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Avaliação da produção de enzimas celulolíticas e hemicelulolíticas por fungos isolados do cerrado, costa marinha brasileira e da Antártica, utilizando casca de soja como substrato

Pereira, Catarina Bernardes 05 August 2016 (has links)
Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Ciências da Saúde, 2016. / Submitted by Fernanda Percia França (fernandafranca@bce.unb.br) on 2016-09-30T16:18:28Z No. of bitstreams: 1 2016_CatarinaBernardesPereira.pdf: 3123751 bytes, checksum: dccc1336b1d5fde33388bec89c588d2c (MD5) / Approved for entry into archive by Ruthléa Nascimento(ruthleanascimento@bce.unb.br) on 2016-09-30T19:21:49Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2016_CatarinaBernardesPereira.pdf: 3123751 bytes, checksum: dccc1336b1d5fde33388bec89c588d2c (MD5) / Made available in DSpace on 2016-09-30T19:21:49Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2016_CatarinaBernardesPereira.pdf: 3123751 bytes, checksum: dccc1336b1d5fde33388bec89c588d2c (MD5) / Em razão do Brasil exercer grande atividade agrícola, são gerados enormes volumes de resíduos que são rotineiramente acumulados no meio ambiente, com destaque para a soja. O reaproveitamento desses recursos naturais disponíveis abundantemente, possibilita a produção de diversos metabólitos de interesse industrial obtendo produtos de maior valor agregado, através de tecnologias de baixo impacto ambiental, baixo custo, consumindo menos recursos e simplificando o processo. Relatam-se diversas produções enzimáticas através de processos biotecnológicos de fungos filamentosos em meios contendo resíduos da agroindústria. Dentro dessa visão, o trabalho objetivou avaliar a produção de enzimas celulolíticas e hemicelulolíticas de fungos isolados do cerrado, costa marinha brasileira e da Antártica, utilizando casca de soja como substrato. Em sua primeira etapa, foi realizando o isolamento de 58 fungos endofíticos de 13 espécies de plantas nativas do Cerrado. Posteriormente foi realizado o processo de fermentação submersa (SF) de 104 fungos avaliando-se suas capacidades de produção enzimática. Uma triagem foi feita e 3 produtores de cada bioma (9 fungos) passaram também por fermentação em estado sólido (SSF). Os 18 extratos enzimáticos tiveram suas características físico-químicas analisadas quanto ao melhor pH e temperatura. Os resultados obtidos indicam que a casca de soja é um ótimo substrato na produção de xilanase, mananase, carboximetilcelulase (CMCase) e β-glicosidase. Os cultivos apresentaram enzimas com melhor atividade em pH 5,4 para xilabase, mananase e CMCase, e pH 4,8 para β-glicosidase. A faixa de temperatura ótima se manteve entre 40 ºC e 60 ºC para todos as enzimas em ambos os tipos de fermentações. As atividades mensuradas mostraram-se mais expressivas para xilanase atingindo cerca de 14 UI/mL. Foi possível observar um aumento de atividade enzimática nos cultivos de fungos do cerrado quando cultivados em SSF. Dessa forma, os resultados permitem concluir que os fungos estudados apresentam potencial para a produção das enzimas celulolíticas e hemicelulolíticas através de SF e SSF em um meio de baixo valor agregado apresentando assim interesse biotecnológico. _______________________________________________________________________________________________ ABSTRACT / Due to the fact Brazil practices a great agricultural activity, huge volumes of waste are generated and are commonly accumulated in the environment, specially soybeans. The reuse of these highly available natural resources, allows for the production of several metabolites of industrial interest, obtaining products with higher added value, through technologies with low environmental impact and low cost, consuming less resources and simplifying the process. There are reports of several enzymatic productions through biotechnological processes of filamentous fungi in means containing agriculture industry residues. Within this view, the aim of the present work was to evaluate the production of cullulolytic and hemicellulolytic enzymes from isolated fungi in the Brazilian Cerrado and marine coast and in Antarctica, using soy husk as substrate. In its first stage, it performed the isolation of 58 endophytic fungi of 13 species of native plants of the Cerrado. Later it was realized the process of submerged fermentation (SF) of 104 fungi, evaluating their capability of enzymatic production. A selection was made and 3 producers of each biome (9 fungi) additionally went through solid state fermentation (SSF). The 18 enzymatic extracts had its physical-chemical characteristics analyzed as to find the optimum pH and temperature. The results obtained indicate that the soy husk is an great substrate in the production of xylanase, mananase, carboximetilcelulase (CMCase) and β-glicosidase. The enzymes had presented their best activity in pH 5.4 for xylanase, mannanase and CMCase and pH 4.8 for β-glicosidase. The optimum temperature range was kept between 40ºC and 60ºC for all enzymes in both fermentations. The activities measured have been revealed as expressive for xylanase reaching around 14 UI/mL. It was possible to observe an increase of enzymatic activity for the Cerrado fungi when cultivated in SSF. Therefore, the results allow to conclude that the fungi used present potential for the production of cellulolytic and hemicellulolytic enzymes through SF and SSF in a low added value mean, thus presenting biotechnological interest.
