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Determinação de fármacos fenólicos em produtos farmacêuticos utilizando um biossensor de polifenoloxidase, obtida de extrato bruto do fruto da jurubeba (Solanum paniculatum L.) / Determination of phenolic drugs in pharmaceutical products using a polyphenoloxidase biosensor, obtained from crude extract of jurubeba (Solanum paniculatum L.)Antunes, Rafael Souza 05 March 2018 (has links)
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Previous issue date: 2018-03-05 / The use of plant enzymes for analytical purposes is increasing every day, especially in the field
of biotechnology linked to the development of new and more specific analytical instruments.
In this way, the development of biosensors has been increasing since these allow the
measurement of the analyte of interest to be performed by the selective transduction of a
parameter of the target-analyte reaction that can be monitored. For this reason, the biological
element that makes up the instrument, becomes an essential component for its construction.
Polyphenoloxidase is an enzyme that catalyzes the conversion of a phenolic compound to a
quinone, which can be reduced electrochemically and thus allows the detection (quantification)
of the analyte of interest. This enzyme is widely distributed in plants and is widely used in the
production of biosensors and the selective evaluation of phenolic drugs in pharmaceutical
formulations and total phenols in industrial effluents. The polyphenoloxidases in this specific
work were extracted from the fruit of Jurubeba (Solanum paniculatum L.) and used in the
development of carbon paste electrochemical biosensors in the determination of phenolic
drugs, such as paracetamol, ascorbic acid, salicylic acid and or methyldopa. Under
experimental conditions the effect of the amount of enzymatic extract in the carbon paste
ranging from 50 to 200 μL and the optimum pH of 3.0 to 9.0 using the differential pulse
voltammetry technique was investigated. After optimization, the intermediate precision of the
biosensor was tested through its reproducibility through the tests of repeatability, time of
conditioning, stability and linearity. Soon after, used in the determination of the drugs,
obtaining a better response in the detection of paracetamol, in this way, the calibration curve
was realized and consequently applied in the determination of paracetamol of commercial
samples in tablets. The biosensor had a linearity in the range of 5 to 245 μM, with a detection
limit of 3 μM. The polyphenoloxidase extracted from the fruit of Jurubeba showed peculiar
characteristics that it provided in the technological development of biosensors with application
in the quality control of phenolic drugs, exhibiting high sensitivity, satisfactory selectivity,
good repeatability and adequate stability. / O uso de enzimas vegetais para fins analíticos vem aumentando a cada dia, principalmente
no ramo da biotecnologia ligada ao desenvolvimento de novos instrumentos de análises cada
vez mais específicos. Desta forma, o desenvolvimento de biossensores vem crescendo, já que
estes permitem que a medida do analito de interesse seja realizada pela transdução seletiva
de um parâmetro da reação analito-alvo passível de ser monitorado. Por este motivo, o
elemento biológico que compõe o instrumento, torna-se um componente essencial para a sua
construção. A polifenoloxidase é uma enzima que catalisa a conversão de um composto
fenólico a uma quinona, que pode ser reduzida eletroquimicamente e permite assim a detecção
(quantificação) do analito de interesse. Esta enzima é amplamente distribuída nos vegetais e
bastante utilizada na produção de biossensores e na avaliação seletiva de fármacos fenólicos
em formulações farmacêuticas e de fenóis totais em efluentes industriais. As
polifenoloxidases, neste trabalho em específico, foram extraídas do fruto da Jurubeba
(Solanum paniculatum L.) e utilizadas no desenvolvimento de biossensores eletroquímicos de
pasta de carbono na determinação de fármacos fenólicos, tais como o paracetamol, o ácido
ascórbico, o ácido salicílico e o metildopa. Sob condições experimentais foram investigados o
efeito da quantidade de extrato enzimático na pasta de carbono que variou-se de 50 a 200 μL
e o pH ótimo de 3,0 a 9,0, utilizando a técnica de voltametria de pulso diferencial. Após
otimizado, foi testado a precisão intermediária do biossensor através de sua reprodutibilidade
por meio dos teste de repetibilidade, tempo de condicionamento, estabilidade e linearidade.
