A Escherichia coli é um microorganismo pertencente à flora bacteriana entérica de animais e seres humanos, estando amplamente disseminada na natureza. A colonização intestinal ocorre logo após o nascimento, sendo que 10 a 20% das E. coli podem ser potencialmente patogênicas para as aves. Esta bactéria representa um problema econômico na indústria avícola, pois é responsável por causar as colibaciloses. Este termo refere-se a qualquer tipo de infecção, localizada ou sistêmica, causadas total ou parcialmente por amostras patogênicas de E. coli. Como exemplos, podem-se citar os problemas respiratórios, como aerosaculite e pneumonias, além de peritonite, onfalite, salpingite e sinovite, entre outros. Além disso, a E. coli é o agente mais freqüentemente isolado nos casos de celulite aviária, provocando lesões cutâneas que levam as carcaças à condenação total ou parcial no momento do abate, provocando relevantes prejuízos. O objetivo deste trabalho foi verificar o perfil bioquímico de 261 amostras de E. coli, obtidas a partir de diferentes materiais de origem aviária, coletados no Rio Grande do Sul. Posteriormente, estes resultados foram associados com os Índices de Patogenicidade (IP) de cada amostra, verificando a possibilidade de relacioná-los. Além do teste de hemólise, foram realizadas 21 provas bioquímicas, sendo dez variáveis para E. coli. Dentre os testes variáveis, a melibiose, o sorbitol e a ramnose foram considerados positivos para as bactérias analisadas, pois mais de 90% das amostras fermentaram estes carboidratos. A salicina, a sacarose, a rafinose, o adonitol e o dulcitol, bem como a arginina e a ornitina continuaram apresentando-se como testes variáveis para E. coli. Os demais testes tiveram resultados positivos ou negativos de acordo com o esperado para E. coli. Constatou-se que as amostras positivas para arginina, dulcitol, rafinose e sacarose têm maiores Índices de Patogenicidade que as negativas. Por outro lado, as amostras negativas para a salicina e para o teste de indol também possuem IP’s mais altos que as positivas. Os resultados dos testes também foram analisados agrupando-se as amostras de acordo com a sua origem (quadros respiratórios, camas de aviários e lesões de celulite), apontando-se diferenças nos IP ao compará-los entre si. / The Escherichia coli are microorganisms that belong to the enteric bacterial flora of animals and humans, and are widespread in the nature. The intestinal colonization occurs right after de birth, as 10 to 20% could be potentially pathogenic to birds. The E. coli represents an economic trouble in the poultry industry, as it’s the responsible for causing the colibacilosis. This term refers to any kind of infection, localized or systemic, caused entirely or partly by pathogenic E. coli. As examples, it’s possible to quote the respiratory problems, as aerosaculitis and pneumonia, yonder peritonitis, onfalitis, salpingitis and sinovitis, among others symptoms. Besides that, E. coli is the most frequently isolated agent in avian cellulitis cases, promoting cutaneous lesions that brings the carcasses to total or partial condemnation in the abattoir, resulting in relevant prejudices. The objective of the present work was to verify the biochemical profile of 261 E. coli samples, obtained from different avian materials, collected in Rio Grande do Sul. Later, these results were associated to the Pathogenic Index (PI) of each sample, to verify if it was possible to relate them. Besides the hemolysis test, 21 biochemical’s tests were done, as ten were variable for E. coli. Among the variable tests, the melibiose, sorbitol and rhamnose were considered positive for the analyzed samples, as more than 90% fermented these carbohydrates. The salicin, sucrose, raffinose, adonitol and dulcitol, as arginine and ornithine still variable to E. coli. The results of the rest of the tests (positives and negatives) agree with what were expected for E. coli. It was noticed that the samples that were positive for arginine, dulcitol, raffinose and sucrose have higher Pathogenic Indexes than the others. On the other hand, the samples that were negative for salicin and indole test also possess high PI’s. The results of those tests were also analyzed aggregating the samples according to their origin (respiratory symptoms, avian litter and celullitis lesions), pointing to differences in the PI when comparing to each other.