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α-Arabinofuranosidase de Aspergillus hortai CRM 1919: produção, purificação, caracterização e aplicação na hidrólise de hemiceluloses de resíduos agroindustriais / α-Arabinofuranosidase from Aspergillus hortai CRM 1919: production, purification, characterization and application in the hydrolysis of hemicelluloses from agroindustrial wastes

Terrone, Cárol Cabral [UNESP] 14 November 2017 (has links)
Submitted by CÁROL CABRAL TERRONE null (36025505837) on 2018-01-09T15:20:42Z No. of bitstreams: 1 Tese - Cárol Terrone.pdf: 3140738 bytes, checksum: 563a37f8e4725bc76f326c128aae84bf (MD5) / Approved for entry into archive by Adriana Aparecida Puerta null (dripuerta@rc.unesp.br) on 2018-01-10T16:59:21Z (GMT) No. of bitstreams: 1 terrone_cc_dr_rcla.pdf: 3025804 bytes, checksum: 817c25d1a9eef55ee5d3fb7555bd7982 (MD5) / Made available in DSpace on 2018-01-10T16:59:21Z (GMT). No. of bitstreams: 1 terrone_cc_dr_rcla.pdf: 3025804 bytes, checksum: 817c25d1a9eef55ee5d3fb7555bd7982 (MD5) Previous issue date: 2017-11-14 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Biomassa lignocelulósica é a principal fonte de carbono renovável no planeta. Seus constituintes majoritários são celulose, hemiceluloses e lignina. Hemiceluloses são polissacarídeos ramificados sendo o principal tipo as xilanas, estruturas com cadeia principal de xilose. Dentre as diversas enzimas hidrolíticas, que atuam sobre a estrutura de xilanas, estão as α-L-arabinofuranosidases, que catalisam a hidrólise de ligações entre α-L-arabinofuranosídeos e a cadeia principal do polissacarídeo. Neste trabalho, uma linhagem de Aspergillus hortai CRM1919, isolada de solo próximo a lagoas salinas e alcalinas da região da Nhecolândia no Pantanal Matogrossense, foi utilizada para produzir α-L-arabinofuranosidases. Resíduos agroindustriais foram utilizados como substrato para o cultivo do fungo. O objetivo principal foi otimizar a produção de α-L-arabinofuranosidases e aumentar a produção a fim de se obter um filtrado enzimático rico nessa atividade, para posteriormente purificá-la e aplicá-la na degradação de biomassa. A linhagem foi cultivada em meio líquido de Vogel suplementado com diferentes substratos, dentre eles alguns subprodutos da agroindústria. As maiores produções de α-arabinofuranosidases ocorreram nos cultivos com polpa cítrica e casca de laranja a 1% (m/v) em cultivos estáticos por 4 dias, com pH inicial de 2,5 e temperatura de 30 ºC. Após todas as etapas de otimização, o extrato bruto apresentou atividade quinze vezes maior do que nos cultivos iniciais. A enzima foi purificada por uma estratégia de três etapas, sendo uma precipitação com sulfato de amônio, na concentração de 25 a 65%, uma cromatografia de troca iônica e outra de exclusão molecular, apresentando ao final uma recuperação de 10,1% com um fator de purificação de 58,7. As características da α-L-arabinofuranosidase purificada foram determinadas, sendo pH ótimo de 4,0 e temperatura ótima de 60 ºC, meia vida a 30 e 40 ºC de 265 e 230 minutos, respectivamente. A maior estabilidade da enzima ao pH ocorreu em pH 5,0, A atividade enzimática foi reduzida na presença de Zn+2, PMSF, SDS e etanol a 20%, mas foi ativada na presença de Mg+2, Na+, EDTA, Tween 20, Tween 80 e Triton X-100. A α-arabinofuranosidase apresentou tolerância a presença de 0,5 e 1,0 M de NaCl no meio reacional, e alta estabilidade nas concentrações de 0,5, 1,0, 2,0 e 4,0 M de NaCl. Os parâmetros cinéticos para o substrato ρ-nitrofenil-α-L-arabinofuranosídeo foram Km de 8,73 mM, Vmáx de 7,91 μmol/min.mg e Kcat de 0,59/min. A enzima purificada apresentou afinidade