Spelling suggestions: "subject:"engenharia fenética"" "subject:"engenharia enética""
81 |
Cultura mista, manipulação química e genética de micro-organismos: estratégias para a diversificação do metabolismo secundário / Mixed culture, chemical and genetic manipulation of microorganisms:strategies for diversifying the secondary metabolism.Fernanda Oliveira das Chagas 24 April 2014 (has links)
Recentes estudos genômicos têm mostrado que vários fungos e bactérias possuem um potencial biossintético superior à quantidade de me tabólitos secundários já isolados desses micro-organismos. A descoberta de produtos naturais inéditos e bioativos é limitada pela impossibilidade dos micro-organismos expressarem to das as suas rotas biossintéticas em laboratório. Assim, estratégias alternativas para i nduzir a produção de produtos naturais microbianos são necessárias. A utilização de cultur as mistas de micro-organismos é uma estratégia que vem sendo recentemente utilizada, na tentativa de mimetizar condições mais naturais de crescimento. Além disso, a adição de mo duladores químicos e epigenéticos às culturas microbianas também pode potencialmente est imular a produção de compostos de interesse, seja por ativar mecanismos celulares em resposta à condição de estresse, ou por alterar a taxa de transcrição de certos genes, em f unção de mudanças no grau de enovelamento da cromatina. Alternativamente, a indu ção de certos genes, e até mesmo a diversificação do metabolismo secundário, podem ser conseguidos através de engenharia genética, pela manipulação direta de genes de inter esse. A linhagem endofítica Alternaria tenuissima SS77, selecionada para os experimentos de modulaçã o química e epigenética, teve seu metabolismo secundário alterado após o tra tamento com diferentes moduladores. Provavelmente, o efeito observado ocorreu em função de uma eliciação inespecífica dos diferentes moduladores. Além disso, o cultivo misto desse fungo com o fungo endofítico Nigrospora sphaerica SS67 , isolada da mesma planta hospedeira ( Smallanthus sonchifolius ), levou ao isolamento de dois novos policetídeos, da classe das perilenequinonas, juntamente com um já relatado na literatura científica. Para r ealizar os cultivos microbianos mistos, envolvendo uma linhagem bacteriana e uma fúngica, t rês linhagens de actinobactérias e cinco de fungos, todos endofíticos da planta Lychnophora ericoides , foram selecionadas. Alterações no perfil metabólico da cultura mista de Phomopsis sp FLe6 com Streptomyces albospinus RLe7 foram as mais evidentes e por isso a maioria das investigações foram focadas nessa cultura mista. Várias condições de cu ltivo foram testadas e diferentes resultados foram obtidos. Em alguns casos, o desenv olvimento da linhagem fúngica foi inibido pela bacteriana, e em outros, foi observado o inverso. Da mesma forma, houve acentuada inibição da produção de alguns metabólito s secundários na presença da linhagem desafiadora, mas também foi verificada a eliciação de outros. Os extratos das culturas simples desses micro-organismos também apresentaram relativas alterações nos perfis metabólicos em função das condições de cultivo. Os metabólitos produzidos pelo fungo Phomopsis sp FLe6 e pela actinobactéria Streptomyces albospinus RLe7 foram isolados e caracterizados. Os resultados mostram que as intera ções entre os micro-organismos endofíticos são bastante complexas, estando sujeita s a ação de diversos fatores externos que muitas vezes não podem ser pré-determinados. Po r isso, estabelecer um cultivo misto adequado, do ponto de vista da eliciação da produçã o de metabólitos secundários, pode requerer uma série de tentativas. Ainda assim, os r esultados almejados podem ser conseguidos utilizando essa estratégia. Diferenteme nte das linhagens endofíticas, manipuladas quimicamente através de diferentes estr atégias, a linhagem sequenciada de Fusarium heterosporum ATCC 74349, foi manipulada geneticamente para a co nstrução de um gene biossintético híbrido pks-nrps , contendo a porção nrps do gene híbrido da equisetina e um pks críptico de Aspergillus fumigatus . Era esperado que a linhagem hibridizada fosse capaz de produzir o metabólito se cundário geneticamente planejado, entretanto, após seu cultivo, esse produto não foi detectado nos extratos, e as possíveis razões são discutidas. Ainda que os resultados espe rados não tenham sido obtidos, estudos que contribuam para a ampliação do entendimento das megassintases fúngicas são de extrema valia. / Recently, genetic studies have shown that several b acteria and fungi hold a greater biosynthetic potential than the