Sabe-se que o sistema canabinóide endógeno está envolvido com os processos de formação e evocação da memória. Agonistas dos receptores CB1 exibem diferentes efeitos conforme a via de infusão, seja ela sistêmica, seja local, atingindo estruturas específicas do encéfalo. Neste estudo pretendemos estabelecer o perfil farmacológico-comportamental e eletrofisiológico do agonista CP55,940 quando administrado no hipocampo dorsal de ratos, estrutura em que há poucos estudos prévios com este fármaco: diferente de outros agonistas como a WIN55,212 e mesmo a pouco seletiva anandamida, o CP55,940 restringe-se a receptores canabinóides e chega a ser mais potente que o Δ9-THC, embora não discrimine entre os receptores CB1 (central) e CB2 (periférico). Os fármacos foram infundidos bilateralmente, em diferentes concentrações, na área CA1 do hipocampo, imediatamente após o treino ou antes do teste na tarefa de Condicionamento Aversivo ao Contexto (CAC), visando estudar seus efeitos, respectivamente, na consolidação e na evocação da memória. A CP55,940 pós-treino foi amnéstica apenas na concentração de 5 μg/μl, e esse efeito foi revertido pelo antagonista AM251, seletivo para CB1, em concentração sem efeito próprio, comprovando tal efeito dever-se à ação sobre os receptores CB1. O mesmo efeito foi observado 24h após o treino, na infusão pré-teste, se bem que agora a CP55,940 foi efetiva também em concentrações mais baixas, sugerindo que os receptores desse sistema endógeno tenham ficado mais sensíveis a seus ligantes em função do aprendizado; a seletividade por CB1 neste caso, porém, não ficou claramente atestada pois o efeito de 5 μg/μl de CP55,940 só foi revertido com uma concentração maior de AM251. Na eletrofisiologia, uma concentração de CP55,940 comparável à efetiva sobre a CAC (10μM), não foi capaz de inibir a indução da LTP, já que a potenciação só se sustentou por cerca de 30min – não passou de uma LTP. Esses resultados reforçam e diversificam estudos anteriores, inclusive de nosso grupo, que comprovam a participação dos receptores CB1 na formação e/ou evocação de novas memórias aversivas, bem como possíveis alterações plásticas na densidade desses receptores em função da experiência cognitiva, embora não necessariamente mediadas por eventos sinápticos plásticos como a LTP. / The endogenous cannabiboid system is known to be involved memory formation and retrieval processes. CB1 agonists may cause different effects according to the administration pathway, be it systemic or local/intrastructure. Here we try to establish the behavioral-pharmacologic and electrophysiologic profile of the agonist CP55,940 infused into the rat dorsal hippocampus, a structure less studied with this drug: different from other agonists such as WIN55,212 or even the poorly selective anandamida, CP55,940 sticks only to cannabinoid receptors and is more potent than Δ9-THC, but does not distinguish between central CB1 and peripherical CB2 receptors. The drug was infused bilaterally in different concentrations into the CA1 area of the hippocampus, right after training or pre-test in the Context Fear Conditioning (CFC) task, in order to study its effects upon memory consolidation and retrieval, respectively. Post-training CP55,940 was amnestic only at 5 μg/μl, and the CB1-selective antagonist AM251 reverted this effect in a concentration without action per se, which proves that the original effect is mediated by CB1 receptors. The same amnestic effect was observed 24h after training, in the pretest infusion, only that now CP55,940 was affective also with lower concentrations, suggesting that these receptors are now more sensitive to its endogenous ligands due to learning; CB1-selectivity, however, is not clearly proven here since 5 μg/μl of CP55,940 was reverted only by a higher concentration of AM251. In electrophysiology, a concentration of CP55,940 compatible with that found effective upon CFC (10μM), was not able to block LTP induction, since the potentiation was not sustained for more than 30min – it was only a STP. These results teinforce and diversify previous findings, including some from our own lab, that prove the involvement of CB1 receptors in memory consolidation and/or recall, as well as possible plastic changes in receptor density due to the cognitive experience, despite not necessarily mediated by plastic synaptic events such as LTP.

