Les récepteurs Erythropoietin-producing hepatocyte (EPH) constituent la plus grande famille de récepteurs à activité tyrosine kinase transmembranaires. Leur activité kinase peut être induite par leurs ligands, les éphrines (EFN). Une fois activés, ces récepteurs sont impliqués dans la régulation de la fonction cellulaire par transduction antérograde ou rétrograde du signal EPH-EFN. Au cours de la dernière décennie, nos études ont démontré que les EPH / EFN jouent un rôle important dans la régulation de la pression artérielle par la modulation de la contractilité des cellules musculaires lisses vasculaires (VSMC). EPHB6, EFNB1 et EFNB3 ont un effet négatif sur la contractilité des VSMC et la pression artérielle, tandis que EPHB4 et EFNB2 montrent un effet positif. La famille EPH / EFN est donc un nouveau système yin et yang qui ajuste finement l'homéostasie de la pression artérielle. Nous avons également constaté que les catécholamines urinaires de 24 h sont réduites chez les souris mâles EPHB6 knockout (KO), suggérant que l’EPHB6 régule la pression artérielle non seulement via les VSMC mais aussi par la sécrétion de catécholamine (CAT). La régulation de CAT par l’EPHB6 dépend de la testostérone car (1) les niveaux réduits de CAT ne sont pas observés chez les souris femelles EPHB6 KO ; et (2) la castration chez les souris mâles EPHB6 KO ramène la CAT à des niveaux normaux. Durant ma thèse, nous avons étudié le mécanisme impliqué dans la régulation de la sécrétion et de la synthèse des catécholamines chez les cellules chromaffines des glandes surrénales (AGCC) par la voie de signalisation de l’EPHB6. En ex vivo, la teneur totale en épinéphrine et la sécrétion d'épinéphrine déclenchée par l'acétylcholine (ACh) sont toutes deux réduites dans les glandes surrénales venant des souris KO mâles mais pas dans celles venant des femelles ou de mâles castrés. Ensuite, nous avons observé une diminution de l’afflux de Ca2+ dépendant de l'ACh dans les AGCC venant des souris mâles EPHB6 KO, ce qui découle de l'effet non-génomique de la testostérone. En appliquant le patch clamping de cellules entières sur les AGCC, nous avons démontré que la diminution d’afflux de Ca2+ dans ces cellules est causée par l’augmentation des courants de potassium à grande conductance activé par le calcium (BK). En utilisant l'enregistrement ampérométrique, nous avons constaté que la sécrétion de CAT par les AGCC est compromise en l'absence d'EPHB6. Nous avons également observé une diminution du désassemblage de la F-actine corticale dans les AGCC venant de souris mâles KO associée à une diminution de l'exocytose des vésicules contenant es catécholamines. Ces deux phénomènes n’ont pas été observés chez les femelles KO ni chez les mâles castrés. Des études complémentaires ont montré que le désassemblage défectueux de la F-actine dans les AGCC est régulé par la signalisation inverse de l'EPHB6 à l'EFNB1 via deux voies de signalisations différentes : la voie du membre A de la famille des homologues Ras (RHOA) et la voie de la tyrosine kinase proto-oncogène de la famille Src (FYN) / proto-oncogène c-ABL / la calponine monooxygénase associée aux microtubules et le domaine LIM contenant 1 (MICAL-1). En outre, nous avons observé que la diminution de la teneur totale en épinéphrine dans la glande surrénale venant des souris mâles KO est causée par une expression altérée de la tyrosine hydroxylase (TH), qui est l’enzyme limitant la vitesse dans la biosynthèse des CAT. L'effet non génomique de la testostérone a également participé dans ce processus. Nous avons révélé que la signalisation inverse d'EPHB6 à EFNB1 contribue à la surexpression de TH dans les AGCC par l’augmentation de son niveau de transcription. La voie en aval de cette signalisation inverse implique la petite famille Rac GTPase 1 (RAC1) / MAP kinase kinase 7 (MKK7) / c-Jun N-terminal kinase (JNK) / proto-oncogène c-Jun / activator protein 1 (AP1) / réponse de croissance précoce 1 (EGR1). Ces travaux démontrent pour la première fois un rôle spécifique de la famille EPH / EFN dans la régulation de la biologie médullaire de la glande surrénale. La signalisation rétrograde d’EPHB6 via EFNB1 régule la synthèse et la sécrétion des catécholamines de concert avec la testostérone dans les AGCC. / Erythropoietin-producing hepatocyte (Eph) receptors are the largest family of cell surface transmembrane receptor tyrosine kinases. Their kinase activity can be activated by their ligands, ephrins (EFNs), and involved in cell function regulation through either EPH-EFN forward or reverse signaling transduction. In the last decade, we have revealed the previously unknown function of EPHs/EFNs in the regulation of blood pressure by modulating the contractility of vascular smooth muscle cells (VSMCs). EPHB6, EFNB1, and EFNB3 have a negative effect on the VSMCs contractility and blood pressure, while EPHB4 and EFNB2 show a positive effect instead. Thus, EPH/EFN family is a novel yin and yang system that finely tunes blood