amount of secondary metabolites isolated from these microorganisms. The discovery of novel bioactive na tural products is limited by the inability of microorganisms to express all their biosynthetic pa thways in laboratory conditions. Therefore, alternative strategies to induce the production of microbial natural products are required. Mixed cultures of microorganisms are a strategy tha t has been used to mimic more natural conditions of growth. Furthermore, the addition of chemical and epigenetic modulators to the microbial cultures can also stimulate the productio n of compounds by activating cellular mechanisms in response to stress conditions or by c hanging the transcription rate of certain genes, due to changes in the chromatin folding. Alt ernatively, the induction of some genes, and even the diversification of secondary metabolis m, can be achieved by genetic engineering, by manipulating genes of interest. The endophytic strain Alternaria tenuissima SS77, which was selected for the experiments of che mical and epigenetic modulation, had changed its secondary metabolism after treatment wi th different modulators. Probably, the observed effect was due to a nonspecific elicitatio n of those modulators. Moreover, the mixed cultures of this fungus with the endophytic fungus Nigrospora sphaerica SS67, isolated from the same host plant ( Smallanthus sonchifolius ), led to the isolation of two new polyketides, belonging to perylene quinone class, along with ano ther one already reported in the scientific literature. Three strains of actinobacteria and fiv e fungi, all endophytes of Lychnophora ericoides , were selected to grow in microbial mixed cultures comprising one bacteria and one fungus. Changes in the metabolic profile of the mix ed culture of Phomopsis sp. FLe6 with Streptomyces albospinus RLe7 were the most obvious, and then further studi es were focused on this mixed culture. Many culture conditions were analyzed and different results were obtained. In some cases, the development of the fun gal strain was inhibited by bacteria, and in other cases was observed the opposite. Similarly , there was a remarkable inhibition of the production of certain secondary metabolites in the presence of the challenging strain, but the eliciting of others was also observed. The extracts of the single cultures of these microorganisms also showed changes in metabolic pro files due to culture conditions. The metabolites produced by the fungus Phomopsis sp. FLe6 and the actinobacteria S. albospinus RLe7 were isolated and characterized. The results show that interactions between endophytic microorganisms are quite complex and are influenced by various external factors that often can not be previously determined. Theref ore, establishing a suitable mixed culture to elicit the production of secondary metabolites m ay require some attempts. Still, the expected results can be achieved using this strateg y. Unlike the endophytic strains, that was chemically manipulated by different strategies, the sequenced strain Fusarium heterosporum ATCC 74349 was genetically manipulated to construct a hybrid PKS-NRPS biosynthetic gene containing the NRPS portion of the hybrid gene of e quisetin and a cryptic PKS gene of Aspergillus fumigatus . It was expected that hybridized strain could be a ble to produce the secondary metabolite genetically planned, however, after its cultivation, this product was not detected in any extracts, and some possible reasons are discussed. Although the expected results have not been obtained, studies that contri bute to increasing the understanding of fungal megasynthases are extremely valuable
|
82 |
Produção de mutantes de Streptomyces clavuligerus nos genes lat, cvm7P e rpoZ e estudo de seus efeitos sobre a produção de ácido clavulânico / Production of Streptomyces clavuligerus mutants in the genes lat, cvm7P and rpoZ, and study their effects on acid production clavulanicLima, Vanderlei Aparecido de 11 August 2010 (has links)
Made available in DSpace on 2016-06-02T19:55:29Z (GMT). No. of bitstreams: 1
3391.pdf: 9156638 bytes, checksum: 0de8724bcb52a60114f5d3639d17f212 (MD5)
