Eritrocruorinas são hemoglobinas gigantes compostas por uma bicamada hexagonal de massa molecular total entre 3,0 e 4,0 MDa. A sua estrutura é baseada em unidades básicas chamadas protômeros. Doze destes compõem a partícula inteira, seis em cada camada hexagonal, resultando numa estrutura contendo 180 subunidades. Nas eritrocruorinas do tipo I, o protômero é constituído por quatro tipos de cadeias de globina: a, b, c, e d, e por três tipos de cadeias de linkers, L1, L2 e L3. A compreensão atual do seu mecanismo da ação esta atualmente prejudicada pela resolução limitada das estruturas cristalográficas disponíveis. Para abordar esta questão procuramos cristalizar uma serie de eritrocruorinas de espécies diversas visando a determinação das suas estruturas a mais alta resolução. Na primeira parte deste trabalho a eritrocruorina de Glossoscolex paulistus (HbGp) teve suas subunidades sequenciadas e a estrutura da partícula inteira resolvida a uma resolução de 3,2Å, a mais alta até o momento. Na estrutura da HbGp as quatro cadeias de globina se associam na forma de um heterotetrâmero, que se repete três vezes formando uma estrutura dodecamérica denominada cap. A estrutura do cap associada a um heterotrímero de linkers forma o então mencionado protômero. A estrutura completa permite uma descrição mais detalhada dos contatos entre subunidades que são essenciais para a manutenção da partícula como um todo. Além disto descrevemos sítios de ligação a metais (Zn2+ e Ca2+) e sítios de glicosilação, alguns dos quais são inéditos. Em seguida, a subunidade d isolada da HbGp foi cristalizada e resolvida a 2.1Å. Uma analise dos contatos cristalinos demonstra um arranjo completamente diferente daquilo visto para a subunidade d no complexo inteira. Ao invés de associar-se na formar trimeros, como acontece no complexo, a cadeia d isolada forma dímeros cristalográficos, com interface similar a aquela observada entre as cadeias d e a. Estas observações contribuíram para a compreensão de como são os possíveis mecanismos de associação das globinas para a montagem do cap. Finalmente, as eritrocruorinas de quatro outras espécies foram cristalizadas, que resultou na obtenção de uma estrutura cristalográfica preliminar para a eritrocruorina de Eisenia Andrei a uma resolução de 4.7Å. / Erythrocruorins are giant haemoglobins in the form of a hexagonal bilayer of total molecular mass between 3 and 4 MDa. Their structures are based on a basic unit called the protomer. Twelve of these comprise the entire particle, six in each hexagonal layer, resulting in a structure containing 180 subunits. In the type I erythrocruorins the protomer is composed of four types of globin chains: a, b, c e d, and three types of linker; L1, L2 e L3. Our current understanding of their mechanism of action is limited by the resolution of the crystal structures available. To address this question we have attempted to crystallize a series of erythrocruorins from different species with a view to determining a crystal structure at higher resolution. In the first part of this thesis all chains of the erythrocruorin from Glossoscolex paulistus were completely sequenced and the structure of the full particle solved at 3.2Å, the highest reported to date. In the structure the four globin chains associate to form a heterotetramer, three of which unite to form a dodecameric cap. The latter associates with a heterotrimer of linkers to form the aforementioned protomer. The full structure permits a more detailed description of the contacts between subunits which are essential for particle stability. Furthermore, we describe metal binding sites (Zn2+ e Ca2+) and glycosylation sites, some of which are have not been reported previously. Subsequently the isolated d chain was crystallized and solved to 2.1Å. An analysis of the crystal contacts shows an arrangement which is completely different to that seen in the full particle. Instead of forming trimers, as seen in the complex, the isolated d chain associates to form a dimer across a crystallographic twofold axis making use of the interface normally used to associate with subunit a. These observations contributed to our understanding of the possible mechanisms of association of globin chains during the formation of the cap. Finally, the erythrocruorins from four other species were crystallized, which resulted in the preliminary determination of the structure of that from Eisenia Andrei at 4.7Å.

