Orientador: Ladaslav Sodek / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Isntituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-07-22T01:08:30Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Chagas_ElianaPereira_D.pdf: 9581798 bytes, checksum: 49359674666b604ff2cfcba8f66addc7 (MD5) Previous issue date: 1997 / Resumo: A asparaginase (ASNase-EC 3.5.1.1.) de semente imatura de ervilha (Pisum sativum L.) varo Bolero foi purificada e caracterizada. A ASNase foi dependente de K+ para sua ativação e a presença de íons Ca2+ nos tampões de extração e purificaçcão permitiu uma maior recuperação da atividade da enzima. O Ca2+ pode auxiliar na manutenção da estrutura ativa da enzima. A ASNase apresentou duas isoformas, eluídas separadamente em cromatografia de exclusão. A primeira de 200.000 g/mol com atividade mais baixa e a segunda, com 69.000 g/mol, com a maior atividade, sendo portanto, a principal forma da enzima. A ASNase apresentou pI de 4,5 a 5 e [(m de 2,4 mM para Asn. A enzima foi inibida competitivamente por Gly e Asp, e os resultados indicaram que o Asp seria liberado na reação após o NH4 +. Através das reações imunológicas, foi observado que anticorpo produzido contra a ASNase de semente de ervilha reconheceu bandas na mesma posição que a ASNase de ervilha em extratos de sementes de outras espécies: Crotalaria juncea, C. paulina (ambas dependentes de K+) e C. zanzibarica (independente). A ASNase de ervilha também apresentou reação cruzada com anticorpos produzidos contra ASNase de C. juncea e Lupinus polyphyllus (independente de K+), sugerindo alguma homologia entre as moléculas, e também que a parte da molécula que determina dependência ao K+ não coincide com aquela reconhecida pelo anticorpo / Abstract: Asparaginase (ASNase-EC 3.5.1.1) from immature seed of Pisum sativum L. cv. Bolero was characterized and purified. ASNase from pea seed was dependent upon the presence of K+ for activity and the presence of Ca2+ in the extraction buffers pertmitted a higher recovery of activity. The Ca2+ ions could assist the active ASNase structure. The enzyme showed two active isoforms, eluted separately from exclusion chromatography. The first isoform (200.000 g/mol) presented lower activity and the second (69.000 gjmol) with the highest activity, was the main formo This enzyme showed a pI near to 4,5-5 and a J(m of 2,4 mM for Asn. Gly and Asp were competitive inhibitors of the enzyme. Asp would appear to be released from the enzyme after NH4 +. Western blot analysis demonstrated the presence of bands coinciding with the ASNase from pea seed in seed extract from other species: Crotalaria juncea J Crotalaria paulina (K+dependent) and Crotalaria zanzibarica (K+ -independent). ASN ase from pea seed showed a cross-reaction with antibodies against ASNase from Crotalaria juncea and Lupinus polyphyllus (K+ -independent), suggesting a similarity between the enzymes, and that the part of the molecule involved in the K+ dependency is not coincident with that recognized by the antibody / Doutorado / Doutor em Ciências

Submitted by Amauri Alves (amauri.alves@ufv.br) on 2015-11-05T15:19:50Z No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 1256591 bytes, checksum: 7fb1f90875c23ff0319fba481041b6af (MD5) / Made available in DSpace on 2015-11-05T15:19:50Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 1256591 bytes, checksum: 7fb1f90875c23ff0319fba481041b6af (MD5) Previous issue date: 2013-08-21 / A aplicação de ON em sementes tem se mostrado promissora, uma vez que as sementes em contato com a solução de nitroprussiato de sódio (SNP), doador de ON, em geral, germinam mais e com maior velocidade, tolerando melhor tanto estresses abióticos como a deterioração natural ocasionada pelo armazenamento. Assim, na presente pesquisa, teve-se como objetivo avaliar as principais alterações que ocorrem na durante a germinação de sementes de ervilha devido à aplicação do ON. Para tanto, foram conduzidos dois experimentos. No primeiro experimento, três lotes de sementes de ervilha com diferentes níveis de qualidade fisiológica foram semeados em substrato umedecido com água (controle) ou com solução de SNP (50 μM). Adotou-se o delineamento inteiramente casualizado, com quatro repetições. Os dados foram submetidos à análise de variância e as médias foram analisadas pelo teste F a 5% de probabilidade. No segundo experimento, sementes de ervilha foram semeadas em substrato umedecido com água (controle), solução de polietilenoglicol [PEG 6000 (-0,15 MPa)] e solução de PEG 6000 + SNP (-0,15 MPa; 50 μM). O delineamento estatístico adotado foi inteiramente casualizado com quatro repetições. Os dados foram submetidos a análise de variância e as médias foram analisadas pelo teste Tukey a 5% de probabilidade. Conclui-se que o ON não aumenta a germinação das sementes de ervilha, entretanto há aumento no vigor. Sementes com menor potencial fisiológico respondem melhor à aplicação do ON. O estresse hídrico diminui a germinação e o vigor das sementes de ervilha e causa desbalanço das espécies reativas de oxigênio. A aplicação do SNP promoveu maior germinação e maior velocidade de germinação em sementes sob estresse hídrico. Houve maior atividade das amilases, das enzimas antioxidativas e menor conteúdo de H 2 O 2 , menor liberação de O 2- e menor peroxidação de lipídeos em sementes tratadas com doadores de ON. / The NO application in seeds has shown promising, because the seeds in contact with the sodium nitroprusside (SNP) solution, NO donor, usually germinates more and faster and are more tolerant to abiotic stresses such as natural deterioration caused by storage. Thus, it is interesting to know how the NO acts on the seeds germination to improve the early seedling development. Therefore, the research aimed to evaluate the main changes that occur during the germination of pea seeds due the NO application. Therefore, two experiments were conducted. In the first one, three lots of pea seeds with different physiological potential levels were sown in a substrate with water (control) or with SNP solution (50 μM). It was adopted the completely randomized design with four replications. The data were subjected to variance analysis and the means were analyzed by F test at 5% of probability. In the second experiment, pea seeds were sown in a substrate with water (control), polietilenoglicol [PEG 6000 solution (-0,15 MPa)] and PEG 6000 + SNP solution (-0,15 MPa; 50 μM). It was adopted the completely randomized design with four replications. The data were subjected to variance analysis and the means were analyzed by Tukey test at 5% of probability. To conclude, the NO does not increase the germination of pea seeds, but increase the seeds vigor. Seeds with lower physiological potential gives a better response to the NO application. Water stress decrease the germination and vigor of pea seeds and cause reactive oxygen species imbalance. The SNP application promoted a higher and faster germination in seeds under water stress. There were higher activity of the amylases, higher activity of the antioxidative enzymes, less H 2 O 2 content, less O 2- liberation and consequently less lipid peroxidation in seeds treated with NO.