pressure homeostasis. EPHB6 also targets cells responsible for catecholamine (CAT) secretion in addition to the VSMCs, since we found that the 24-h urine catecholamines are reduced in male EPHB6 knockout (KO) mice. This phenotype in EPHB6 KO mice is testosterone-dependent because the reduced CAT levels are not observed in female KO mice; castration in KO male mice reverts the CAT levels to a normal range. In this research, we investigated the mechanism for the regulation of catecholamine secretion and synthesis in adrenal gland chromaffin cells (AGCCs) by EPHB6 signaling. In ex vivo, the total content of epinephrine and the acetylcholine (ACh)-triggered epinephrine secretion were both reduced in the adrenal gland from KO male but not female or castrated mice. Then, we found a reduced ACh-dependent Ca2+ influx in AGCCs from male EPHB6 KO mice, and this effect depended on the non-genomic effect of testosterone. The results of whole-cell patch clamping on AGCCs indicated that the enhanced large-conductance calcium-activated potassium (BK) currents were responsible for the reduced Ca2+ influx in these cells. Using amperometry recording, we found that CAT secretion by AGCCs was compromised in the absence of EPHB6. The cortical F-actin disassembly in AGCCs from KO male but not female or castrated mice was reduced, accompanied by decreased catecholamine vesicle exocytosis. Further study showed such defective F-actin disassembly in AGCCs was regulated by the reverse signaling from EPHB6 to EFNB1 via the Ras homolog family member A (RHOA) and proto-oncogene Src family tyrosine kinase (FYN)/proto-oncogene c-ABL/microtubule-associated monooxygenase calponin and LIM domain containing 1 (MICAL-1) pathways. Further, we observed that the reduced total content of epinephrine in the adrenal gland from male KO mice was caused by impaired expression of tyrosine hydroxylase (TH), the rate-limiting enzyme in CAT biosynthesis. The non-genomic effect of testosterone was also involved in this process. We revealed that the reverse signaling from EPHB6 to EFNB1 contributed to the up-regulation of TH expression in AGCCs by enhancing its transcription. The downstream pathway of this reverse signaling involved Rac family small GTPase 1 (RAC1)/MAP kinase kinase 7 (MKK7)/c-Jun N-terminal kinase (JNK)/ proto-oncogene c-Jun/activator protein 1 (AP1)/early growth response 1 (EGR1). The present research, for the first time, revealed the specific role of the EPH/EFN family on the regulation of the adrenal gland medullary biology. The EPHB6 reverse signaling through EFNB1 in concert with testosterone regulates the catecholamine synthesis and secretion in AGCCs.

Les Erythropoietin-producing hepatocyte (EPH) sont la plus grande famille de récepteurs tyrosine kinase. Leurs ligands, les éphrines (EFNs), sont aussi des molécules exprimées à la surface cellulaire. Les EPH/EFNs sont impliqués dans de nombreux processus biologiques. L'hypertension artérielle (PA) est une maladie chronique qui, aujourd'hui, est devenue un problème médical critique dans le monde entier et un enjeu de santé publique. La découverte de nouvelles thérapeutiques de l'hypertension sont d'une grande importance pour la santé publique. Jusqu’à tout récemment, il existe seulement quelques études concernant le rôle de l’axe EPH/EFNs sur la fonction des cellules musculaires lisses vasculaires (CMLV). Dans nos études précédentes, nous avons montré qu'EPHB6 et EFNB1, de concert avec les hormones sexuelles, régulent la PA. Dans la présente étude, nous avons constaté que les différents membres de la famille EPH/EFN peuvent réguler soit positivement, soit négativement, la contractilité des CMLV et la PA: tandis que EPHB4 et EFNB2 appartiennent à la première catégorie, EFNB1, EFNB3 et EPHB6 appartiennent à la deuxième. In vivo, des souris males, mais non pas des femelles, porteuses d’une mutation EPHB4 (KO) spécifique du muscle lisse présentent une PA diminuée, comparée aux souris témoins (WT). Les CMLV de souris EPHB4 KO, en présence de testostérone, ont montré une contractilité réduite lors de la stimulation par la phényléphrine (PE). Au niveau moléculaire, la phosphorylation de la protéine kinase II dépendante de Ca2+/calmoduline et de la kinase de la chaine légère de la myosine (CLM) est augmentée, tandis que la phosphorylation de la kinase de la CLM est réduite dans les CMLV KO lors de la stimulation par PE, par rapport au WT CMLV. Cela fournit une base moléculaire à la réduction de la PA et de la contractilité des CMLV chez les souris EPHB4 KO. EFNB2 est le ligand majeur de l’EPHB4. Comme attendu, les souris EFNB2 KO spécifique du muscle lisse avaient un phénotype de PA semblable, quoique non identique, aux souris EPHB4 KO. Les souris mâles EFNB2 KO, mais pas femelles, sous régime régulier ou riche en sel, présentent une PA réduite, par rapport à leurs homologues WT. Au niveau cellulaire, les CMLV des souris KO ont montré une contractilité réduite lors de la stimulation par PE par rapport