A Escherichia coli é um microorganismo pertencente à flora bacteriana entérica de animais e seres humanos, estando amplamente disseminada na natureza. A colonização intestinal ocorre logo após o nascimento, sendo que 10 a 20% das E. coli podem ser potencialmente patogênicas para as aves. Esta bactéria representa um problema econômico na indústria avícola, pois é responsável por causar as colibaciloses. Este termo refere-se a qualquer tipo de infecção, localizada ou sistêmica, causadas total ou parcialmente por amostras patogênicas de E. coli. Como exemplos, podem-se citar os problemas respiratórios, como aerosaculite e pneumonias, além de peritonite, onfalite, salpingite e sinovite, entre outros. Além disso, a E. coli é o agente mais freqüentemente isolado nos casos de celulite aviária, provocando lesões cutâneas que levam as carcaças à condenação total ou parcial no momento do abate, provocando relevantes prejuízos. O objetivo deste trabalho foi verificar o perfil bioquímico de 261 amostras de E. coli, obtidas a partir de diferentes materiais de origem aviária, coletados no Rio Grande do Sul. Posteriormente, estes resultados foram associados com os Índices de Patogenicidade (IP) de cada amostra, verificando a possibilidade de relacioná-los. Além do teste de hemólise, foram realizadas 21 provas bioquímicas, sendo dez variáveis para E. coli. Dentre os testes variáveis, a melibiose, o sorbitol e a ramnose foram considerados positivos para as bactérias analisadas, pois mais de 90% das amostras fermentaram estes carboidratos. A salicina, a sacarose, a rafinose, o adonitol e o dulcitol, bem como a arginina e a ornitina continuaram apresentando-se como testes variáveis para E. coli. Os demais testes tiveram resultados positivos ou negativos de acordo com o esperado para E. coli. Constatou-se que as amostras positivas para arginina, dulcitol, rafinose e sacarose têm maiores Índices de Patogenicidade que as negativas. Por outro lado, as amostras negativas para a salicina e para o teste de indol também possuem IP’s mais altos que as positivas. Os resultados dos testes também foram analisados agrupando-se as amostras de acordo com a sua origem (quadros respiratórios, camas de aviários e lesões de celulite), apontando-se diferenças nos IP ao compará-los entre si. / The Escherichia coli are microorganisms that belong to the enteric bacterial flora of animals and humans, and are widespread in the nature. The intestinal colonization occurs right after de birth, as 10 to 20% could be potentially pathogenic to birds. The E. coli represents an economic trouble in the poultry industry, as it’s the responsible for causing the colibacilosis. This term refers to any kind of infection, localized or systemic, caused entirely or partly by pathogenic E. coli. As examples, it’s possible to quote the respiratory problems, as aerosaculitis and pneumonia, yonder peritonitis, onfalitis, salpingitis and sinovitis, among others symptoms. Besides that, E. coli is the most frequently isolated agent in avian cellulitis cases, promoting cutaneous lesions that brings the carcasses to total or partial condemnation in the abattoir, resulting in relevant prejudices. The objective of the present work was to verify the biochemical profile of 261 E. coli samples, obtained from different avian materials, collected in Rio Grande do Sul. Later, these results were associated to the Pathogenic Index (PI) of each sample, to verify if it was possible to relate them. Besides the hemolysis test, 21 biochemical’s tests were done, as ten were variable for E. coli. Among the variable tests, the melibiose, sorbitol and rhamnose were considered positive for the analyzed samples, as more than 90% fermented these carbohydrates. The salicin, sucrose, raffinose, adonitol and dulcitol, as arginine and ornithine still variable to E. coli. The results of the rest of the tests (positives and negatives) agree with what were expected for E. coli. It was noticed that the samples that were positive for arginine, dulcitol, raffinose and sucrose have higher Pathogenic Indexes than the others. On the other hand, the samples that were negative for salicin and indole test also possess high PI’s. The results of those tests were also analyzed aggregating the samples according to their origin (respiratory symptoms, avian litter and celullitis lesions), pointing to differences in the PI when comparing to each other.

A Escherichia coli é um microorganismo pertencente à flora bacteriana entérica de animais e seres humanos, estando amplamente disseminada na natureza. A colonização intestinal ocorre logo após o nascimento, sendo que 10 a 20% das E. coli podem ser potencialmente patogênicas para as aves. Esta bactéria representa um problema econômico na indústria avícola, pois é responsável por causar as colibaciloses. Este termo refere-se a qualquer tipo de infecção, localizada ou sistêmica, causadas total ou parcialmente por amostras patogênicas de E. coli. Como exemplos, podem-se citar os problemas respiratórios, como aerosaculite e pneumonias, além de peritonite, onfalite, salpingite e sinovite, entre outros. Além disso, a E. coli é o agente mais freqüentemente isolado nos casos de celulite aviária, provocando lesões cutâneas que levam as carcaças à condenação total ou parcial no momento do abate, provocando relevantes prejuízos. O objetivo deste trabalho foi verificar o perfil bioquímico de 261 amostras de E. coli, obtidas a partir de diferentes materiais de origem aviária, coletados no Rio Grande do Sul. Posteriormente, estes resultados foram associados com os Índices de Patogenicidade (IP) de cada amostra, verificando a possibilidade de relacioná-los. Além do teste de hemólise, foram realizadas 21 provas bioquímicas, sendo dez variáveis para E. coli. Dentre os testes variáveis, a melibiose, o sorbitol e a ramnose foram considerados positivos para as bactérias analisadas, pois mais de 90% das amostras fermentaram estes carboidratos. A salicina, a sacarose, a rafinose, o adonitol e o dulcitol, bem como a arginina e a ornitina continuaram apresentando-se como testes variáveis para E. coli. Os demais testes tiveram resultados positivos ou negativos de acordo com o esperado para E. coli. Constatou-se que as amostras positivas para arginina, dulcitol, rafinose