Sabe-se que o sistema canabinóide endógeno está envolvido com os processos de formação e evocação da memória. Agonistas dos receptores CB1 exibem diferentes efeitos conforme a via de infusão, seja ela sistêmica, seja local, atingindo estruturas específicas do encéfalo. Neste estudo pretendemos estabelecer o perfil farmacológico-comportamental e eletrofisiológico do agonista CP55,940 quando administrado no hipocampo dorsal de ratos, estrutura em que há poucos estudos prévios com este fármaco: diferente de outros agonistas como a WIN55,212 e mesmo a pouco seletiva anandamida, o CP55,940 restringe-se a receptores canabinóides e chega a ser mais potente que o Δ9-THC, embora não discrimine entre os receptores CB1 (central) e CB2 (periférico). Os fármacos foram infundidos bilateralmente, em diferentes concentrações, na área CA1 do hipocampo, imediatamente após o treino ou antes do teste na tarefa de Condicionamento Aversivo ao Contexto (CAC), visando estudar seus efeitos, respectivamente, na consolidação e na evocação da memória. A CP55,940 pós-treino foi amnéstica apenas na concentração de 5 μg/μl, e esse efeito foi revertido pelo antagonista AM251, seletivo para CB1, em concentração sem efeito próprio, comprovando tal efeito dever-se à ação sobre os receptores CB1. O mesmo efeito foi observado 24h após o treino, na infusão pré-teste, se bem que agora a CP55,940 foi efetiva também em concentrações mais baixas, sugerindo que os receptores desse sistema endógeno tenham ficado mais sensíveis a seus ligantes em função do aprendizado; a seletividade por CB1 neste caso, porém, não ficou claramente atestada pois o efeito de 5 μg/μl de CP55,940 só foi revertido com uma concentração maior de AM251. Na eletrofisiologia, uma concentração de CP55,940 comparável à efetiva sobre a CAC (10μM), não foi capaz de inibir a indução da LTP, já que a potenciação só se sustentou por cerca de 30min – não passou de uma LTP. Esses resultados reforçam e diversificam estudos anteriores, inclusive de nosso grupo, que comprovam a participação dos receptores CB1 na formação e/ou evocação de novas memórias aversivas, bem como possíveis alterações plásticas na densidade desses receptores em função da experiência cognitiva, embora não necessariamente mediadas por eventos sinápticos plásticos como a LTP. / The endogenous cannabiboid system is known to be involved memory formation and retrieval processes. CB1 agonists may cause different effects according to the administration pathway, be it systemic or local/intrastructure. Here we try to establish the behavioral-pharmacologic and electrophysiologic profile of the agonist CP55,940 infused into the rat dorsal hippocampus, a structure less studied with this drug: different from other agonists such as WIN55,212 or even the poorly selective anandamida, CP55,940 sticks only to cannabinoid receptors and is more potent than Δ9-THC, but does not distinguish between central CB1 and peripherical CB2 receptors. The drug was infused bilaterally in different concentrations into the CA1 area of the hippocampus, right after training or pre-test in the Context Fear Conditioning (CFC) task, in order to study its effects upon memory consolidation and retrieval, respectively. Post-training CP55,940 was amnestic only at 5 μg/μl, and the CB1-selective antagonist AM251 reverted this effect in a concentration without action per se, which proves that the original effect is mediated by CB1 receptors. The same amnestic effect was observed 24h after training, in the pretest infusion, only that now CP55,940 was affective also with lower concentrations, suggesting that these receptors are now more sensitive to its endogenous ligands due to learning; CB1-selectivity, however, is not clearly proven here since 5 μg/μl of CP55,940 was reverted only by a higher concentration of AM251. In electrophysiology, a concentration of CP55,940 compatible with that found effective upon CFC (10μM), was not able to block LTP induction, since the potentiation was not sustained for more than 30min – it was only a STP. These results teinforce and diversify previous findings, including some from our own lab, that prove the involvement of CB1 receptors in memory consolidation and/or recall, as well as possible plastic changes in receptor density due to the cognitive experience, despite not necessarily mediated by plastic synaptic events such as LTP.