aux témoins WT. Une région de l’acide aminé (aa) 313 à l’aa 331 dans la partie intracellulaire d’EFNB2 est essentielle pour la signalisation inverse qui régule la contractilité des CMLV, selon des études de mutation-délétion. Dans une étude de génétique humaine, nous avons identifié, dans le gène EFNB2, six SNP qui étaient associées significativement au risque d'hypertension artérielle, de façon dépendante du sexe, ce qui corrobore nos résultats chez les souris. En revanche, la délétion du gène EFNB3 (KO) chez les souris femelles aboutit à une PA élevée et à une augmentation des résistances des petites artères in vivo, améliore la contractilité des petites artères ex-vivo et augmente la contractilité des CMLV in vitro. Les souris mâles KO ont une PA normale, mais la castration conduit à une augmentation significative de la PA dans les souris KO, mais pas dans les souris WT. Les CMLV des souris KO femelles ont montré une phosphorylation accrue de la CLM et une phosphorylation réduite de la kinase de la CLM, ce qui fournit à nouveau une base moléculaire aux phénotypes de PA et de contractilité des CMLV observés. Ce changement de signalisation est attribuable à une protéine adaptatrice Grip1. En effet, dans une étude d'association pan génomique par le Consortium International pour la Pression Sanguine, un SNP dans le gène GRIP1 a approché le seuil de significativité de la valeur p pour son association avec la pression diastolique. Nos recherches, pour la première fois, ont révélé que EPH/EFNs sont de nouveaux composants dans le système de régulation de la PA. Les membres de la famille EPH/EFN peuvent agir comme des forces Yin et Yang pour régler finement le tonus des vaisseaux pour assurer l'homéostasie de la PA et de sa régulation. Ces effets de EPH/EFNs dépendent du sexe et des niveaux d’hormones sexuelles. À partir de ces nouvelles connaissances, nous pourrions développer une nouvelle thérapie personnalisée pour l’hypertension artérielle, utilisant des antagonistes d'hormones sexuelles ou des thérapies de remplacement d'hormones sexuelles, selon les niveaux d'hormones sexuelles des patients et les mutations dans les gènes de l'EPH/EFN. / Erythropoietin-producing hepatocyte (EPH) kinases are the largest family of receptor tyrosine kinases. Their ligands, ephrins (EFNs), are also cell surface molecules. Ephs/EFNs are implicated in many biological processes. Hypertension is a chronic medical condition of high arterial blood pressure (BP). New hypertension therapeutic treatments are of great importance for public health. Until recently, there are only a few studies related to the role of EPHs/EFNs in vascular smooth muscle cell (VSMC) function. In our previous studies, we have found that EPHB6 and EFNB1 function in concert with sex hormones to regulate BP. In the present investigation, we found that different EPH/EFN family members can either positively or negatively regulate the VSMC contractility and BP: while EPHB4 and EFNB2 belong to the former category, EFNB1, EFNB3 and EPHB6, the latter. In vivo, male but not female smooth muscle-specific EPHB4 knockout (KO) mice presented decreased BP, compared to WT controls. VSMCs from EPHB4 KO mice in the presence of testosterone showed reduced contractility. EFNB2 is the major ligand of EPHB4. As expected, smooth muscle-specific EFNB2 KO mice had a similar although not identical BP phenotype as EPHB4 KO mice. Male but not female EFNB2 KO mice on regular or high-salt diet presented reduced BP, compared to WT counterparts. At the cellular level, the KO VSMCs showed reduced contractility compared to WT controls. In a human genetic study, we identified in the EFNB2 gene six SNPs that were significantly associated with hypertension risk in a sex-dependent way, corroborating our findings in mice. On the other hand, EFNB3 gene KO in female mice resulted in elevated BP and small artery resistance in vivo, enhanced small arterial contractility ex vivo, and augmented VSMC contractility in vitro. Male KO mice had normal BP, but castration led to significant BP elevation in KO but not in WT mice. VSMCs from female KO mice showed heightened MLC phosphorylation and reduced MLC kinase phosphorylation. This signaling change was mediated through an adaptor protein Grip1. Indeed, in a genome-wide association study by the International Consortium for Blood Pressure, an SNP in the GRIP1 gene approached the significant threshold p-value for its association with diastolic BP. Our research for the first time revealed that EPHs/EFNs are novel components in the BP regulation system. Members of the EPH/EFN family may act as Yin and Yang forces to finely tune the vessel tone for BP homeostasis and regulation. Such effects of EPHs/EFNs depend on sex and sex-hormone levels. Based on this new knowledge, we could develop novel personalized hypertension therapy using sex hormone antagonists or sex hormone replacement therapy, depending on the sex hormone levels of the patients and mutations in EPH/EFN genes.