e sacarose têm maiores Índices de Patogenicidade que as negativas. Por outro lado, as amostras negativas para a salicina e para o teste de indol também possuem IP’s mais altos que as positivas. Os resultados dos testes também foram analisados agrupando-se as amostras de acordo com a sua origem (quadros respiratórios, camas de aviários e lesões de celulite), apontando-se diferenças nos IP ao compará-los entre si. / The Escherichia coli are microorganisms that belong to the enteric bacterial flora of animals and humans, and are widespread in the nature. The intestinal colonization occurs right after de birth, as 10 to 20% could be potentially pathogenic to birds. The E. coli represents an economic trouble in the poultry industry, as it’s the responsible for causing the colibacilosis. This term refers to any kind of infection, localized or systemic, caused entirely or partly by pathogenic E. coli. As examples, it’s possible to quote the respiratory problems, as aerosaculitis and pneumonia, yonder peritonitis, onfalitis, salpingitis and sinovitis, among others symptoms. Besides that, E. coli is the most frequently isolated agent in avian cellulitis cases, promoting cutaneous lesions that brings the carcasses to total or partial condemnation in the abattoir, resulting in relevant prejudices. The objective of the present work was to verify the biochemical profile of 261 E. coli samples, obtained from different avian materials, collected in Rio Grande do Sul. Later, these results were associated to the Pathogenic Index (PI) of each sample, to verify if it was possible to relate them. Besides the hemolysis test, 21 biochemical’s tests were done, as ten were variable for E. coli. Among the variable tests, the melibiose, sorbitol and rhamnose were considered positive for the analyzed samples, as more than 90% fermented these carbohydrates. The salicin, sucrose, raffinose, adonitol and dulcitol, as arginine and ornithine still variable to E. coli. The results of the rest of the tests (positives and negatives) agree with what were expected for E. coli. It was noticed that the samples that were positive for arginine, dulcitol, raffinose and sucrose have higher Pathogenic Indexes than the others. On the other hand, the samples that were negative for salicin and indole test also possess high PI’s. The results of those tests were also analyzed aggregating the samples according to their origin (respiratory symptoms, avian litter and celullitis lesions), pointing to differences in the PI when comparing to each other.

A Escherichia coli foi considerada, por muito tempo, um microrganismo nãopatogênico, no entanto com o passar do tempo, alguns sorogrupos começaram a ser associados a diversas patologias no homem e em animais. E. coli é encontrada na microflora normal do trato intestinal das aves e também amplamente distribuída na natureza, necessitando por isso, fazer-se a diferenciação de amostras patogênicas de não-patogênicas e que venha desenvolver doenças. Em aves, amostras de E.coli com a presença de alguns fatores de virulência são denominadas APEC (E.coli patogênica para aves). APEC está associada com infecções extra-intestinais principalmente do trato respiratório ou infecções sistêmicas. Lesões por ela causadas, como agente primário e principalmente secundário, geram prejuízos econômicos decorrentes de menor desenvolvimento corpóreo, pior conversão alimentar, mortalidade embrionária, aumento da mortalidade e custos com medicamentos e condenação de carcaças. É um dos principais problemas da avicultura industrial moderna, devido a grandes prejuízos econômicos causados no mundo inteiro. A celulite aviária é uma forma de infecção também causada pela E.coli e tem extrema importância em função da condenação de aves nos abatedouros devido a lesões cutâneas. A patogenicidade das cepas de E.coli está relacionada com a cumulatividade dos mecanismos de virulência e que podem ser multifatoriais. Seguindo a linha de pesquisa no Programa de Isolamento e Identificação de cepas Patogênicas de Escherichia coli desenvolvida pelo CDPA, este trabalho tem como objetivo otimizar a detecção de genes associados à patogenicidade de amostras de E. coli a partir de isolamento bacteriano através da técnica de Multiplex-PCR (m-PCR), baseado em adaptações do protocolo de PCR para estabelecer o perfil genético de E. coli, associados à classificação de patogenicidade, isoladas de frangos de corte com a utilização de Inteligência Artificial (Redes Neurais Artificiais) desenvolvido por (ROCHA, 2006). As amostras de E.coli oriundas de empresas avícolas do Rio Grande do Sul foram isoladas de quadros respiratórios, camas aviárias e de lesões de celulite. Os fatores de virulência e os genes responsáveis, identificados nesse trabalho foram: capacidade de adesão pela fímbria P (pap C) e fímbria F11 (fel A), a produção de colicinas (cva C), a presença de aerobactina (iut A), presença dos antígenos capsulares K1 e K5 (kpsll), a resistência sérica (iss), hemaglutinina sensível à temperatura (tsh). A detecção de fatores de virulência de amostras de E.coli através do m-PCR produziu a amplificação simultânea dos fragmentos de DNA dos genes propostos em tamanho de pares de base esperado para cada multiplex, através de adequações dos protocolos em 100% dos testes. Os iniciadores foram específicos para amostras que continham os genes elencados já que não houve amplificação nas amostras que serviram como controles negativos. Os resultados obtidos pelo m-PCR desenvolvido nesse experimento, reproduziram os resultados gerados pelos protocolos de PCR de Rocha em 2006, com avantagem de obter o mesmo resultado em menor tempo e com a utilização de menor volume de reagentes determinando uma economia nos insumos do ensaio. Os acréscimos obtidos tornam o método disponível para a avaliação dos atributos de virulência que determinam o potencial de patogenicidade de isolados de E. coli. / The Escherichia coli, was considerate for a long time a non pathogenic microorganism however. As time went by some serogroup started to be associated with several pathologies in humans and animals. E.coli, it is found in the normal bacterial flora of the avian intestinal tract and it is also widely spread in the environment, therefore it is