Eritrocruorinas são hemoglobinas gigantes compostas por uma bicamada hexagonal de massa molecular total entre 3,0 e 4,0 MDa. A sua estrutura é baseada em unidades básicas chamadas protômeros. Doze destes compõem a partícula inteira, seis em cada camada hexagonal, resultando numa estrutura contendo 180 subunidades. Nas eritrocruorinas do tipo I, o protômero é constituído por quatro tipos de cadeias de globina: a, b, c, e d, e por três tipos de cadeias de linkers, L1, L2 e L3. A compreensão atual do seu mecanismo da ação esta atualmente prejudicada pela resolução limitada das estruturas cristalográficas disponíveis. Para abordar esta questão procuramos cristalizar uma serie de eritrocruorinas de espécies diversas visando a determinação das suas estruturas a mais alta resolução. Na primeira parte deste trabalho a eritrocruorina de Glossoscolex paulistus (HbGp) teve suas subunidades sequenciadas e a estrutura da partícula inteira resolvida a uma resolução de 3,2Å, a mais alta até o momento. Na estrutura da HbGp as quatro cadeias de globina se associam na forma de um heterotetrâmero, que se repete três vezes formando uma estrutura dodecamérica denominada cap. A estrutura do cap associada a um heterotrímero de linkers forma o então mencionado protômero. A estrutura completa permite uma descrição mais detalhada dos contatos entre subunidades que são essenciais para a manutenção da partícula como um todo. Além disto descrevemos sítios de ligação a metais (Zn2+ e Ca2+) e sítios de glicosilação, alguns dos quais são inéditos. Em seguida, a subunidade d isolada da HbGp foi cristalizada e resolvida a 2.1Å. Uma analise dos contatos cristalinos demonstra um arranjo completamente diferente daquilo visto para a subunidade d no complexo inteira. Ao invés de associar-se na formar trimeros, como acontece no complexo, a cadeia d isolada forma dímeros cristalográficos, com interface similar a aquela observada entre as cadeias d e a. Estas observações contribuíram para a compreensão de como são os possíveis mecanismos de associação das globinas para a montagem do cap. Finalmente, as eritrocruorinas de quatro outras espécies foram cristalizadas, que resultou na obtenção de uma estrutura cristalográfica preliminar para a eritrocruorina de Eisenia Andrei a uma resolução de 4.7Å. / Erythrocruorins are giant haemoglobins in the form of a hexagonal bilayer of total molecular mass between 3 and 4 MDa. Their structures are based on a basic unit called the protomer. Twelve of these comprise the entire particle, six in each hexagonal layer, resulting in a structure containing 180 subunits. In the type I erythrocruorins the protomer is composed of four types of globin chains: a, b, c e d, and three types of linker; L1, L2 e L3. Our current understanding of their mechanism of action is limited by the resolution of the crystal structures available. To address this question we have attempted to crystallize a series of erythrocruorins from different species with a view to determining a crystal structure at higher resolution. In the first part of this thesis all chains of the erythrocruorin from Glossoscolex paulistus were completely sequenced and the structure of the full particle solved at 3.2Å, the highest reported to date. In the structure the four globin chains associate to form a heterotetramer, three of which unite to form a dodecameric cap. The latter associates with a heterotrimer of linkers to form the aforementioned protomer. The full structure permits a more detailed description of the contacts between subunits which are essential for particle stability. Furthermore, we describe metal binding sites (Zn2+ e Ca2+) and glycosylation sites, some of which are have not been reported previously. Subsequently the isolated d chain was crystallized and solved to 2.1Å. An analysis of the crystal contacts shows an arrangement which is completely different to that seen in the full particle. Instead of forming trimers, as seen in the complex, the isolated d chain associates to form a dimer across a crystallographic twofold axis making use of the interface normally used to associate with subunit a. These observations contributed to our understanding of the possible mechanisms of association of globin chains during the formation of the cap. Finally, the erythrocruorins from four other species were crystallized, which resulted in the preliminary determination of the structure of that from Eisenia Andrei at 4.7Å.

The viability of multicellular aerobic organisms requires the binding and transport of molecular oxygen from the atmosphere to sites of metabolism. In the earthworm, Lumbricus terrestris, erythrocruorins are freely dissolved multi-subunit protein complexes that serve the same functions as red blood cells The aims of this study were to 1) determine the overall arrangement of hemoglobin chains and non-hemoglobin chains in Lumbricus erythrocruorin, 2) determine the stereochemical determinants specifying erythrocruorin's hierarchical symmetry, and 3) investigate the molecular and chemical basis for the remarkable cooperative binding of ligands to earthworm hemoglobin. Erythrocruorin is a highly cooperative oxygen-carrying protein with Hill coefficients measured at some pH's as high as n = 7.9. Crystallographic analysis of the whole erythrocruorin molecule structure to 5.5 Å resolution reveals a hierarchical organization of 144 oxygen-binding polypeptides and 36 non-hemoglobin linker polypeptide chains. The hemoglobin chains are arranged in a novel dodecameric substructure at the periphery of the complex, whereas 36 linker chains comprise the inner core and projected triple-stranded, helical coiled-coil spokes towards the center of the complex. Interdigitation of these spokes appears crucial for stabilizing the complex. Crystallographic analysis of crystals from isolated hemoglobin chains provides greater detail (resolution = 2.6 Å) and complete atomic models for the hemoglobin polypeptides. Comparison of these models with other hemoglobins reveal unique features in the distal heme pocket, including large aromatic residues at the B10 position in three of the four hemoglobin chains. Aromatic residues at this position have been implicated in other hemoglobins to confer resistance to oxidation. Molecular interactions across each subunit include pH-dependent interactions that are consistent with the observed Bohr effect on oxygen binding. Specifically a π-cation interaction between an arginine of one subunit to a histidine of the opposing subunit is likely an important molecular switch in the allosteric transition from a low to high affInity ligand-binding state.