Made available in DSpace on 2015-12-06T22:54:33Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2009 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Ministerio de Planificación de Chile (MIDEPLAN) / Em nosso laboratório foi isolado um clone recombinante de T. cruzi, denominado H49, que codifica repetições de 68 aminoácidos (aa) dispostas em tandem. Estas repetições são encontradas em um antígeno imunodominante de aproximadamente 240 kDa que está envolvido na ligação do flagelo ao corpo do parasita, conhecida como zona FAZ. Este trabalho relata a caracterização da estrutura do gene e da proteína H49. Buscas no banco de dados de T. cruzi utilizando o algoritmo BLAST revelaram que as repetições de 68 aa são encontradas em uma região central de oito calpaínas-like cisteínas peptidases. Em duas dessas, as repetições H49 são altamente conservadas e organizadas em tandem. Nas outras seis calpaínas-like encontradas, as repetições eram degeneradas e podem ser separadas por pequenas seqüências não repetitivas. Essas proteínas apresentaram domínios característicos de cisteínas proteinases cálciodependente, como Cys-Pc e Calpain_III. A associação entre as seqüências H49 e calpaína foi confirmada por amplificação por PCR e análises de clones de YAC utilizando oligonucleotídeos específicos para amplificar regiões especificas de calpaína e repetições H49. O locus H49 foi mapeado no clone CL Brener utilizando uma sobreposição de clones de YAC. A associação da repetição H49 e calpaínas nos YACs foi demonstrada por PCR e por análise de restrição. Corroborando com dados obtidos, a análise por “chromoblot” revelou que as sondas H49 e calpaína hibridizam com as mesmas bandas cromossômicas. Nossos dados indicam que as repetições H49 fazem parte de um subgrupo de genes da calpaína e, portanto, denominados H49/calpaína. Recentemente uma nova família de proteínas associadas ao citoesqueleto foi descrita em Trypanosoma brucei e Leishmania. Estas proteínas são caracterizadas por sua similaridade com a região catalítica da calpaína, assim como pela presença de seqüências de aminoácidos repetidas em tandem que apresentam similaridade de 30-40% com a repetição H49. Esses resultados sugerem que a aquisição da calpaína, contendo repetições pelos tripanossomatídeos (talvez por fusão de genes) foi um evento tardio na evolução dessa família de proteínas. Para avaliar a ocorrência e a distribuição subcelular da proteína H49/calpaína em epimastigotas, diferentes domínios da calpaína e da repetição de 68 aa foram expressas em bactérias, as proteínas foram purificadas e utilizadas na imunização de coelhos e camundongos. Os anticorpos policlonais purificados foram utilizados para estudar a organização e distribuição subcelular das repetiçãos de 68 aa e calpaína em T. cruzi. Em “immunoblotting”, anticorpos contra o domínio calpaína e contra as repetições de 68 aa reagiram com uma proteína de 240 kDa presente no extrato total de epimastigotas. Anticorpos anti-calpaína reagiram com bandas adicionais de aproximadamente 170, 60 e 56 kDa que correspondem a calpaínas sem as repetições de 68 aa. Análise de imunofluorescência revelou que a proteína H49/calpaína está localizada apenas na região de adesão entre o corpo celular e o flagelo. A calpaína, além de ser encontrada no flagelo, também é encontrada no citoplasma. Além disso, a H49/calpaína associada ao citoesqueleto colocalizou com marcadores da zona de adesão flagelar (FAZ). Domínios repetitivos da H49/calpaína contem alfa hélices (“helix-turn-helix”) que poderiam estar organizadas em uma estrutura enovelada em uma estrutura “coiled-coil”. Sugerimos que as proteínas H49/calpaína formariam um homodímero que poderia ligar a membrana do flagelo à membrana do corpo celular na zona de adesão flagelar. / We have previously isolated a T. cruzi recombinant clone, termed H49, that encodes tandemly arranged repeats of 68-amino acids (aa). The repeats are found in an immunodominant antigen (~240 kDa) which is involved in the attachment of the flagellum to the cell body in the FAZ region of the parasite. Here we present further characterization of the structure of H49 gene and protein. Blast search of T. cruzi databases showed that the 68-aa repeats can be found in the central domain of 8 calpain-like cysteine peptidases. In two of them, the H49 repeats are highly conserved and arranged in tandem arrays, whereas in other calpains the repeats are degenerated and can be separated by short nonrepeat sequences. These proteins show the domains Cys-Pc and calpain_III, characteristics of calcium-dependent cysteine proteinases. The association between H49 and calpain sequences was further confirmed by PCR amplification and analysis of YAC clones using primers designed to amplify specific regions of calpain and H49 repeat. We mapped the H49 locus in clone CL Brener using YAC overlapping clones. The association of H49 and calpain in these YACs was demonstrated by PCR and restriction analysis. Consistent with this, chromoblot analysis revealed that H49 and calpain probes hybridized with the same chromosomal bands. Our data indicate that the H49 repeats are part of a subset of calpain genes, and they were termed H49/calpains. Recently, a novel family of cytoskeleton-associated proteins was described in Trypanosoma brucei and Leishmania. These proteins are characterized by their similarity to the catalytic region of calpain, and also by the presence of tandemly arranged amino acid repeats that share 30-40% similarity with H49. These results suggest that the acquisition by trypanosomatids of calpain containing repeats (maybe by gene fusion) was a relatively late event in the evolution of this family of proteins. To study the occurrence and subcellular distribution of H49/calpain protein in epimastigotes, we have expressed different domains of the calpain and the 68-aa repeats in bacteria, purified the proteins, and employed them to immunize rabbits and mice. The affinity purified polyclonal antibodies were used as probes to study the organization and subcellular distribution of 68-aa repeats and calpain in T. cruzi. Antibodies raised against the calpain domains and 68-aa repeats reacted, by immunoblot analysis, with a ~240 kDa protein in the whole epimastigote extracts. Anti-calpain antibodies reacted with additional bands of ~170, 60 and ~56 kDa which correspond to the calpain proteins without 68-aa repeats. Immunofluorescence analysis showed that H49/calpain-like protein is only localized in the region of adhesion between the cell body and flagellum. Calpain was present not only in the flagella, but it was also localized in the cytoplasm. Further, the cytoskeleton-associated H49/calpain was colocalized with markers of the flagellar attachment zone (FAZ). Repetitive domain of H49/calpains contain alpha-helices (helix-turn-helix) that could be arranged in a coiled-coil rope-like structure. We suggest that H49/calpain proteins form a homodimer that could link the flagellar membrane to the cell body membrane at the flagellar attachment zone. / BV UNIFESP: Teses e dissertações