apenas sobre o substrato ρ-nitrofenil-α-L-arabinofuranosídeo. Na caracterização das biomassas in natura, o bagaço de cana-de-açúcar apresentou em sua composição 30% de celulose, 16% de hemiceluloses e 20% de ligninas totais, enquanto bagaço de malte apresentou 20% de celulose, 20% de hemiceluloses e 20% de ligninas totais. Na caracterização da hemicelulose extraída, a de bagaço de cana-de-açúcar apresentou composição em açúcares redutores de 7,8% de glicose, 23,7% de xilose e 2,6% de arabinose; a hemicelulose de bagaço de malte apresentou em sua composição 20,6% de glicose, 28,3% de xilose e 9,4% de arabinose. A hidrólise das hemiceluloses e de xilanas comerciais foi realizada na presença da α-arabinofuranosidase purificada e do filtrado bruto de cultivo contendo a α-arabinofuranosidase, associados com uma xilanase purificada, também produzida por Aspergillus hortai. Em ambos os casos foi possível verificar a cooperação entre enzimas do complexo xilanolítico e a atuação sequencial de cada uma na hidrólise das estruturas de xilano. / Lignocellulosic biomass is the main source of renewable carbon on the planet. Its major constituents are cellulose, hemicelluloses and lignin. Hemicelluloses are branched polysaccharides being the main type the xylan, xylose main chain structures. Among the various hydrolytic enzymes that act on the xylan structure there are the α-L-arabinofuranosidases, which catalyze the hydrolysis of linkages between α-L-arabinofuranosides and the polysaccharide main chain. In this work, a strain of Aspergillus hortai CRM1919, isolated from soil near saline and alkaline lagoons of the Nhecolândia region in Pantanal Matogrossense, was used to produce α-L-arabinofuranosidases. Agroindustrial wastes were used as substrate for the fungus cultivation. The main objective was to optimize the production of α-L-arabinofuranosidases and increase the yield in order to obtain a rich enzymatic filtrate in this activity, to later purify it and apply it in the hydrolysis of biomass. The strain was cultivated in Vogel liquid medium supplemented with different substrates, among them some by-products of agroindustry. The highest production of α-arabinofuranosidases occurred in cultures with citrus pulp and orange peel at 1% (w/v) in static cultures for 4 days, with an initial pH of 2.5 and temperature of 30 ºC. After all the optimization steps, the crude extract presented activity fifteen times higher than the initial cultures. The enzyme was purified by a three-step strategy, with ammonium sulfate precipitation at 25-65% concentration, ion exchange chromatography and molecular exclusion chromatography, with recovery of 10.1% and purification fold of 58.7. The characteristics of the purified α-L-arabinofuranosidase were determined, being optimum pH of 4.0 and optimum temperature of 60 °C, half-life at 30 and 40 °C of 265 and 230 minutes, respectively. The higher stability of the enzyme to pH occurred at pH 5.0. Enzymatic activity was reduced in the presence of Zn+ 2, PMSF, SDS and 20% ethanol and was activated in the presence of Mg+ 2, Na+, EDTA, Tween 20, Tween 80 and Triton X-100. The α-arabinofuranosidase presented tolerance to the presence of 0.5 and 1.0 M NaCl in the reaction medium, and high stability at the concentrations of 0.5, 1.0, 2.0 and 4.0 M NaCl. The kinetic parameters for the ρ-nitro phenyl-α-L-arabinofuranoside substrate were Km of 8.73 mM, Vmax of 7.91 μmol / min.mg and Kcat of 0.59 / min. The purified enzyme had affinity only on the ρ-nitro phenyl-α-L-arabinofuranoside substrate. In the characterization of in natura biomasses, sugarcane bagasse presented 30% cellulose, 