Previous issue date: 2010-08-11 / Financiadora de Estudos e Projetos / Molecular biology and genetic engineering have been deployed widely in recent years, several protocols have been established, presenting new methodologies capable of altering the genetics of bacterial strains industrial interest. This research had as main objectives: (1) the construction of the following plasmids: plat, pAMB4 and pAMB3RpoZneo, (2) the production of Streptomyces clavuligerus mutants by gene disruption, by insertion of plasmid integrative, and by replication of multi-copy plasmid in Streptomyces clavuligerus by conjugation and (3) study the effect of these mutations on clavulanic acid production and lipolytic activity. In Spain (University of Leon), six mutants Streptomyces clauligerus lat::apr, Streptomyces clavuligerus cvm7P::neo, Streptomyces clauligerus Lat::apr cvm7P::neo, Streptomyces clavuligerus pRAneoZ, Streptomyces clavuligerus pAMB4 and Streptomyces clavuligerus pAMB3RpoZneo were produced. In Leon, the fermentations were performed with the SA culture medium and only with the mutants Streptomyces clavuligerus lat::apr and Streptomyces clavuligerus pRAneoZ. In this case, there was no statistically significant difference at 5% probability by analysis of variance (ANOVA). In Brazil, the fermentations with all mutants in the culture medium-based oil and soybean meal, showed a different pattern in the production of clavulanic acid. The mutants Streptomyces clavuligerus pAMB3RpoZneo and Streptomyces clavuligerus pRAneoZ (= 5%) showed clavulanic acid titles higher when compared with the wild type. The double mutant Streptomyces clavuligerus lat::apr cvm7P::neo, contrary to expectations, showed the lowest levels of clavulanic acid in relation to its parental strain. Streptomyces clavuligerus pRAneoZ mutant and the mutant Streptomyces clavuligerus pAMB4 control, showed the highest lipolytic activity at 5% probability. The double mutant in turn, had the lowest lipolytic activities. A direct relationship between levels of clavulanic acid and lipase production was observed. All mutants produced in this work could be fermented into bioreactor to assess production levels of clavulanic acid and lipase. The construction of a new double mutant named Streptomyces clavuligerus lat::apr RpoZneo from existing ones mutant could be of great interest to investigate this new combination of mutations on clavulanic acid production and lipolytic activity. / A biologia molecular e a engenharia genética têm se desenvolvido muito nos últimos anos e vários protocolos foram estabelecidos, apresentando novas metodologias capazes de alterar a genética de linhagens bacterianas de interesse industrial. O presente estudo teve por objetivos principais: (1) a construção dos seguintes plasmídeos: plat, pcmv7P, pAMB4 e pAMB3RpoZneo; (2) a produção de mutantes de Streptomyces clavuligerus por disrupção gênica, por inserção de plasmídeo integrativo, e por replicação de plasmídeo multi-cópia em Streptomyces clavuligerus por conjugação bacteriana; (3) o estudo do efeito destas mutações na produção de ácido clavulânico e na atividade lipolítica. Na Espanha (Universidade de León), seis mutantes foram produzidos: Streptomyces clavuligerus lat::apr, Streptomyces clavuligerus cvm7P::neo, Streptomyces clavuligerus lat::apr cvm7P::neo, Streptomyces clavuligerus pRAneoZ, Streptomyces clavuligerus pAMB4 e Streptomyces clavuligerus pAMB3RpoZneo. Em León, as fermentações foram realizadas com o meio de cultura SA e somente com os mutantes Streptomyces clavuligerus lat::apr e Streptomyces clavuligerus pRAneoZ. Nestas fermentações não houve diferença estatística significativa ao nível de 5% de significância, pela análise de variânica (ANOVA). No Brasil, as fermentações com todos os mutantes no meio de cultura a base de óleo e farinha de soja, mostraram um padrão diferenciado na produção de ácido clavulânico. Os mutantes Streptomyces clavuligerus pRAneoZ e Streptomyces clavuligerus pAMB3RpoZneo apresentaram títulos de ácido clavulânico superiores quando comparados com a linhagem selvagem (= 5%). O duplo mutante Streptomyces clavuligerus lat::apr cvm7P::neo, ao contrário do esperado, apresentou os níveis mais baixos de ácido clavulânico e em relação a sua linhagem parental. Os mutantes Streptomyces clavuligerus pRAneoZ e o mutante controle Streptomyces clavuligerus pAMB4, apresentaram a maior atividade lipolítica ao nível de 5% de significância. O duplo mutante por sua vez, apresentou as menores atividades lipolíticas. Uma relação direta entre os níveis de ácido clavulânico e a produção de lipase foi observada. Todos os mutantes produzidos neste trabalho poderiam ser fermentados em biorreator de bancada para se avaliar os níveis de produção de ácido clavulânico e de lipase. A construção de um novo duplo mutante denominado, Streptomyces clavuligerus plat::apr RpoZneo, a partir dos existentes, poderia ser de grande interesse para investigar esta nova combinação de mutação na produção de ácido clavulânico e na atividade lipolítica.
|
Page generated in 0.0764 seconds