E. coli Patogênicas Aviárias (APEC) são uma das causas de doenças extra-intestinais em aves, as quais trazem grande prejuízo econômico para o setor avícola mundial. Os avanços nas pesquisas vêm aumentando o entendimento dos mecanismos de patogenicidade das APEC, demonstrando a grande importância da interação dos diversos fatores de virulência na determinação da sua patogenicidade. Redes Neurais Artificiais (RNAs) têm mostrado ser uma poderosa ferramenta para uma vasta gama de aplicações. Neste trabalho, o foco na aplicação da RNA é na predição (0 a 10) da patogenicidade de amostras APEC. Em 489 isolados APEC foram analisados a presença de 38 genes associados a virulência, o Índice de Patogenicidade (IP) in vivo e a motilidade das amostras. Duas RNAs foram construídas utilizando o software Neuroshell Classifier 2.1 (Ward Systems Group, Inc., Frederick, MD, USA) em duas fases distintas: treinamento e validação. Utilizou-se como camada de entrada, informações sobre a presença ou ausência dos 38 genes de virulência e a motilidade de cada uma das amostras, com uma camada de saída formada pelo IP in vivo previamente determinado. As RNAs construídas apresentaram uma classificação correta acima de 90%, sendo que a rede 1 apresentou uma classificação de 91,62 e a rede 2 de 99,03%. A rede 2 obteve uma especificidade superior a 99,64% em todas as categorias e uma sensibilidade superior a 92,86%. Isso demonstra que o método aqui proposto, revelou ser uma ótima ferramenta de suporte às decisões de médico veterinário, descartando no futuro a inoculação de animais. / Avian Pathogenic Escherichia coli (APEC) are one of the causes of extraintestinal diseases in birds, and cause considerable economic losses to the poultry industry worldwide. Advances in research have increased understanding of pathogenic mechanisms of APEC, and have demonstrated the importance of the interaction of several virulence factors in determining their pathogenicity. Artificial Neural Networks (ANN) have shown to be a powerful tool for a wide range of applications. In this paper, the focus on neural network applications in the prediction (index of 0-10) of the pathogenicity of isolates APEC. In 489 APEC isolates were analyzed: 38 virulenceassociated genes, the Pathogenicity Index (PI) in vivo and motility of the strains. Two ANNs were constructed using the software Neuroshell Classifier 2.1 (Ward Systems Group, Inc., Frederick, MD, USA) in two distinct phases: training and validation. We used as input layer, information about the presence or absence of the 38 virulenceassociated genes and the motility of each of the samples, with an output layer formed by a previously-determined PI in vivo. The ANNs showed a correct classification of the PI above of 90%, being that the network 1 had a rating of 91.62% and the network 2 of 99.03%. The network 2 obtained a specificity of over 99.64% and sensitivity greater than 92.86% in all categories. This demonstrates that the method proposed here has proven to be a great decision support tool for the veterinarian, thereby dispensing the inoculation of animals in the future.