Os endocanabinóides (ECs) são neuromoduladores lipídicos que são produzidos por demanda tendo ação retrógrada. Existem duas moléculas que são atualmente reconhecidos como os principais ECs, a anandamida (AEA) e 2-araquidonoilglicerol (2-AG). O hipocampo sintetiza endocanabinóides e expressa seus receptores (CB1, CB2, TRPV1).Existe uma discrepância de efeitos dos 2 endocanabinóides na potenciação á longo prazo (LTP) hipocampal que pode ser um resultado da AEA agir tanto em receptores CB1 quanto em receptores TRPV1.Tendo em vista que a ativação dos receptores TRPV1 potenciam a LTP hipocampal, e não a inibem como é observado com a AEA, então qual seria o mecanismo de ação da AEA em inibir a LTP? Seria possível que a AEA estivesse preferencialmente inibindo a produção de 2-AG e assim inibindo a LTP? Para testar essa hipótese usamos inibidores farmacológicos da degradação hidrolítica do 2-AG e da AEA e também usamos antagonistas dos receptores TRPV1 e um animal knock-out para o receptor TRPV1. Camundongos machos BlackC57 e knockout(KO) para TRPV1 com idade entre 35 a 49 dias foram utilizados para obtenção de fatias do hipocampo (400µm), e a potenciação a longo prazo na via Schaffer-CA1 estudada. Não observamos efeito dos inibidores da degradação hidrolítica e oxidative dos endocanabinóides na LTP. A LTP do camundongo knock-out era inibida, porem o antagonismo farmacológico dos receptores TRPV1 não minetizou esse efeito. Já o agonista dos receptors canabinóides WIN55212-2 inibiu a indução da LTP. Concluimos que o aumento dos endocanabinóides pela inibição da sua degradação não foi eficiente em alterar a LTP hippocampal em nosso modelo experimental. Aprovação do CONCEA-FMRP- nº008/2017 / Endocannabinoids (ECs) are lipid neuromodulators that are produced on demand having retrograde action. There are two molecules that are currently recognized as the major ECs, anandamide (AEA) and 2-arachidonoylglycerol (2-AG). The hippocampus synthesizes endocannabinoids and expresses their receptors (CB1, CB2, TRPV1). There is a discrepancy of endocannabinoid effects on hippocampal long term potentiation (LTP) which may be a result of AEA acting on both CB1 and TRPV1 receptors. Given that the activation of TRPV1 receptors potentiate hippocampal LTP, and do not inhibit it as observed with AEA, then what would be the mechanism of action of AEA in inhibiting LTP? Was it possible that AEA was preferentially inhibiting 2-AG production and thus inhibiting LTP? To test this hypothesis, we used pharmacological inhibitors of the hydrolytic degradation of 2-AG and AEA and also used TRPV1 receptor antagonists and a knock-out animal for the TRPV1 receptor. Male BlackC57 mice and TRPV1 knockout (KO) aged 35 to 49 days were used to obtain hippocampal slices (400 ?m), and the long-term potentiation in the Schaffer-CA1 pathway studied). The LTP of the knock-out mouse was inhibited, but the pharmacological antagonism of TRPV1 receptors did not mimic this effect, whereas the WIN55212-2 cannabinoid receptor agonist inhibited the induction of LTP. We conclude that increasing the levels of endocannabinoids by inhibiting their degradation was not efficient in altering hippocampal LTP in our experimental model Approval of CONCEA-FMRP- nº 008/2017

A anandamida, um dos principais endocanabinóides estudados, além de se ligar aos receptores CB1, em altas doses, também é capaz de ativar os receptores vanilóides de potencial transitório tipo-1 (TRPV1). Evidências experimentais indicam que a sinalização mediada por CB1 facilita, enquanto TRPV1 prejudica, a resposta de adaptação a situações de estresse, tornando o animal mais susceptível a suas consequências comportamentais. Estudos demonstram que a inibição da enzima amida hidrolase de ácidos graxos (FAAH), responsável pela hidrólise da anandamida, apresenta efeito tipo-antidepressivo, efeito este também observado quando administrado antagonista de TRPV1. Portanto, a ação combinada de inibição da FAAH e bloqueio de TRPV1 poderia ter potencial efeito antidepressivo. Diante destas evidências, o objetivo do presente trabalho foi investigar se a administração sistêmica de AA-5HT, droga que inibe a FAAH e bloqueia TRPV1, em camundongos submetidos