16% hemicelluloses and 20% total lignins, while brewer’s spent grain presented 20% cellulose, 20% hemicelluloses and 20% total lignins. In the characterization of extracted hemicellulose, the sugarcane bagasse presented composition in reducing sugars of 7.8% of glucose, 23.7% of xylose and 2.6% of arabinose; the hemicellulose of brewer’s spent grain presented 20.6% glucose, 28.3% xylose and 9.4% arabinose. Hydrolysis of the hemicelluloses and commercial xylans was performed in the presence of the purified α-arabinofuranosidase and the crude culture filtrate containing α-arabinofuranosidase, associated with a purified xylanase, also produced by Aspergillus hortai. In both cases it was possible to verify the cooperation between xylanolytic complex enzymes and the sequential action of each one in the hydrolysis of the xylan structure.
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Influência dos coquetéis enzimáticos produzidos por Trichoderma reesei e Aspergillus niger pelo processo de fermentação sequencial na hidrólise do bagaço de cana-de-açúcar

Florencio, Camila 28 April 2016 (has links)
Submitted by Alison Vanceto (alison-vanceto@hotmail.com) on 2017-02-07T10:26:14Z No. of bitstreams: 1 TeseCF.pdf: 2944475 bytes, checksum: 0b8b7d83e1195e91eb572351858f7b93 (MD5) / Approved for entry into archive by Camila Passos (camilapassos@ufscar.br) on 2017-02-08T12:04:12Z (GMT) No. of bitstreams: 1 TeseCF.pdf: 2944475 bytes, checksum: 0b8b7d83e1195e91eb572351858f7b93 (MD5) / Approved for entry into archive by Camila Passos (camilapassos@ufscar.br) on 2017-02-08T12:08:29Z (GMT) No. of bitstreams: 1 TeseCF.pdf: 2944475 bytes, checksum: 0b8b7d83e1195e91eb572351858f7b93 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-02-08T12:10:12Z (GMT). No. of bitstreams: 1 TeseCF.pdf: 2944475 bytes, checksum: 0b8b7d83e1195e91eb572351858f7b93 (MD5) Previous issue date: 2016-04-28 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / Currently, one of the major challenges for second generation ethanol is to reduce the cost of cellulolytic enzymes. Thus, the development of bioprocesses for the enzyme production on-site and strategies to increase the final yield of the enzymatic hydrolysis are required to ensure that biomass conversion to be economically feasible. Therefore, the objective of this work was to study the production and characterization of enzyme cocktails involved in the degradation of plant biomass by filamentous fungi Trichoderma reesei and Aspergillus niger grown in sequential fermentation and evaluate the application of these cocktails in the saccharification process of sugarcane bagasse. Firstly, evaluation and validation of sequential fermentation cultivation methodology to different strains of Trichoderma. Cultivation were made using sugarcane bagasse "in natura" and pretreated by steam explosion, as a carbon source. The result more significantly was observed for T. reesei Rut C30, the endoglucanase production was 4.2-fold higher than the values obtained in conventional submerged fermentation. The enzyme extracts were characterized in terms of optimum pH and temperature and endoglucanase profile. The thermostability was directly influenced by the type of carbon source and type of cultivation method. Subsequently, the proteomic analysis were performed of enzyme cocktails from T. reesei Rut C30 and A. niger A12 produced by submerged and sequential fermentation in the presence of pretreated bagasse. The performance of the enzyme cocktail in saccharification of pretreated bagasse showed that the combination of enzyme cocktails from T. reesei and A. niger produced by sequential fermentation had a