%, 78,97%, 96,88% e 99,09% para GC, GH, PC e PH, respectivamente. Tal resultado sugere uma participação do estado metabólico sobre a resposta à hormonioterapia, devendo estes mecanismos serem objeto de estudos mais específicos. Animais submetidos ao protocolo hormonal apresentaram maior porcentagem de embriões na fase de mórula (p=0,050). As alterações de qualidade embrionária associadas à utilização de gonadotrofinas exógenas podem estar ligadas a mudanças no desenvolvimento folicular, levando a ovulação de oócitos de qualidade inferior e desenvolvimento alterado dos futuros embriões. Animais alimentados com ração de pré-lactação apresentaram maiores níveis de colesterol total e suas frações (HDL, LDL e VLDL) na fase de gestação, ligados à maior ingestão de nutrientes e substratos energéticos, e maiores concentrações de ácidos graxos não esterificados (AGNE) no momento do parto e durante a lactação, associados à maior mobilização de reservas corporais. No contexto experimental apresentado, pode-se inferir que o catabolismo na fase de lactação, quando moderado e acompanhado de maiores reservas no momento do parto, não interferiu significativamente no desempenho reprodutivo pós-desmame. A indução de quadros mais severos de catabolismo lactacional pode contribuir para o esclarecimento dos reflexos deste estado metabólico sobre a atividade reprodutiva de fêmeas suínas. / The present study evaluated the relationship between different nutritional managements in the last third of gestation associated or not with exogenous gonadotropins hormonal protocol at weaning and the manifestation of second litter reduction in female swine. The experiment was carried out in the Laboratory of Swine Research (VNP-FMVZ-USP) Pirassununga/SP. Twenty three (23) pregnant gilts were used in a completely random factorial design, with one factor being the nutritional management from 75 &plusmn; 1,74 days of gestation onward, feeding animals with 2,9 kg/day of a pre-lactation diet (P; 3.203 kcal ME/kg, 17,25% CP) or 2,5 kg/day of a gestation diet (G; 2.930 kcal ME/kg, 16,43% CP), and the second factor being the hormonal protocol 600IU of eCG and, after 72 hours, 2,5mg of porcine LH administration (H) or not (C) at weaning. Weekly, from day 82 of gestation until weaning, body weight were measured and blood samples were collected for determinations of serum bioquimical parameters. Females were slaughtered 4,55 ± 0,92 days after artificial insemination for embryo collection and evaluation. Animals in the P treatment showed higher body weight gains (p<0,050) un three of the five weeks evaluated in the late gestation, obtaining higher overall weight gain between days 75 of gestation and the pre partum evaluation (p<0,001). In the lactation period, treatment P showed higher weight losses in the 1st(p=0,038) and 3rd(p=0,061) weeks. No differences in feed consumption during lactation, litter performance and post weaning return to reproductive activity were observed. In the embryo evaluation, an interaction between factors was observed for the percentage of fecundated structures (p=0,051), with values of 98,55%, 78,97%, 96,88% e 99,09% for GC, GH, PC e PH, respectively. Such result indicates a effect of the metabolic state on the response to the hormonal therapy, with the need of further studying the mechanisms involved. Animals submitted to the hormonal protocol showed a higher percentage of embryos in the morula stage (p=0,050). Changes in embryo quality associated with the administration of exogenous gonadotropins might be linked to shifts in follicular growth, leading to the ovulation of oocites of lower quality and altered future embryo development. Females fed the pre-lactation diet had higher total cholesterol and fractions (HDL, LDL, VLDL) in the gestation period, which is linked to the higher consumption of energy yielding substances, and higher concentrations of non-sterified fatty acids (NEFA) during farrowing and lactation, which are related to more severe fat mobilization. In the context of the present experiment, the catabolism during lactation, when moderate and accompanied by higher body reserves at farrowing, did not significantly interfere with the post-weaning reproductive performance. The induction of more severe catabolic states might contribute to enhance our knowledge on the effects of this metabolic state on the reproductive outcome of sows.

<p>Infertility is the disease of the reproductive system and is estimated to affect more than 10% of the people of reproductive age. Assisted reproductive technologies (ART) are methods designed to alleviate infertility problems. <i>In vitro </i>embryo production is part of most infertility treatments and the efficiency of ART is low due to the lack of reliable methods to measure embryo viability. In order to improve the success rate of ART procedures, the current study was designed to investigate the use of an optical analyzer technology known as the Biodynamic Imaging (BDI) system for viability assessment. BDI is a novel approach that is able to measure intracellular dynamic processes that are directly related to functional events. During a series of experiments, 13 different biomarkers of oocytes and embryos were monitored by the BDI microscope and used for machine learning and evaluation of BDI sensitivity. We monitored cellular mechanisms essential for proper embryo development such as (1) extrusion of first and second polar body (2) energy status and mitochondrial activity, and (3) viability of embryos with different cellular composition. We were able to identify several biomarkers that have the potential to indicate viability: (1) slope, (2) NSD, (3) Knee (4) Floor, and (5) R² could consistently differentiate between oocytes and embryos of different viability. In addition, the BDI microscope could successfully predict the energy status of embryos by identifying 4 biomarkers (Slope, Knee, Floor, and Dy). Finally, a lipidomic analysis was done to evaluate the lipid composition of oocytes with different cytoplasm integrities. This analysis demonstrated that there is a difference in lipid subclasses among oocytes with dark vs. light cytoplasm. The results indicate that the BDI is useful for viability assessment of oocytes and embryos and may be helpful for the improvement of the efficiency of assisted reproductive technologies.</p>