ao teste do nado forçado, promove um efeito tipo-antidepressivo; e ainda, se esse comportamento estaria relacionado com a ativação de receptores canabinóides CB1 e com bloqueio dos receptores vanilóides TRPV1. Camundongos Swiss machos receberam injeção intraperitoneal de AA-5HT (0.1, 0.3, e 1 mg/kg), inibidor da FAAH (URB597 - 0.03, 0.1, 0.3, 1, e 3 mg/kg), antagonista TRPV1 (SB366791 - 0.03, 0.1, 0.3, 1 e 3 mg/kg) e antagonista CB1 (AM251 - 1 e 3 mg/kg) ou o veículo correspondente e, 30 minutos depois, os mesmos animais foram submetidos ao teste do campo aberto. Imediatamente após foram submetidos ao teste do nado forçado. O tratamento com AA-5HT na dose de 0.3mg/kg reduziu significativamente o tempo de imobilidade no teste do nado forçado, sem alterar a atividade locomotora. Por outro lado, as doses testadas de URB597, SB366791 e AM251 não reduziram significativamente o tempo de imobilidade quando comparadas ao grupo veículo. E ainda, não foi observada somação de efeito da coadministração de doses equipotentes e subefetivas de SB366791 e URB597 no teste do nado forçado. Por fim, a pré-administração do antagonista CB1 (AM251) não alterou o tempo de imobilidade de AA-5HT. Apesar disso, quando o AA-5HT foi pré-administrado com o veículo utilizado para diluir o AM251, apresentou aumento significativo no tempo de imobilidade quando comparado aos animais pré-tratados com salina, comprometendo assim a investigação sobre a participação dos receptores CB1 no efeito do AA-5HT. Sendo assim, nossos resultados sugerem que a administração sistêmica de AA-5HT produz um efeito tipo-antidepressivo no teste do nado forçado. Entretanto, mais estudos são necessários para avaliar o envolvimento dos receptores CB1 neste comportamento. / Anandamide, one of the most studied endocannabinoids, acts through interaction with CB1 cannabinoids receptors, and, in higher doses, activate TRPV1 receptor. Experimental evidence shows that CB1-mediated signaling improve, while TRPV1-signaling impairs the adaptative response to stressful situations, thus increasing the susceptibility to behavioral consequences. The administration of inhibitors of fatty acid amide hydrolase (FAAH), responsible for anandamide hydrolysis, exerts antidepressant-like effects in preclinical models. The same effect is observed when TRPV1 antagonist is administered. Therefore, the combined blockade of FAAH and TRPV1 could potentially represent an interesting pharmacological tool to induce antidepressant effects. Based on that, the aim of this study was to investigate if AA-5HT, a FAAH inhibitor and TRPV1 blocker, would induce antidepressant-like effect in mice, and to evaluate the participation of TRPV1 and CB1 receptors in this effect. Male Swiss mice received an intraperitoneal injection of AA-5HT (0.1, 0.3, e 1 mg/kg), FAAH inhibitor (URB597 - 0.03, 0.1, 0.3, 1, e 3 mg/kg), TRPV1 antagonist (SB366791 - 0.03, 0.1, 0.3, 1 e 3 mg/kg) and CB1 antagonist (AM251 - 1 e 3 mg/kg) or the corresponding vehicle and, 30 minutes later, they were individually submitted to the open field test. Immediately after this, the same animal was submitted to the forced swimming test. Our results showed that the treatment with AA-5HT at dose 0,3mg/kg significantly reduced the immobility time in the forced swim test without changing the locomotor activity. On the other hand, the tested dose range of URB597, SB366791 e AM251 did not significantly reduced the immobility time when compared to vehicle group. Furthermore, there was no observed effect of the coadministration of equipotent and sub-effective doses of SB366791 and URB597 on forced swim test. Finally, pre-administration of the CB1 antagonist (AM251) did not alter the immobility time of AA-5HT. However, when AA-5HT was pre-administered with the vehicle used to dilute AM251, it showed a significant increase in immobility time when compared to animals pretreated with saline, thus compromising the study about the participation of CB1 receptors in the effect of AA-5HT. Thus, our results suggest systemic administration of AA-5HT produces an antidepressant-like effect on FST. However, further studies are needed to evaluate the involvement of CB1 receptors in this behavior.

