Orientador: Carla Beatriz Collares Buzato / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-13T09:31:49Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Carvalho_CarolinaPradodeFranca_D.pdf: 11012408 bytes, checksum: 13da099b8bd43a93f7783c961a08d48f (MD5) Previous issue date: 2009 / Resumo: O objetivo central dessa tese foi estudar o papel das junções comunicantes (GJs) no processo de maturação da célula B e na patogênese da diabetes tipo 2. Para isso, foram utilizados dois modelos animais. No modelo in vivo de maturação da célula B e do processo secretório de insulina foram empregados ratos em vários estágios do desenvolvimento (fetal, neonatal, jovem e adulto). No modelo de diabetes tipo 2 foram utilizados camundongos C57BL/6, wild-type e knockout para o gene do receptor de LDL (LDLR -/-), alimentados com dieta hiperlipídica. No primeiro modelo de estudo, observamos, por técnicas morfológicas (imunocitoquímica) e de biologia molecular (Western Blot, RT-PCR semi-quantitativo e qPCR) que a expressão gênica e protéica de Cx36 e Cx43, se altera durante o desenvolvimento. Os dados de microinjeção intracelular de traçadores confirmam tais resultados que sugerem que ilhotas de ratos recém-nascidos apresentam menor número de canais intercelulares associados à membrana e, conseqüentemente, um menor acoplamento intercelular mediado pelas junções comunicantes em comparação às ilhotas de adultos. Esses resultados estão de acordo com a observação de que a célula B durante o período perinatal mostra uma menor resposta secretória à glicose e sugerem a participação da comunicação intercelular mediada pelas junções comunicantes no processo de maturação da célula B. No caso do modelo in vivo de diabetes tipo 2, o estudo iniciou com a caracterização do quadro metabólico e de aspectos da morfologia e morfometria do pâncreas endócrino de animais submetidos ao tratamento com a dieta hiperlipídica. Os dados obtidos demonstram que os animais submetidos a essa dieta por um curto período de tempo já apresentam alterações metabólicas típicas da fase inicial da diabetes (hiperglicemia moderada, hiperinsulinemia, intolerância á glicose e resistência à insulina), bem como modificações de parâmetros da morfometria do pâncreas endócrino. Posteriormente, foi analisada a expressão e localização celular das proteínas juncionais (Cx36, Cx43 e ZO-1) e o aspecto funcional dos canais formados pela GJ, através da microinjeção de marcadores intracelulares. Observamos que os animais tratados com dieta hiperlipídica apresentam tendência de diminuição de expressão de Cx36 acompanhada por alteração no padrão de marcação para essa proteína. Esses dados estão de acordo os de microinjeção que revelam uma pequena diminuição do grau de acoplamento celular após o tratamento com a dieta hiperlipídica. As alterações observadas para Cx36 foram acompanhadas por modificações no grau de expressão e de localização celular de ZO-1, proteína envolvida em processos como a organização dos canais intercelulares da GJ na membrana e no turnover de vários subtipos de conexina. Esses resultados indicam que a comunicação intercelular, particularmente a mediada por canais formados pela Cx36 parecem desempenhar importante papel na patogênese da diabetes tipo 2, desde sua fase inicial. / Abstract: Intercellular communication and adhesion among pancreatic B-cells are crucial for a proper insulin biosynthesis and secretion. The aim of this work was to investigate the role of gap junction (GJ) mediated-intercellular communication in the processes of maturation and dysfunction of B-cells. It is well known that fetal and neonatal rat pancreatic B-cells exhibit a reduced insulin secretory response to glucose and to other secretagogues as compared to adult ones. Based on this finding, we have used Wistar rats at different stages of development (fetal, neonatal, young and adult) as a model of B-cell maturation. As a model of type 2 diabetes, C57BL/6 mice (wild-type) and LDL receptor-deficient mice were fed a high fat diet up to 60 days. The cellular expression of GJ connexin (Cx) subtypes found in the endocrine pancreas (Cx36, Cx43 and Cx45) was assessed by immunohistochemistry, Western Blot, quantitative and semi-quantitative RTPCR. Our results indicate that young and adult endocrine pancreas express relatively high levels of Cx36 on B-cells in comparison with the other groups. Meanwhile, fetal and neonatal islets express predominantly Cx43 on non B-cells located at the islet periphery. Islet microinjection of GJ tracers revealed that neonatal B-cells display lower intercellular exchange of the cationic molecule Ethidium Bromide (EB) in comparison with the adult ones, which is in accordance with their differences in Cx36 expression. No significant differences were found in expression and localization of Cx45 among all animal groups. Regarding the animal type 2 diabetic model, a metabolic characterization showed that the high-fat diet for 60 days induces glucose intolerance, insulin resistance, hyperinsulinemia and moderate hyperglycemia in both mice groups (LDLr knockout and wild-type groups). High-fat fed mice showed a subtle decrease in Cx36 islet expression and in the B-cell intercellular exchange of EB in comparison with the chow-fed group (control). We also observed an alteration in the pattern of Cx36 labeling in immunohistochemistry assays. The high-fat diet induced a redistribution of Cx36 within the islets from a disorganized pattern (more commonly seen in control mice) to a sub domain-pattern where Cx36 plaques demarcate groups of B-cells. These changes in Cx36 islet distribution observed in high-fat fed mice were accompanied by a similar pattern of immunolabeling for ZO-1, but an increase in its islet expression, a tight junctional protein that seem to be involved in Cx turnover and membrane organization of Cx-made channels. Taken all together, these findings suggest that cell-cell coupling mediated by GJ may play an important role in the pancreatic B-cell maturation observed during endocrine pancreas development as well as in the early stages of type 2 diabetes pathogenesis. / Doutorado / Histologia / Mestre em Biologia Celular e Estrutural