necessary to differentiate the nonpathogenic samples from the pathogenic ones and the ones that can cause diseases. In fowls, E.coli samples with the presence of some virulence factors are called APEC (avian pathogenic Escherichia coli). APEC is associated with extra intestinal infections, mainly in the respiratory tract or systemic infections. Lesions it causes, either as primary or secondary agent, result in economic losses which occur as a consequence of the bird’s poorer growth rate and feed conversion, as well as increased mortality, medication costs and condemnation at the processing plant. It is one of the major problems in the modern aviculture industry, due to the big economic losses in the whole world. The avian cellulitis is a kind of infection also caused by E. coli and has extreme importance in terms of the avian condemnations in the slaughter houses due to the cutaneous lesions. The pathogenicity of the strains of E. coli is related to the cumulativity of the virulence mechanisms and that can be multifactorials. Following the line of research in Isolation Program and Identification of the Pathogenics Strains of the Escherichia coli developed by the CDPA, this work had as aim achieve faster the detection of genes associated with the pathogenicity of the samples of E. coli from on bacterial isolation through the technique of Multiplex – PCR ( m – PCR ), based on the adaptations of the protocol of PCR to restore the genetic profile of the E. coli associated with the classification of the isolated pathogenicity of the chicken flocks with the utilization of Artificial Inteligence (Artificial Neural Nets ) developed by Rocha, (2006). The samples derived from the avian enterprise from the state of RGS were isolated from the respiratory cases, avian beds and from the cellulitis lesions, and the virulence factors and the responsible genes identificated in isolated E. coli samples of the fowls in this work were: adhesion capacity by the fimbriae P (pap C) and fimbriae F 11 (fel A), the colicin production (cva C), the aerobactin presence ( iut A) capsular antigens presence K1 and K5 (kpsll ), the serum resistence (iss), temperature-sensitive hemmaglutin ( tsh ). The detection of the virulence factors of the E. coli samples through the m–PCR produced the simultaneous amplification of the DNA fragments of the genes proposed in the size of the based pairs expected for each multiplex, through protocols adaptations by 100%. The initiators were specified for the samples that contained the chosen genes whereas there was not amplification in the samples that served as negative controllers. The results obtained by the m-PCR developed in that experiment, reproduced the results generated by the PCR protocols developed by Rocha 2006, with the advantage to obtain the same result in less time and with the utilization of lower volume of the reagents determining a saving in the costs of the test. The increases obtained become the method available for the assessment of the virulence attributes that determined the potential of the pathogenecity of the E. coli isolated.

A Escherichia coli foi considerada, por muito tempo, um microrganismo nãopatogênico, no entanto com o passar do tempo, alguns sorogrupos começaram a ser associados a diversas patologias no homem e em animais. E. coli é encontrada na microflora normal do trato intestinal das aves e também amplamente distribuída na natureza, necessitando por isso, fazer-se a diferenciação de amostras patogênicas de não-patogênicas e que venha desenvolver doenças. Em aves, amostras de E.coli com a presença de alguns fatores de virulência são denominadas APEC (E.coli patogênica para aves). APEC está associada com infecções extra-intestinais principalmente do trato respiratório ou infecções sistêmicas. Lesões por ela causadas, como agente primário e principalmente secundário, geram prejuízos econômicos decorrentes de menor desenvolvimento corpóreo, pior conversão alimentar, mortalidade embrionária, aumento da mortalidade e custos com medicamentos e condenação de carcaças. É um dos principais problemas da avicultura industrial moderna, devido a grandes prejuízos econômicos causados no mundo inteiro. A celulite aviária é uma forma de infecção também causada pela E.coli e tem extrema importância em função da condenação de aves nos abatedouros devido a lesões cutâneas. A patogenicidade das cepas de E.coli está relacionada com a cumulatividade dos mecanismos de virulência e que podem ser multifatoriais. Seguindo a linha de pesquisa no Programa de Isolamento e Identificação de cepas Patogênicas de Escherichia coli desenvolvida pelo CDPA, este trabalho tem como objetivo otimizar a detecção de genes associados à patogenicidade de amostras de E. coli a partir de isolamento bacteriano através da técnica de Multiplex-PCR (m-PCR), baseado em adaptações do protocolo de PCR para estabelecer o perfil genético de E. coli, associados à classificação de patogenicidade, isoladas de frangos de corte com a utilização de Inteligência Artificial (Redes Neurais Artificiais) desenvolvido por (ROCHA, 2006). As amostras de E.coli oriundas de empresas avícolas do Rio Grande do Sul foram isoladas de quadros respiratórios, camas aviárias e de lesões de celulite. Os fatores de virulência e os genes responsáveis, identificados nesse trabalho foram: capacidade de adesão pela fímbria P (pap C) e fímbria F11 (fel A), a produção de colicinas (cva C), a presença de aerobactina (iut A), presença dos antígenos capsulares K1 e K5 (kpsll), a resistência sérica (iss), hemaglutinina sensível à temperatura (tsh). A detecção de fatores de virulência de amostras de E.coli através do m-PCR produziu a amplificação simultânea dos fragmentos de DNA dos genes propostos em tamanho de pares de base esperado para cada multiplex, através de adequações dos protocolos em 100% dos testes. Os iniciadores foram específicos para amostras que continham os genes elencados já que não houve amplificação nas amostras que serviram como controles negativos. Os resultados obtidos pelo m-PCR desenvolvido nesse experimento, reproduziram os resultados gerados pelos protocolos de PCR de Rocha em 2006, com avantagem de obter o mesmo resultado em menor tempo e com a utilização de menor volume de reagentes determinando