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Treatment with antipsychotic drugs may cause tardive dyskinesia in humans and orofacial dyskinesia in rodents. Although the dopaminergic system in basal ganglia has been implicated in these movement disorders, their underlying mechanisms remain unclear. In recent years, the identification of high density of CB1 cannabinoid receptors within the basal ganglia has suggested a potential role for endocannabinoids in the control of basal ganglia-related movement disorders. Thus, the present study aimed to investigate whether CB1 receptors are involved in haloperidol-induced orofacial dyskinesia in rats. Adult male rats were treated with haloperidol decanoate (38 mg/kg, i.m., single administration). After 24 days, the animals were submitted to stereotaxic surgery for insertion of cannulas on right ventricle. After recovery, the effect of anandamide (6 nmol, i.c.v.) and/or the CB1 receptor antagonist SR141716A (30 μg, i.c.v.) on haloperidol-induced VCMs was assessed. Anandamide reversed haloperidol-induced VCMs. SR141716A (30 μg, i.c.v.) did not alter haloperidol-induced VCM per se, but prevented the effect of anandamide on VCM in rats. In conclusion, our results show that activation of CB1 receptor may prevent haloperidol-induced VCMs in rats, implicating cannabinoid signaling via CB1 receptor in orofacial dyskinesia. / O tratamento com antipsicóticos pode causar discinesia tardia em humanos e discinesia orofacial em roedores. Embora a via dopaminérgica nigroestriatal tem sido implicada nestas alterações motoras, seus mecanismos continuam não completamente esclarecidos. Recentemente, a identificação da alta densidade de receptores canabinóides (CB1) nos gânglios da base tem sugerido que os canabinoides possuem um papel importante no controle das desordens de movimento. Desta forma, o objetivo do presente estudo foi investigar se os receptores CB1 estão envolvidos na discinesia orofacial induzida por haloperidol em ratos. Ratos machos adultos receberam decanoato de haloperidol (38 mg/kg, i.m., administração única). Após 24 dias os mesmos foram submetidos a cirurgia estereotáxica para a implantação de cânula no ventrículo direito. Após um período de recuperação, o efeito da anandamida (agonista canabinóide) (6 nmol, i.c.v.) e/ou do antagonista do receptor CB1, SR141716A (30 μg, i.c.v.), sobre os MMVs foi analisado. A anandamida reverteu os MMVs induzidos por haloperidol. O SR141716A (30 μg, i.c.v.) per se não alterou os MMVs induzidos por haloperidol, mas preveniu o efeito da anandamida sobre os MMVs em ratos. Em conclusão, nossos resultados mostram que a ativação dos receptores CB1 pode prevenir os MMVs induzidos por haloperidol em ratos, sugerindo a participação da sinalização canabinóide via receptor CB1 na discinesia orofacial.