Logo em seguida, empregado na determinação dos fármacos, obtendo uma melhor resposta
na detecção do paracetamol, dessa forma, foi realizado a curva de calibração e
consequentemente aplicado na determinação do paracetamol de amostras comerciais em
comprimidos. O biossensor apresentou uma linearidade na faixa de 5 a 245 μM, com um limite
de detecção de 3 μM. Frente aos resultados alcançados foi evidenciado que a polifenoloxidase
extraída do fruto da jurubeba apresentou características peculiares que proporcionou no
desenvolvimento tecnológico dos biossensores com aplicação no controle de qualidade dos
fármacos fenólicos, exibindo alta sensibilidade, seletividade satisfatória, boa repetibilidade e
estabilidade adequada.
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Purificação parcial de colinesterase de prochilodus brevis para emprego biotecnológico / Partial Purification of Cholinesterase of Prochilodus brevis for Biotechnological ApplicationLeoncini, Giovanni Ortiz 31 May 2016 (has links)
The cholinesterase (ChE) play an important role in the organophosphates and carbamates detection substances that are of high interest for environmental control, because these compounds are present in most pesticides applied to crops. The development of ChE biosensors to detect these contaminants with greater speed, sensitivity and selectivity, has the ability to quantify from a suitable transducer, the reduction of enzyme activity caused by contaminants. This study aimed to purify and characterize AChE of Prochilodus brevis brain for use in electrochemical tests. Gradients of pH, ionic strength and temperature, showed high activities in pH 8,5, 0,08M at ionic strength, 28Cº of temperature optimum and 37ºC of thermal stability for cell-free extract. Was applied salting out method in fractions 0-70% followed by 0-40% of (NH4)2SO4 as a refinement to liquid chromatography. The purification protocol 1 showed specific activity of 1.41 U/mg in 0-70% and 0-40% was 1.94 U/mg. The purification protocol 2, the 0-70% fraction had specific activity of 0.31 U/mg and 0-40% with 1.77 U/mg. After Sephacryl S-200 chromatography, showed specific activity for protocols 1 and 2 of 0,128U/mg and 0.2869 U/mg, respectively. The next stage of the Protocol 2 with DEAE-Sepharose was eluted peak with specific activity of 0.01326 U/mg. In the purification protocol 3, 0-70% have specific activity 0.310 U / mg, followed by 1,774 U/mg in 0-40%. After Sephacryl S-100, was obtain two peaks with a specific activity of 0.194 U/mg (ChE1) and 0.0873 U/mg (ChE2). SDS-PAGE of ChE 1 showed somewhat visible band of approximately 67kDa. Inhibition assays with ChE 1 had higher specificity for BW 284c51. Electrochemical tests with cell-free extract, dialyzed, ChE1 and ChE2, showed thiocholine (TCh) oxidation with better limits of detection and quantification limits for ChE1 and ChE2. The molecular modeling experiments showed favorable results in complex formation ChE-NTCPM. The study showed the isolation of ChE with catalytic activity for both enzymes, AChE and BuChE, with favorable adsorption properties in NTCPM in the development of enzymatic biosensor for environmental monitoring. / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / As colinesterases (ChE) desempenham um papel importante na detecção de organofosforados e carbamatos que são substâncias de alto interesse para o controle ambiental, pois estes compostos estão presentes na maioria dos pesticidas aplicados em lavouras. O desenvolvimento de biossensores a base de ChE para a detecção destes contaminantes com maior rapidez, sensibilidade e seletividade, tem a capacidade de quantificar, a partir de um transdutor adequado, a diminuição da atividade enzimática causada pelos contaminantes. Este trabalho teve como objetivo de purificar e caracterizar