uma economia nos insumos do ensaio. Os acréscimos obtidos tornam o método disponível para a avaliação dos atributos de virulência que determinam o potencial de patogenicidade de isolados de E. coli. / The Escherichia coli, was considerate for a long time a non pathogenic microorganism however. As time went by some serogroup started to be associated with several pathologies in humans and animals. E.coli, it is found in the normal bacterial flora of the avian intestinal tract and it is also widely spread in the environment, therefore it is necessary to differentiate the nonpathogenic samples from the pathogenic ones and the ones that can cause diseases. In fowls, E.coli samples with the presence of some virulence factors are called APEC (avian pathogenic Escherichia coli). APEC is associated with extra intestinal infections, mainly in the respiratory tract or systemic infections. Lesions it causes, either as primary or secondary agent, result in economic losses which occur as a consequence of the bird’s poorer growth rate and feed conversion, as well as increased mortality, medication costs and condemnation at the processing plant. It is one of the major problems in the modern aviculture industry, due to the big economic losses in the whole world. The avian cellulitis is a kind of infection also caused by E. coli and has extreme importance in terms of the avian condemnations in the slaughter houses due to the cutaneous lesions. The pathogenicity of the strains of E. coli is related to the cumulativity of the virulence mechanisms and that can be multifactorials. Following the line of research in Isolation Program and Identification of the Pathogenics Strains of the Escherichia coli developed by the CDPA, this work had as aim achieve faster the detection of genes associated with the pathogenicity of the samples of E. coli from on bacterial isolation through the technique of Multiplex – PCR ( m – PCR ), based on the adaptations of the protocol of PCR to restore the genetic profile of the E. coli associated with the classification of the isolated pathogenicity of the chicken flocks with the utilization of Artificial Inteligence (Artificial Neural Nets ) developed by Rocha, (2006). The samples derived from the avian enterprise from the state of RGS were isolated from the respiratory cases, avian beds and from the cellulitis lesions, and the virulence factors and the responsible genes identificated in isolated E. coli samples of the fowls in this work were: adhesion capacity by the fimbriae P (pap C) and fimbriae F 11 (fel A), the colicin production (cva C), the aerobactin presence ( iut A) capsular antigens presence K1 and K5 (kpsll ), the serum resistence (iss), temperature-sensitive hemmaglutin ( tsh ). The detection of the virulence factors of the E. coli samples through the m–PCR produced the simultaneous amplification of the DNA fragments of the genes proposed in the size of the based pairs expected for each multiplex, through protocols adaptations by 100%. The initiators were specified for the samples that contained the chosen genes whereas there was not amplification in the samples that served as negative controllers. The results obtained by the m-PCR developed in that experiment, reproduced the results generated by the PCR protocols developed by Rocha 2006, with the advantage to obtain the same result in less time and with the utilization of lower volume of the reagents determining a saving in the costs of the test. The increases obtained become the method available for the assessment of the virulence attributes that determined the potential of the pathogenecity of the E. coli isolated.

Memorial apresentado ao Instituto de Biociências da Universidade Estadual Paulista "Julio de Mesquita Filho" como pré-requisito para obtenção do título de Livre Docente em Microbiologia - área de Bacteriologia / Resumo: A doença inflamatória intestinal (DII) é um quadro patológico marcado pela ocorrência de lesões de gravidade variável ao longo do trato intestinal. Os sintomas se manifestam na forma de duas variantes clínicas distintas: retocolite ulcerativa (RU) e doença de Crohn (DC). A DC pode afetar qualquer parte do trato gastrintestinal (TGI), desde a boca até o ânus, podendo em casos raros, acometer tecidos extraintestinais. A RU restringe-se ao intestino grosso. A predisposição para seu desenvolvimento e a causa da doença dependem de múltiplos fatores, incluindo a Genética, dieta, tabagismo, imunidade e a microbiota intestinal. Sendo uma das bactérias dominantes entre os aeróbios facultativos do cólon intestinal, a Escherichia coli tem sido foco da maioria dos estudos relacionados à microbiota. Diferentes trabalhos têm demonstrado que estas bactérias são aumentadas em pacientes com DII. Considerando-se o peso do fator genético e que pouco ou nenhum estudo equivalente tem sido realizado com a população brasileira, a proposta deste trabalho consistiu na avaliação quantitativa de alguns grupos bacterianos, em diferentes materiais clínicos de pacientes com DII. Para isto, foi investigado um total de 110 pacientes do atendimento de rotina do HC/UNESP, distribuídos em 3 categorias: 52 controles, 20 portadores de DC e 38 portadores de RU. Os espécimes clínicos consistiram majoritariamente de biópsias do reto e, em menor número, de fezes e biópsias de outros segmentos da mucosa intestinal. Análise da variação na concentração bacteriana aplicada às espécimes de um subgrupo destes pacientes (24 controles, 17 portadores de RU e 14 de DC) revelou que, em geral, portadores de DII apresentam uma maior concentração média de bactérias Gram negativas, Gram positivas e de outros microrganismos em diferentes segmentos da mucosa / Abstract: Not available