Esta tese foi dividida em três capítulos. O capítulo I descreve o desenvolvimento do método Column switching UHPLC-MS/MS para a determinação simultaneamente de fármacos psicotrópicos em amostras de plasma de pacientes esquizofrênicos. A politerapia é uma prática comum no tratamento da esquizofrenia. Portanto, a monitorização terapêutica destes fármacos tem sido realizada para o ajuste das doses e individualização da terapia farmacológica. O método Column switching UHPLC-MS/MS apresentou linearidade na faixa de concentração de 0,025 a 1,25 ng mL-1 com R2 acima de 0,9950 e a falta de teste de ajuste (p > 0,05); precisão com coeficientes de variação inferiores a 12% e exatidão com erro padrão relativo inferior a 14%. Este método foi aplicado com sucesso para determinação de fármacos em amostras de plasma de pacientes esquizofrênicos para fins de monitorização terapêutica. No capítulo II, o desempenho cromatográfico de colunas C18 superficialmente e totalmente porosas com diferentes tamanhos de partícula foi avaliado para a análise de fármacos psicotrópicos por LC-MS/MS e LC-DAD. Com o sistema LC-MS/MS foram avaliados os seguintes parâmetros cromatográficos: altura do prato reduzido vs velocidade linear reduzida, impedância vs velocidade linear reduzida, tempo da corrida cromatográfica vs vazão, pressão vs vazão, resolução, capacidade de pico, assimetria e fator de retenção. Já com o sistema LC-DAD foram avaliados a hidrofobicidade, atividade silanol e impurezas metálicas também foram avaliadas. As colunas com superfície carregada apresentaram maior eficiência cromatográfica para os fármacos em sua forma ionizada. Já as colunas com partículas menores que 2 µm (Cortecs 1,6 µm, Acquity 1,7 µm, e Kinetex 1,7 µm) apresentaram maior eficiência cromatográfica para os fármacos na forma parcialmente ionizada. Os modelos matemáticos gerados foram capazes de prever a pressão e o tempo da corrida cromatográfica em diferentes vazões para todas as colunas. Considerando a eficiência, impedância, resolução, capacidade de pico, fator de retenção e hidrofobicidade, as colunas Cortecs 1,6 µm e Acquity 1,7 µm apresentaram melhor desempenho durante a análise dos fármacos em amostra de plasma. O capítulo III descreve o desenvolvimento e validação dos métodos SPME-UHPLC-MS/MS e Bio-SPME-Nano-ESI-MS/MS para a determinação dos endocanabinóides (AEA e 2-AG) em amostras biológicas. Para a otimização do processo SPME foram avaliadas as fases SPME (C18, C30 e HLB) e os solventes para dessorção (metanol, acetonitrila e isopropanol). Os aditivos modificadores de matriz, como cloridrato de guanidina, ácido trifluoroacético e acetonitrila foram avaliados por planejamento experimental. Os métodos SPME-UHPLC-MS/MS e Bio-SPME-Nano-ESI-MS/MS, com a fase HLB biocompatível, apresentaram para ambos endocanabinóides valores de LOQs de 1 ng mL-1 e 50 ng mL-1, respectivamente. O método Bio-SPME-Nano-ESI-MS/MS permitiu o direto acoplamento da fibra SPME ao espectrômetro de massas via dessorção/ionização nanoeletrospray que resultou em rápida determinação quantitativa dos endocanabinóides em amostras biológicas. / This thesis is divided into three chapters. Chapter I describes the development of a column switching UHPLCMS/MS method to determine psychotropic drugs in schizophrenic patients plasma samples simultaneously. Polytherapy is a common practice in schizophrenia treatment. Therefore, therapeutic drug monitoring has been applied to adjust doses and to customize pharmacological therapy. The column switching UHPLCMS/MS method developed here is linear at concentrations ranging from 0.025 to 1.25 ng mL-1 with R2 above 0.9950 and presents lack of fit test (p > 0.05), precision with coefficients of variation lower than 12%, and accuracy with relative standard error lower than 14%. This method was successfully applied to determine drugs in schizophrenic patients plasma samples for therapeutic drug monitoring. In chapter II, the chromatographic performance of C18 superficially porous columns and of C18 fully porous columns with different particle sizes