Orientador: Tereza Cristina Cardoso da Silva / Banca: Vera Cláudia Lorenzetti Magalhães Curci / Banca: Maria Cecília Rui Luvizotto / Resumo: O presente estudo descreve o desenvolvimento e a aplicação da reação de transcrição reversa in situ em cadeia da polimerase (RT-PCR in situ), para detectar a co-infecção experimental de perus de 1-dia de idade com Coronavirus (TCoV) e Astrovirus (TAstV-2) isolados de casos clínicos no Brasil. A primeira etapa da reação consistiu na preparação específica de sondas de DNA biotiniladas homólogas ao gene da polimerase viral do TAstV-2 e da região 3'UTR do TCoV. Foram utilizados cortes histológicos de intestino correspondendo ás regiões do íleo, junção íleo-ceco e ceco para avaliar a reação de RT-PCR in situ. Para permeabilização tecidual uma digestão foi aplicada com 10 μg/μl proteinase K por 30 min. Na etapa de hibridização, as sondas de DNA homólogo às regiões genômicas virais ligadas à biotina foram diluídas na concentração de 2μg/μl na solução de hibridização e incubadas overnight à 42ºC. Em seguida, uma diluição ótima do anticorpo monoclonal anti-biotina acoplado a fosfatase alcalina e a peroxidase foram aplicados, para TAstV-2 e TCoV, respectivamente. O substratos diaminobenzidina 3,3 (DAB) e FastRed Ò foram utilizados para identificar a hibridização das regiões homólogas correspondentes ao TCoV e TAstV-2, respectivamente. A reação positiva foi visualizada por deposição de pigmentos vermelhos (TAstV-2) e marrom acastanhado (TCoV). Em relação à localização dos genes virais amplificados, foram confirmados nas células da base (células caliciformes) e ao longo das vilosidades intestinais principalmente no citoplasma dos enterócitos de forma difusa para ambos os vírus. Marcações positivas também foram evidenciadas na submucosa próximas às regiões com intensa congestão vascular... (Resumo completo, clicar acesso eletrôncio abaixo) / Abstract: This study describes the development and application of the reaction in situ reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR in situ) to detect co-infection of turkeys to experimental 1-day-old with Coronavirus (TCoV) and Astrovirus ( TAstV-2) isolated from clinical cases in Brazil. The first step of the reaction has been to prepare specific biotinylated DNA probes homologous to the viral polymerase gene of TAstV-2 and the 3'UTR region of TCoV. We used histological sections of intestine corresponding to the regions of the ileum, ileum-cecum junction and cecum to evaluate the reaction of RT-PCR in situ. For permeabilization tissue digestion was applied with 10 g / uL proteinase K for 30 min. In step hybridization, DNA probes homologous to the viral genomic regions linked to biotin were diluted to the concentration of 2μg/μl in hybridization solution and incubated overnight to 42 ° C. Then, an optimal dilution of monoclonal anti-biotin coupled to alkaline phosphatase and peroxidase were applied to TAstV-2 and TCoV, respectively. 3.3 The substrate were used to identify the hybridization ofÒdiaminobenzidine (DAB) and FastRed homologous regions corresponding to TCoV and TAstV-2, respectively. The positive reaction was visualized by deposition of red pigment (TAstV-2) and brown brown (TCoV). Concerning the location of the amplified viral genes was confirmed by the base cells (goblet cells) and along the intestinal villi in the cytoplasm of enterocytes diffusely to both viruses. Tags positive were also demonstrated in the submucosa close to the areas with intense vascular congestion. In conclusion, the RT-PCR in situ standard in this study showed good ability to detect viral RNA promoting a desirable... (Complete abstract click electronic access below) / Mestre

Orientador: Tereza Cristina Cardoso da Silva / Banca: José Antônio Jerez / Banca: Iveraldo dos Santos Dutra / Resumo: O Complexo de Enterite de Perus (PEC) tem sido incriminado como uma das maiores causas de perdas econômicas em outros países. Neste estudo, foi demonstrado causando diarréia, perda de peso e na maioria das vezes alta mortalidade em perus acometidos de enterite com 30-120 dias de idade de uma determinada região produtora no Brasil. A RT-PCR foi aplicada em suspensões de intestinos (SI) (n=2), respectivos conteúdos intestinais (CI) (n=2), bursa de Fabrícius (BF), fezes (F) (n=5) e swabs cloacais (SC) (n=44), para amplificar a região conservada 3'UTR e gene do nucleocapsídeo de TCoV. Os exames de histopatologia e imunohistoquímica direta foram realizados para detectar o antígeno TCoV a partir de lâminas de intestinos e bursas infectados. Todos os resultados obtidos nos tecidos marcados, revelaram lesões sugestivas de terem sido causadas pela infecção por TCoV. A marcação positiva da imunohistoquímica direta estava presente em todas as lâminas de intestinos, entretanto, todas as BF analisadas foram negativas. Os achados de RT-PCR foram positivos para TCoV em todas as amostras de fezes e 27,27% das amostras de SC foram positivas para a região 3'UTR e região TCoV nucleocapsídeo. As amostras de soro (n=200), foram positivas para TCoV, com