A Escherichia coli foi considerada, por muito tempo, um microrganismo nãopatogênico, no entanto com o passar do tempo, alguns sorogrupos começaram a ser associados a diversas patologias no homem e em animais. E. coli é encontrada na microflora normal do trato intestinal das aves e também amplamente distribuída na natureza, necessitando por isso, fazer-se a diferenciação de amostras patogênicas de não-patogênicas e que venha desenvolver doenças. Em aves, amostras de E.coli com a presença de alguns fatores de virulência são denominadas APEC (E.coli patogênica para aves). APEC está associada com infecções extra-intestinais principalmente do trato respiratório ou infecções sistêmicas. Lesões por ela causadas, como agente primário e principalmente secundário, geram prejuízos econômicos decorrentes de menor desenvolvimento corpóreo, pior conversão alimentar, mortalidade embrionária, aumento da mortalidade e custos com medicamentos e condenação de carcaças. É um dos principais problemas da avicultura industrial moderna, devido a grandes prejuízos econômicos causados no mundo inteiro. A celulite aviária é uma forma de infecção também causada pela E.coli e tem extrema importância em função da condenação de aves nos abatedouros devido a lesões cutâneas. A patogenicidade das cepas de E.coli está relacionada com a cumulatividade dos mecanismos de virulência e que podem ser multifatoriais. Seguindo a linha de pesquisa no Programa de Isolamento e Identificação de cepas Patogênicas de Escherichia coli desenvolvida pelo CDPA, este trabalho tem como objetivo otimizar a detecção de genes associados à patogenicidade de amostras de E. coli a partir de isolamento bacteriano através da técnica de Multiplex-PCR (m-PCR), baseado em adaptações do protocolo de PCR para estabelecer o perfil genético de E. coli, associados à classificação de patogenicidade, isoladas de frangos de corte com a utilização de Inteligência Artificial (Redes Neurais Artificiais) desenvolvido por (ROCHA, 2006). As amostras de E.coli oriundas de empresas avícolas do Rio Grande do Sul foram isoladas de quadros respiratórios, camas aviárias e de lesões de celulite. Os fatores de virulência e os genes responsáveis, identificados nesse trabalho foram: capacidade de adesão pela fímbria P (pap C) e fímbria F11 (fel A), a produção de colicinas (cva C), a presença de aerobactina (iut A), presença dos antígenos capsulares K1 e K5 (kpsll), a resistência sérica (iss), hemaglutinina sensível à temperatura (tsh). A detecção de fatores de virulência de amostras de E.coli através do m-PCR produziu a amplificação simultânea dos fragmentos de DNA dos genes propostos em tamanho de pares de base esperado para cada multiplex, através de adequações dos protocolos em 100% dos testes. Os iniciadores foram específicos para amostras que continham os genes elencados já que não houve amplificação nas amostras que serviram como controles negativos. Os resultados obtidos pelo m-PCR desenvolvido nesse experimento, reproduziram os resultados gerados pelos protocolos de PCR de Rocha em 2006, com avantagem de obter o mesmo resultado em menor tempo e com a utilização de menor volume de reagentes determinando uma economia nos insumos do ensaio. Os acréscimos obtidos tornam o método disponível para a avaliação dos atributos de virulência que determinam o potencial de patogenicidade de isolados de E. coli. / The Escherichia coli, was considerate for a long time a non pathogenic microorganism however. As time went by some serogroup started to be associated with several pathologies in humans and animals. E.coli, it is found in the normal bacterial flora of the avian intestinal tract and it is also widely spread in the environment, therefore it is necessary to differentiate the nonpathogenic samples from the pathogenic ones and the ones that can cause diseases. In fowls, E.coli samples with the presence of some virulence factors are called APEC (avian pathogenic Escherichia coli). APEC is associated with extra intestinal infections, mainly in the respiratory tract or systemic infections. Lesions it causes, either as primary or secondary agent, result in economic losses which occur as a consequence of the bird’s poorer growth rate and feed conversion, as well as increased mortality, medication costs and condemnation at the processing plant. It is one of the major problems in the modern aviculture industry, due to the big economic losses in the whole world. The avian cellulitis is a kind of infection also caused by E. coli and has extreme importance in terms of the avian condemnations in the slaughter houses due to the cutaneous lesions. The pathogenicity of the strains of E. coli is related to the cumulativity of the virulence mechanisms and that can be multifactorials. Following the line of research in Isolation Program and Identification of the Pathogenics Strains of the Escherichia coli developed by the CDPA, this work had as aim achieve faster the detection of genes associated with the pathogenicity of the samples of E. coli from on bacterial isolation through the technique of Multiplex – PCR ( m – PCR ), based on the adaptations of the protocol of PCR to restore the genetic profile of the E. coli associated with the classification of the isolated pathogenicity of the chicken flocks with the utilization of Artificial Inteligence (Artificial Neural Nets ) developed by Rocha, (2006). The samples derived from the avian enterprise from the state of RGS were isolated from the respiratory cases, avian beds and from the cellulitis lesions, and the virulence factors and the responsible genes identificated in isolated E. coli samples of the fowls in this work were: adhesion capacity by the fimbriae P (pap C) and fimbriae F 11 (fel A), the colicin production (cva C), the aerobactin presence ( iut A) capsular antigens presence K1 and K5 (kpsll ), the serum resistence (iss), temperature-sensitive hemmaglutin ( tsh ). The detection of the virulence factors of the E. coli samples through the m–PCR produced the simultaneous amplification of the DNA fragments of the genes proposed in the size of the based pairs expected for each multiplex, through protocols adaptations by 100%. The initiators were specified for the samples that contained the chosen genes whereas there was not amplification in the samples that served as negative controllers. The results obtained by the m-PCR developed in that experiment, reproduced the results generated by the PCR protocols developed by Rocha 2006, with the advantage to obtain the same result in less time and with the utilization of lower volume of the reagents determining a saving in the costs of the test. The increases obtained become the method available for the assessment of the virulence attributes that determined the potential of the pathogenecity of the E. coli isolated.