were evaluated for analysis of psychotropic drugs by LC-MS/MS and LC-DAD. Within the LC-MS/MS system, the following chromatographic parameters were assessed: reduced plate height vs reduced linear velocity, impedance vs reduced linear velocity, chromatographic run time vs flow rate, backpressure vs flow rate, resolution, peak capacity, asymmetry, and retention factor. Within the LC-DAD system, hydrophobicity, silanol activity, and metal impurities were also examined. Columns with charged surface displayed improved chromatographic efficiency for drugs in the ionized form. Columns with particles smaller than 2 µm (Cortecs 1.6 µm, Acquity 1.7 µm, and Kinetex 1.7 µm) presented higher chromatographic efficiency for the drugs, which were in their partially ionized form. The generated mathematical models were able to predict the backpressure and the chromatographic run time at different flow rates for all the columns. Considering efficiency, impedance, resolution, peak capacity, retention factor, and hydrophobicity, columns Cortecs 1.6 µm and Acquity 1.7 µm provided the best performance during analysis of drugs in plasma samples. Chapter III describes the development and validation of the SPME-UHPLC-MS/MS and the Bio-SPME-Nano-ESI-MS/MS methods for determination of endocannabinoids (AEA and 2-AG) in biological samples. To optimize the SPME process, SPME coatings (C18, C30, and HLB) and solvents for desorption (methanol, acetonitrile, and isopropanol) were evaluated. Matrix modifier additives, such as guanidine hydrochloride, trifluoroacetic acid, and acetonitrile, were assessed by experimental design. The SPME-UHPC-MS/MS and the Bio-SPME-Nano-ESI-MS/MS methods with HLB biocompatible coating provided LOQ values of 1 ng mL-1 and 50 ng mL-1, respectively, for both endocannabinoids. The Bio-SPME-Nano-ESI-MS/MS method allowed direct coupling of SPME fibers to the mass spectrometer by desorption/ionization nanoelectrospray, which resulted in rapid quantitative determinations of endocannabinoids in biological samples.

Esta tese foi dividida em três capítulos. O capítulo I descreve o desenvolvimento do método Column switching UHPLC-MS/MS para a determinação simultaneamente de fármacos psicotrópicos em amostras de plasma de pacientes esquizofrênicos. A politerapia é uma prática comum no tratamento da esquizofrenia. Portanto, a monitorização terapêutica destes fármacos tem sido realizada para o ajuste das doses e individualização da terapia farmacológica. O método Column switching UHPLC-MS/MS apresentou linearidade na faixa de concentração de 0,025 a 1,25 ng mL-1 com R2 acima de 0,9950 e a falta de teste de ajuste (p > 0,05); precisão com coeficientes de variação inferiores a 12% e exatidão com erro padrão relativo inferior a 14%. Este método foi aplicado com sucesso para determinação de fármacos em amostras de plasma de pacientes esquizofrênicos para fins de monitorização terapêutica. No capítulo II, o desempenho cromatográfico de colunas C18 superficialmente e totalmente porosas com diferentes tamanhos de partícula foi avaliado para a análise de fármacos psicotrópicos por LC-MS/MS e LC-DAD. Com o sistema LC-MS/MS foram avaliados os seguintes parâmetros cromatográficos: altura do prato reduzido vs velocidade linear reduzida, impedância vs velocidade linear reduzida, tempo da corrida cromatográfica vs vazão, pressão vs vazão, resolução, capacidade de pico, assimetria e fator de retenção. Já com o sistema LC-DAD foram avaliados a hidrofobicidade, atividade silanol e impurezas metálicas também foram avaliadas. As colunas com superfície carregada apresentaram maior eficiência cromatográfica para os fármacos em sua forma ionizada. Já as colunas com partículas menores que 2 µm (Cortecs 1,6 µm, Acquity 1,7 µm, e Kinetex 1,7 µm) apresentaram maior eficiência cromatográfica para os fármacos na forma parcialmente ionizada. Os modelos matemáticos gerados foram capazes de prever a pressão e o tempo da corrida cromatográfica em diferentes vazões para todas as colunas. Considerando a eficiência, impedância, resolução, capacidade de