AChE de cérebro de Prochilodus brevis para o emprego em testes eletroquímicos. Os gradientes de pH, força iônica e temperatura, mostraram maiores atividades em pH 8,5, força iônica de 0,08M, temperatura ótima 28°C e estabilidade térmica de 37°C para extrato livre de células. Foi aplicado o método de precipitação salina em frações de 0-70% seguido de 0-40% de (NH4)2SO4 como refinamento para cromatografia líquida. O protocolo de purificação 1 apresentou atividade específica de 1,41 U/mg em 0-70%, enquanto 0-40% apresentou 1,94 U/mg. O protocolo de purificação 2, a fração 0-70% teve atividade específica de 0,31 U/mg e 0-40% de 1,77 U/mg. Após a cromatografia de sephacryl S-200 apresentou atividade específica para os protocolos 1 e 2 de 0,128U/mg e 0,2869 U/mg, respectivamente. Na continuidade do protocolo 2 com DEAE-sepharose o pico eluído apresentou atividade específica de 0,01326 U/mg. No protocolo de purificação 3, 0-70% tem atividade específica 0,310 U/mg, seguido de 1,774 U/mg em 0-40%. Após Sephacryl S-100 foi obtido dois picos com atividade específica de 0,194 U/mg (ChE1) e 0,0873 U/mg (ChE2). Eletroforese SDS-PAGE de ChE1 apresentou banda pouco visível de aproximadamente 67KDa. Os ensaios de inibição com ChE1 apresentaram maior especificidade para BW 284c51. Os testes eletroquímicos com extrato livre de célula, dialisado, ChE1 e ChE2, mostraram oxidação de tiocolina (TCh) com melhores limites de detecção e quantificação para ChE1 e ChE2. Os experimentos de modelagem molecular apresentaram resultados favoráveis na formação do complexo ChE-NTCPM. O estudo mostrou o isolamento de ChE com atividade catalítica para as duas enzimas, AChE e BuChE, com propriedades de adsorção favoráveis em NTCPM no desenvolvimento de biossensor enzimático para monitoramento ambiental.
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Detec??o eletroqu?mica de ?cido ?rico utilizando eletrodos de grafite modificados com azul da Pr?ssia / Poli(?cido 4-aminosalic?lico) / UricasePaula, Fernanda de Souza 30 January 2017 (has links)
Disponibiliza??o do trabalho em conte?do parcial, conforme Termo de Autoriza??o. / Submitted by Jos? Henrique Henrique (jose.neves@ufvjm.edu.br) on 2017-03-27T19:34:05Z
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Previous issue date: 2017 / O trabalho investiga a utiliza??o de plataformas eletroqu?micas contendo filmes polim?ricos
derivados do ?cido 4-aminosalicico (4-AMS) para imobiliza??o da enzima Urato oxidase
(UOx) visando aplica??o na quantifica??o de ?cido ?rico (AU) em amostras de urina.
Investigou-se a eletrodeposi??o do 4-AMS pelas t?cnicas de voltametria c?clica (VC) e
cronoamperometria (CA) sobre eletrodos de grafite (EG). Por VC foram realizados 100 ciclos
de potencial na faixa de -0,25 a 1,25 V ? 50 mV/s em solu??o 2,50 mM do mon?mero preparado
em H2SO4 0,50 M. Utilizando a CA, a eletropolimeriza??o foi realizada a potencial constante
de +0,928 V durante 5600s no mesmo meio reacional utilizado na VC. O poli(4-AMS) obtido
por VC e CA mostrou dois pares redox, os quais est?o relacionados a eletroatividade do filme
polim?rico, na regi?o de potencial de +0,50/+0,40 V. Contudo, maiores valores de Ipa e Ipc foram
obtidos para os eletrodos modificados por VC, sugerindo que estes filmes s?o mais eletroativos.
A deposi??o do azul da Pr?ssia (AP), mediador da rea??o de per?xido, foi investigada sobre os
EG, com posterior modifica??o com poli(4-AMS). Notou-se que a presen?a do AP n?o altera o
perfil voltam?trico da eletropolimeriza??o do 4-AMS. Contudo, quando comparada com a
eletropolimeriza??o somente nos EG, obteve-se filmes mais resistivos e com menor
eletroatividade. Analisando as propriedades eletroqu?micas e morfol?gicas, por VC conseguiuse
filmes mais uniformes, com maior quantidade de material depositado e maior eletroatividade.