Orientadores: Wanderley Dias da Silveira, Eliana Guedes Stehling / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-17T23:32:04Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Pace_Fernandade_D.pdf: 4667016 bytes, checksum: c841e6b899f0efc5569c9c6c6ce46935 (MD5) Previous issue date: 2011 / Resumo: Linhagens de Escherichia coli patogênica para aves (APEC) causam infecções extraintestinais e são responsáveis por significativas perdas econômicas na indústria avícola mundial. Recentemente, foram descritos isolados de APEC geneticamente relacionados a diversas outras E.coli extraintestinais (ExPEC) de origem humana, indicando a possibilidade das mesmas constituírem risco zoonótico para humanos. Alguns dos conhecidos fatores de virulência de APEC incluem adesinas, sistema de aquisição de ferro, citotoxinas, entre outros. Nesse trabalho, demonstramos que a linhagem de APEC SEPT 362, isolada do fígado de uma ave apresentando sinais clínicos de septicemia, expressa o Sistema de Secreção Tipo VI (SST6), causa rearranjo do citoesqueleto de células epiteliais cultivadas in vitro, é capaz de aderir e invadir células HeLa e é viável dentro de macrófagos. Para estudar o envolvimento do SST6 na patogênese da linhagem SEPT362, foram deletados três genes desse sistema: hcp, que codifica para uma proteína estrutural e secretada, clpV, que codifica para uma ATPase e icmF (intracellular multiplication factor), gerando três mutantes, respectivamente. Todos os mutantes demonstraram uma diminuição nos processos de adesão e invasão a células HeLa, formação de biofilme e virulência in vivo. Estudos de transcriptoma mostraram que a expressão da fímbria tipo 1 encontra-se diminuída nesses mutantes, o que poderia ser responsável pela diminuição do processo de adesão e invasão às células epiteliais. Nesse trabalho, demonstramos que o SST6 é importante para o processo de patogenicidade, visto que todos os mutantes tiveram sua virulência atenuada em experimentos realizados in vivo com uma significativa diminuição de características relacionadas à patogenicidade in vitro. Esses resultados demonstram que os genes estudados do SST6 influenciam a expressão da fímbria tipo 1 e contribuem para a patogênese desta linhagem APEC / Abstract: Avian pathogenic Escherichia coli (APEC) strains frequently cause extraintestinal infections and are responsible for significant economic losses in the poultry industry worldwide. APEC isolates are closely related to human extraintestinal pathogenic E. coli (ExPEC) strains and may also act as pathogens for humans. Known APEC virulence factors include adhesins such as type 1 fimbriae and curli, iron acquisition systems, and cytotoxins, among others. Here we demonstrated that APEC strain SEPT362, isolated from a septicemic hen, expresses a type VI secretion system (T6SS), causes cytoskeleton rearrangements, invades epithelial cells, replicates within macrophages, and causes lethal disease in chicks. To assess the contribution of the T6SS to SEPT362 pathogenesis, we generated three mutants, ?hcp (which encodes a protein suggessed to be both secreted and a structural component of the T6SS), ?clpV (encoding the T6SS ATPase) and ?icmF (intracellular multiplication factor). All mutants showed decreased adherence and invasion to HeLa cells and decrease in several other pathogenicity related characteristics. Transcriptome studies showed that the level of expression of type 1 fimbriae was decreased in these mutants, which may account for the diminished adhesion and invasion of epithelial cells. The T6SS seems to be important for the disease process, given that both mutants (?hcp and ?clpV) were attenuated in an infection model in chicks. These results suggest that the T6SS influences the expression of type 1 fimbriae and contributes to the pathogenesis of this APEC strain pathogenesis / Doutorado / Genetica de Microorganismos / Doutor em Genetica e Biologia Molecular

E. coli Patogênicas Aviárias (APEC) são uma das causas de doenças extra-intestinais em aves, as quais trazem grande prejuízo econômico para o setor avícola mundial. Os avanços nas pesquisas vêm aumentando o entendimento dos mecanismos de patogenicidade das APEC, demonstrando a grande importância da interação dos diversos fatores de virulência na determinação da sua patogenicidade. Redes Neurais Artificiais (RNAs) têm mostrado ser uma poderosa ferramenta para uma vasta gama de aplicações. Neste trabalho, o foco na aplicação da RNA é na predição (0 a 10) da patogenicidade de amostras APEC. Em 489 isolados APEC foram analisados a presença de 38 genes associados a virulência, o Índice de Patogenicidade (IP) in vivo e a motilidade das amostras. Duas RNAs foram construídas utilizando o software Neuroshell Classifier 2.1 (Ward Systems Group, Inc., Frederick, MD, USA) em duas fases distintas: treinamento e validação. Utilizou-se como camada de entrada, informações sobre a presença ou ausência dos 38 genes de virulência e a motilidade de cada uma das amostras, com uma camada de saída formada pelo IP in vivo previamente determinado. As RNAs construídas