pico, fator de retenção e hidrofobicidade, as colunas Cortecs 1,6 µm e Acquity 1,7 µm apresentaram melhor desempenho durante a análise dos fármacos em amostra de plasma. O capítulo III descreve o desenvolvimento e validação dos métodos SPME-UHPLC-MS/MS e Bio-SPME-Nano-ESI-MS/MS para a determinação dos endocanabinóides (AEA e 2-AG) em amostras biológicas. Para a otimização do processo SPME foram avaliadas as fases SPME (C18, C30 e HLB) e os solventes para dessorção (metanol, acetonitrila e isopropanol). Os aditivos modificadores de matriz, como cloridrato de guanidina, ácido trifluoroacético e acetonitrila foram avaliados por planejamento experimental. Os métodos SPME-UHPLC-MS/MS e Bio-SPME-Nano-ESI-MS/MS, com a fase HLB biocompatível, apresentaram para ambos endocanabinóides valores de LOQs de 1 ng mL-1 e 50 ng mL-1, respectivamente. O método Bio-SPME-Nano-ESI-MS/MS permitiu o direto acoplamento da fibra SPME ao espectrômetro de massas via dessorção/ionização nanoeletrospray que resultou em rápida determinação quantitativa dos endocanabinóides em amostras biológicas. / This thesis is divided into three chapters. Chapter I describes the development of a column switching UHPLCMS/MS method to determine psychotropic drugs in schizophrenic patients plasma samples simultaneously. Polytherapy is a common practice in schizophrenia treatment. Therefore, therapeutic drug monitoring has been applied to adjust doses and to customize pharmacological therapy. The column switching UHPLCMS/MS method developed here is linear at concentrations ranging from 0.025 to 1.25 ng mL-1 with R2 above 0.9950 and presents lack of fit test (p > 0.05), precision with coefficients of variation lower than 12%, and accuracy with relative standard error lower than 14%. This method was successfully applied to determine drugs in schizophrenic patients plasma samples for therapeutic drug monitoring. In chapter II, the chromatographic performance of C18 superficially porous columns and of C18 fully porous columns with different particle sizes were evaluated for analysis of psychotropic drugs by LC-MS/MS and LC-DAD. Within the LC-MS/MS system, the following chromatographic parameters were assessed: reduced plate height vs reduced linear velocity, impedance vs reduced linear velocity, chromatographic run time vs flow rate, backpressure vs flow rate, resolution, peak capacity, asymmetry, and retention factor. Within the LC-DAD system, hydrophobicity, silanol activity, and metal impurities were also examined. Columns with charged surface displayed improved chromatographic efficiency for drugs in the ionized form. Columns with particles smaller than 2 µm (Cortecs 1.6 µm, Acquity 1.7 µm, and Kinetex 1.7 µm) presented higher chromatographic efficiency for the drugs, which were in their partially ionized form. The generated mathematical models were able to predict the backpressure and the chromatographic run time at different flow rates for all the columns. Considering efficiency, impedance, resolution, peak capacity, retention factor, and hydrophobicity, columns Cortecs 1.6 µm and Acquity 1.7 µm provided the best performance during analysis of drugs in plasma samples. Chapter III describes the development and validation of the SPME-UHPLC-MS/MS and the Bio-SPME-Nano-ESI-MS/MS methods for determination of endocannabinoids (AEA and 2-AG) in biological samples. To optimize the SPME process, SPME coatings (C18, C30, and HLB) and solvents for desorption (methanol, acetonitrile, and isopropanol) were evaluated. Matrix modifier additives, such as guanidine hydrochloride, trifluoroacetic acid, and acetonitrile, were assessed by experimental design. The SPME-UHPC-MS/MS and the Bio-SPME-Nano-ESI-MS/MS methods with HLB biocompatible coating provided LOQ values of 1 ng mL-1 and 50 ng mL-1, respectively, for both endocannabinoids. The Bio-SPME-Nano-ESI-MS/MS method allowed direct coupling of SPME fibers to the mass spectrometer by desorption/ionization nanoelectrospray, which resulted in rapid quantitative determinations of endocannabinoids in biological samples.