títulos variando de 2.0Log a 8.0Log usando o ELISA comercial IDEEX para IBV. Finalmente, o melhor material de campo para o diagnóstico de TCoV foram as fezes (F) e/ou suspensão de intestinos (SI), resultando na primeira descrição de perus com quadro agudo de enterite acometidos por coronavirus Grupo 3 no Brasil. / Abstract: The Poult Enteritis Complex (PEC) has been incriminated as the major cause of losses in other countries, and especially, in this study, was described causing diarrhea, weight gain and most of the time, high mortality. In this study, it was performed the turkey coronavirus (TCoV) detection from 30-120 day old affected poults from a particular producer region in Brazil. The RT-PCR was applied in intestines suspensions (IS) (n=2), respective intestines contents (IC) (n=2), bursa of Fabrícius (BF), faecal droppings (FD) (n=5) and cloacal swabs (CS) (n=44) to amplify the 3þUTR conserved region and TCoV nucleocapsid gene. The histopathological and direct immunohistochemical examinations were performed to detect the TCoV antigen from infected intestine and bursa slides. All results obtained from stained tissues, revealed lesions described to be caused by TCoV infection. The direct immunohistochemical positive signal was present in all intestine slides, however all BF analysed were negative. RT-PCRs findings were positive for TCoV in all FD samples, and 27,27% of CS analysed were positive for 3þUTR and TCoV nucleocapsid region. The sera samples (n=200) were positive for TCoV, with titers range from d 2.0Log to 8.0Log using the IDEEX commercial ELISA for IBV. Finally, the best field material for TCoV diagnosis was FD and/or intestine suspensions (IS), resulting in a first describe of TCoV affecting poults in Brazil. / Mestre

Orientador: Luiz Fernando de Oliveira e Silva Carvalho / Banca: Geraldo Camilo Alberton / Banca: Samir Issa Samara / Resumo: O complexo enteropatia proliferativa dos suínos (EPS), causado pela bactéria Lawsonia intracellularis, é doença infecciosa de grande importância para suínos nas fases de crescimento e terminação e para adultos jovens. Caracteriza-se por determinar alterações proliferativas, hemorrágicas e necróticas da porção final do intestino delgado (íleo). É doença de ocorrência mundial e afeta especialmente animais de alto valor genético, oriundos de programas sanitários tipo SPF (Specific Pathogen Free), sendo responsabilizada por importantes perdas econômicas, seja devido à morte ou queda no desempenho produtivo dos animais. Com o objetivo de desenvolver metodologia rápida e barata para monitoramento padronizado das lesões na linha de abate foi realizado este estudo. Durante o processo de abate, em frigoríficos localizados em Ipuã-SP e Tupã-SP, foram colhidas ao acaso, amostras da porção final do íleo de 156 suínos, todos castrados, de linhagens comerciais, aproximadamente com 150 dias de idade e peso médio de 110 kg. Após padronizadas no comprimento, para exatos 10 centímetros, as amostras foram submetidas à paquimetria, para verificação da sua espessura e do seu diâmetro, e à pesagem, em balança de precisão. Foram, em seguida, cuidadosamente inspecionadas e palpadas, externa e internamente, com o intuito de identificar lesões macroscópicas de ileíte, sendo os resultados destas análises anotados em fichas apropriadas e individuais. Fragmentos de tecido foram colhidos e imersos em formalina neutra a 10%, para análises histopatológicas posteriores ... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: The complex of porcine proliferative enteropathy (PPE), caused by the bacteria Lawsonia intracellularis, is an infectious disease of great importance to pigs during the growing and ending and for the young adults. Characterized by determining proliferative disorders, hemorrhagic and necrosis of the small intestine (ileum)'s final portion. It is a worldwide occurrence disease and particularly affects animals of high genetic value, type of health programs from SPF (Specific Pathogen Free), being responsible for important economic losses, either due to death or failure in the of animals' productive performance. With the main goal to develop rapid and inexpensive methodology for standardized monitoring of lesions on the slaughter line this study was accomplished. During the slaughter in slaughterhouses located in Ipuã-SP and Tupã-SP, samples were picked at random from final portions of the ileum from 156 pigs, all castrated, of commercial strains, with approximately 150 days old and weighing 110 kg. After standardized in length, to exactly 10 centimeters, the samples were submitted to the caliper to check the thickness and diameter, and weighing on a precision scale. They were, after all carefully inspected and palpated, externally and internally, in order to identify gross lesions of ileitis, and the results of these tests recorded on proper and individual forms. Fragments of tissue were harvested and immersed in 10% neutral formalin for subsequent histopathological analysis ... (Complete abstract click electronic access below) / Mestre