A eletropolimeriza??o foi realizada tamb?m sobre eletrodos impressos de grafite contendo azul
da Pr?ssia (EI/AP), onde posteriormente imobilizou-se 5 U da UOx, e o biossensor foi acoplado
a uma c?lula de fluxo num sistema de an?lise por inje??o em fluxo (FIA) de linha ?nica. A
vaz?o e o volume da al?a de amostragem foram otimizados em 2,10 mL/min e 200 ?L,
repectivamente. O valor de pH da solu??o do analito foi otimizado em 8,27. Medidas de
reprodutibilidade mostraram desvio padr?o de 2,15% (n=10). O biossensor respondeu
linearmente para AU na faixa de 1,0 x 10-5 a 2,0 x 10-4 M, com limite de detec??o de 3,0 ?M.
Amostras de urina foram dilu?das (1:10) e injetadas diretamente no biossensor. A reposta foi
reprodut?vel mostrando baixo desvio padr?o para as medidas, e valores encontrados dentro da
faixa esperada para o analito em amostras de urina. Testes de adi??o e recupera??o mostraram
valores de 97,35% (?2,43). O biossensor mostrou-se bastante promissor para a proposta do
trabalho, apresentando resultados muito satisfat?rios para as an?lises e par?metros investigados. / Disserta??o (Mestrado) ? Programa de P?s-Gradua??o em Qu?mica, Universidade Federal dos Vales do Jequitinhonha e Mucuri, 2017. / This work investigates the use of electrochemical platforms containing polymeric films derived
from 4-aminosalicylic acid (4-ASA) modified with the enzyme Urate oxidase (UOx) for
quantification of uric acid (UA) in urine samples. The electrodeposition of 4-ASA was
investigated through Cyclic Voltammetry (CV) and Chronoamperometry (CA) on graphite
electrodes (GE). 100 cycles were performed in the range of -0.25 to 1.25 V at 50 mV/s in 2.50
mM monomer solution prepared in 0.50 M H2SO4. Using CA, the deposition was performed at
a potential of +0.928 V for 5600 s in the same CV reaction medium. The poly(4-ASA) showed
two redox pairs related to the electroactivity of the polymeric film in the potential range of +
0.50 /+ 0.40 V. However, higher values of Ipa and Ipc were obtained for the electrodes modified
through CV, suggesting that these films are more electroactive. The deposition of Prussian blue
(PB), mediator of the peroxide reaction, was investigated on the GE with subsequent
modification with poly (4-ASA). It was observed that the presence of PB does not alter the
voltammetric profile of 4-ASA electropolymerization. However, when compared with the
electropolymerization in bare GE, more resistive films were obtained with lower electroactivity.
Analyzing the electrochemical and morphological properties through CV, more uniform films
were obtained, with more material deposited and greater electroactivity. The
electropolymerization of poly(4-ASA) was also conducted on screen printed electrodes
containing Prussian Blue (SPE/PB), with subsequent immobilization of 5U of Uox. This
biosensor was coupled to a flow cell in a Flow Injection Analysis (FIA) system of single line.
The flow rate and the sampling loop volume were optimized at 2.10 mL/min and 200 ?L,
respectively. The pH value of the analyte solution was optimized at 8.27. Reproducibility
measures showed a standard deviation of 2.15% (n = 10). The biosensor responded linearly to
UA in the range of 1.0 x 10-5 to 2.0 x 10-4 M, with a detection limit of 3.0 ?M. Urine samples
were diluted (1:10) and directly injected over the biosensor. The response was reproducible
with low standard deviation and values found within the range expected for the analyte in urine
samples. Addition and recovery tests showed values of 97.35% (?2.43). The biosensor is very
promising for the work proposal, presenting very satisfactory results for the analyzes and
investigated parameters.
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