apresentaram uma classificação correta acima de 90%, sendo que a rede 1 apresentou uma classificação de 91,62 e a rede 2 de 99,03%. A rede 2 obteve uma especificidade superior a 99,64% em todas as categorias e uma sensibilidade superior a 92,86%. Isso demonstra que o método aqui proposto, revelou ser uma ótima ferramenta de suporte às decisões de médico veterinário, descartando no futuro a inoculação de animais. / Avian Pathogenic Escherichia coli (APEC) are one of the causes of extraintestinal diseases in birds, and cause considerable economic losses to the poultry industry worldwide. Advances in research have increased understanding of pathogenic mechanisms of APEC, and have demonstrated the importance of the interaction of several virulence factors in determining their pathogenicity. Artificial Neural Networks (ANN) have shown to be a powerful tool for a wide range of applications. In this paper, the focus on neural network applications in the prediction (index of 0-10) of the pathogenicity of isolates APEC. In 489 APEC isolates were analyzed: 38 virulenceassociated genes, the Pathogenicity Index (PI) in vivo and motility of the strains. Two ANNs were constructed using the software Neuroshell Classifier 2.1 (Ward Systems Group, Inc., Frederick, MD, USA) in two distinct phases: training and validation. We used as input layer, information about the presence or absence of the 38 virulenceassociated genes and the motility of each of the samples, with an output layer formed by a previously-determined PI in vivo. The ANNs showed a correct classification of the PI above of 90%, being that the network 1 had a rating of 91.62% and the network 2 of 99.03%. The network 2 obtained a specificity of over 99.64% and sensitivity greater than 92.86% in all categories. This demonstrates that the method proposed here has proven to be a great decision support tool for the veterinarian, thereby dispensing the inoculation of animals in the future.

E. coli Patogênicas Aviárias (APEC) são uma das causas de doenças extra-intestinais em aves, as quais trazem grande prejuízo econômico para o setor avícola mundial. Os avanços nas pesquisas vêm aumentando o entendimento dos mecanismos de patogenicidade das APEC, demonstrando a grande importância da interação dos diversos fatores de virulência na determinação da sua patogenicidade. Redes Neurais Artificiais (RNAs) têm mostrado ser uma poderosa ferramenta para uma vasta gama de aplicações. Neste trabalho, o foco na aplicação da RNA é na predição (0 a 10) da patogenicidade de amostras APEC. Em 489 isolados APEC foram analisados a presença de 38 genes associados a virulência, o Índice de Patogenicidade (IP) in vivo e a motilidade das amostras. Duas RNAs foram construídas utilizando o software Neuroshell Classifier 2.1 (Ward Systems Group, Inc., Frederick, MD, USA) em duas fases distintas: treinamento e validação. Utilizou-se como camada de entrada, informações sobre a presença ou ausência dos 38 genes de virulência e a motilidade de cada uma das amostras, com uma camada de saída formada pelo IP in vivo previamente determinado. As RNAs construídas apresentaram uma classificação correta acima de 90%, sendo que a rede 1 apresentou uma classificação de 91,62 e a rede 2 de 99,03%. A rede 2 obteve uma especificidade superior a 99,64% em todas as categorias e uma sensibilidade superior a 92,86%. Isso demonstra que o método aqui proposto, revelou ser uma ótima ferramenta de suporte às decisões de médico veterinário, descartando no futuro a inoculação de animais. / Avian Pathogenic Escherichia coli (APEC) are one of the causes of extraintestinal diseases in birds, and cause considerable economic losses to the poultry industry worldwide. Advances in research have increased understanding of pathogenic mechanisms of APEC, and have demonstrated the importance of the interaction of several virulence factors in determining their pathogenicity. Artificial Neural Networks (ANN) have shown to be a powerful tool for a wide range of applications. In this paper, the focus on neural network applications in the prediction (index of 0-10) of the pathogenicity of isolates APEC. In 489 APEC isolates were analyzed: 38 virulenceassociated genes, the Pathogenicity Index (PI) in vivo and motility of the strains. Two ANNs were constructed using the software Neuroshell Classifier 2.1 (Ward Systems Group, Inc., Frederick, MD, USA) in two distinct phases: training and validation. We used as input layer, information about the presence or absence of the 38 virulenceassociated genes and the motility of each of the samples, with an output layer formed by a previously-determined PI in vivo. The ANNs showed a correct classification of the PI above of 90%, being that the network 1 had a rating of 91.62% and the network 2 of 99.03%. The network 2 obtained a specificity of over 99.64% and sensitivity greater than 92.86% in all categories. This demonstrates that the method proposed here has proven to be a great decision support tool for the veterinarian, thereby dispensing the inoculation of animals in the future.