yield than 3-fold higher than the enzyme cocktails of submerged fermentation. In order to evaluate the action of the enzyme cocktails produced by T. reesei and A. niger in sugarcane bagasse saccharification, the last step of the work was to study the additives effects during the sugarcane bagasse hydrolysis aiming at reducing non-productive adsorption of enzymes into lignin. The saccharification results in the presence of soybean protein were 2-fold higher than the controls (no additive) to the enzyme cocktails of two fungi studied produced by solid state fermentation, indicating the potential use of soybean protein as an additive to minimize non-productive adsorption of the enzyme into lignin. Overall, this study presents an interesting final contribution in the cellulase production process and the application of the enzyme cocktail in the hydrolysis of sugarcane bagasse. / Atualmente, um dos grandes desafios para a produção de etanol de segunda geração consiste em diminuir o custo das enzimas celulolíticas. Assim, o desenvolvimento de bioprocessos para produção das enzimas on-site e estratégias para aumentar o rendimento final da hidrólise enzimática são necessários para assegurar que a conversão de biomassa seja economicamente viável. Para tanto, o objetivo deste trabalho foi estudar a produção e caracterização de coquetéis enzimáticos envolvidos na degradação da biomassa vegetal pelos fungos filamentosos Trichoderma reesei e Aspegillus niger cultivados por fermentação sequencial, bem como avaliar a aplicação dos mesmos no processo de sacarificação do bagaço de cana-de-açúcar. Primeiramente foi realizada a avaliação e validação da metodologia de cultivo de fermentação sequencial para diferentes linhagens de Trichoderma. Os cultivos foram feitos utilizando o bagaço de cana “in natura” e prétratado por explosão a vapor, como fonte de carbono. O melhor resultado foi observado para T. reesei Rut C30, em que a produção de endoglucanase foi 4,2 vezes maior do que os valores obtidos em cultivo convencional de fermentação submersa. Os extratos enzimáticos foram caracterizados em termos de pH e temperatura ótimos e perfil de endoglucanase. A termo-estabilidade foi diretamente influenciada pelo tipo de fonte de carbono e tipo de cultivo. Posteriormente, foram realizadas as análises proteômicas dos coquetéis enzimáticos do T. reesei Rut C30 e A. niger A12 produzidos por fermentação submersa convencional e fermentação sequencial, na presença de bagaço de cana prétratado. A performance dos coquetéis enzimáticos na sacarificação do bagaço de cana pré-tratado mostraram que a combinação dos coquetéis enzimáticos de T. reesei e A. niger produzidos por fermentação sequencial tiveram um rendimento 3 vezes maior do que os coquetéis da fermentação submersa. A fim de explorar melhor a ação dos coquetéis enzimáticos produzidos por T. reesei e A. niger na sacarificação do bagaço, na última etapa do trabalho foi estudo o efeito de aditivos durante a hidrólise do bagaco de cana visando à redução da adsorção improdutiva de enzimas na lignina. Os resultados de sacarificação na presença da proteína de soja foram 2 vezes maiores do que os controles (sem aditivo) para os coquetéis enzimáticos dos dois fungos estudados produzidos por fermentação em estado sólido, indicando o potencial do uso da proteína de soja como aditivo para minimizar a adsorção improdutiva das enzimas na lignina. De modo geral, o presente trabalho conseguiu uma contribuição final interessante no processo de produção das celulases e a aplicação do coquetel enzimático na hidrólise do bagaço de cana.

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