Escherichia coli enteropatogênica atípica (aEPEC) faz parte de um grupo de patógenos capazes de formar um tipo de lesão característica em cultura de tecidos epiteliais, denominada attaching and effacing (A/E). Os genes que são necessários para produção da lesão A/E estão localizados em uma ilha de patogenicidade denominada região LEE (locus of enterocyte effacement). A transcrição de genes da região LEE está sujeita a regulação por vários fatores, entre eles quorum sensing, termo utilizado para designar um mecanismo de regulação gênica dependente da concentração celular. Esse mecanismo é usado por bactérias Gram-positivas e Gram-negativas e em ambos os casos envolve a produção e detecção de moléculas sinalizadoras extracelulares, denominadas autoindutores. Até o momento, pelo menos quatro sistemas de quorum sensing foram descritos, entre eles o sistema de autoindutor AI-3 encontrado em bactérias Gram-positivas e Gram-negativas. Diversos mecanismos celulares, entre eles a expressão de fatores de virulência em amostras de EPEC e EHEC, são regulados por esse fenômeno. O principal objetivo deste estudo foi verificar se existe uma possível regulação por quorum sensing na interação in vitro de uma amostra de E. coli da microbiota intestinal com amostras de aEPEC. Após a confirmação da produção de AI-3 por amostras de E.coli da microbiota intestinal foram realizados ensaios de adesão e quantificação utilizando meio pré-condicionado com esta amostra, epinefrina e bloqueadores que confirmaram que os padrões de adesão de aEPEC obtidos em menor tempo são devidos a presença de AI-3 no meio pré-condicionado, indicando a participação de quorum sensing nessa interação. Além disso, foi observado um fenômeno citotóxico nas células que não é produzido pelo AI-3. / Atypical Enteropathogenic Escherichia coli (aEPEC) are part of a group of pathogens capable of forming a type of lesion characteristic of epithelial tissues in culture, called attaching and effacing (A/E). The genes that are required for production of A/E lesion are located in a pathogenicity island called LEE region (locus of enterocyte effacement). The transcription of LEE genes in the region is subject to regulation by various factors, including quorum sensing, a term used to describe a mechanism of gene regulation dependent on cell concentration. This mechanism is used by Gram-positive and Gram-negative and in both cases involves the production and detection of extracellular signaling molecules, called autoinducers. So far, four systems of quorum sensing have been described, including the system of autoinducers AI-3 found in Gram-positive and Gram-negative bacteria. Several cellular mechanisms, including expression of virulence factors in EPEC and EHEC are regulated by this phenomenon. The main objective of this study was to determine whether there is a possible regulation by quorum sensing in the in vitro interaction of a strains of E. coli of the intestinal microbiota with strains aEPEC. After confirming the production of AI-3 in E. coli of the intestinal microbiota were performed adhesion assays and quantification using means preconditioned with this strains, epinephrine, and blockers who confirmed that patterns of adherence of aEPEC obtained in less time are due to the presence of AI-3 in the preconditioned means, indicating the involvement of quorum sensing in this interaction. Furthermore, we observed a phenomenon that cytotoxic cells is not produced by AI-3.

Orientadores: Wanderley Dias da Silveira, Marcelo Brocchi / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-25T05:13:36Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Paiva_JacquelineBoldrinde_D.pdf: 5619127 bytes, checksum: 79177e4233fdbb891e6530eb0f3438bd (MD5) Previous issue date: 2014 / Resumo: Escherichia coli patogênica para aves (APEC) é responsável por inúmeras perdas no setor avícola mundial, por causar uma série de doenças nas aves que se apresentam de forma sistêmica ou localizada as quais são, coletivamente, denominadas colibacilose. Os mecanismos de virulência destas linhagens patogênicas para aves e, possivelmente, patogênicas para seres humanos ainda não foram totalmente elucidados. Este trabalho foi desenvolvido com o intuito de estudar genes possivelmente envolvidos com a patogenicidade de uma linhagem APEC causadora de Síndrome da Cabeça Inchada (SCI-07) ONT:H31, a partir de resultados obtidos em um microarranjo realizado in vitro, o qual comparou a linhagem em estudo à linhagem padrão E. coli EHEC 8624 (linhagem enterohemorrágica). Nove genes, detectados como sendo super-expressos no microarranjo, nas condições estudadas, foram selecionados para construção de mutantes nulos e de seus complementos [feoA (transporte de ferro), nirC (transportador de nitrito), flgE ( gancho flagelar), tyrR (regulador de transcrição da síntese de aminoácidos aromáticos), potF (subunidade periplasmática do transportador putrescina), yehD (possível fimbria), bfr (bacterioferrina), csgA ( subunidade principal da curlina) e entD (enteroquelina)]. Os mutantes construídos foram avaliados quanto as suas capacidades de adesão e invasão em cultivos celulares, e quanto ao seu potencial patogênico em aves de um dia de idade em comparação à cepa selvagem. As linhagens ?bfr, ?csgA e ?nirC apresentaram diminuição da capacidade de adesão em fibroblastos de aves (linhagem FEG) em comparação à linhagem selvagem em ambos os modelos adotados: na presença e ausência de alpha-D-mannopyranoside; a linhagem ?potF apresentou diminuição da adesão apenas na ausência de alpha-D-mannopyranoside. Os mutantes ?csgA e ?tyrR apresentaram redução na capacidade de invadir linhagem de células de trato respiratório humano (linhagem Hep-2). Nenhum mutante avaliado mostrou alteração na capacidade de invadir fibroblastos de aves (linhagem CEC-32). Os mutantes ?flgE e ?tyrR mostraram diminuição na capacidade de invadir e sobreviver em macrófagos de aves (linhagem HD11). A motilidade das linhagens mutantes ?csgA, ?bfr, ?yehD, ?potF, ?entD, ?nirC e ?feoA foi aumentada enquanto o mutante ?tyrR mostrou redução de motilidade e o mutante ?flgE tornou-se imóvel. Nenhuma linhagem mutante obtida mostrou a mesma capacidade da linhagem selvagem em causar mortalidade em aves de um dia; ?feoA tornou-se hipervirulenta e todos os demais mutantes apresentaram atenuação em diferentes graus, sendo a linhagem ?entD totalmente atenuada e, portanto, promissora quanto ao seu uso como linhagem vacinal.para o combate à colibacilose em aves, ou como linhagem carreadoras de epítopos presentes em outras linhagens APEC / Abstract: Avian Pathogenic Escherichia coli (APEC) is responsible for significant economic loses in the poultry industry worldwide, by cause a range of systemic or localized diseases in poultry collectively termed colibacillosis. The virulence mechanisms of these pathogenic strains for poultry and possibly pathogenic for humans have not been fully elucidated. This work was developed in order to study genes potentially involved in the pathogenicity of an APEC strain isolated from a Swollen Head Syndrome case (SCI- 07) ONT:H31; since the results obtained in a microarray performed in vitro, which compared the SCI-07 strain to the standard strain E. coli 8624 EHEC (enterohemorrhagic strain). Nine overexpressed genes in microarray under the conditions studied were selected for construction of null mutants and their complements [feoA (iron transport), nirC (nitrite transporter), flgE (flagellar hook), tyrR (transcriptional regulator of the aromatic amino acids biosynthesis), potF (periplasmic putrescine transporter subunit), yehD (putative adhesin), bfr (bacterioferritin), csgA (major curling subunit) and entD (enterochelin)]. The mutants constructed were evaluated for their capacity for adhesion and invasion in cell cultures, and for its pathogenic potential in one-day-old chickens in comparison to the wild type strain (WT). The ?bfr, ?csgA and ?nirC strains showed decreased adhesion capacity on avian fibroblasts (CEF cells) compared to the WT in both models adopted: in the presence and absence of alpha-D-mannopyranoside, the ?potF strain showed decrease on adhesion only in the absence of alpha-D-mannopyranoside. The ?csgA and ?tyrR mutants had reduced ability to invade human larynx cell line (Hep-2 cells). No mutant showed changes in the capacity of invade avian fibroblasts birds (CEC-32cells). The ?flgE and ?tyrR mutants showed decreased ability to invade and survive into avian macrophages (HD11 cells). The motility of mutant strains ?csgA, ?bfr, ?yehD, ?potF, ?entD, ?nirC and ?feoA was increased while the ?tyrR mutant showed reduced motility and the mutant ?flgE became nonmotile. No mutant strain showed the same capacity of the WT in cause mortality in one-day-old chickes; ?feoA became hipervirulenta and all other mutants showed attenuation in different degrees, including the ?entD that was completely attenuated and a promising vaccine candidate strain to combat colibacillosis in poultry, or as a carrier strain of epitopes present in other APEC strains / Doutorado / Genetica de Microorganismos / Doutora em Genética e Biologia Molecular

Escherichia coli enteropatogênica atípica (aEPEC) faz parte de um grupo de patógenos capazes de formar um tipo de lesão característica em cultura de tecidos epiteliais, denominada attaching and effacing (A/E). Os genes que são necessários para produção da lesão A/E estão localizados em uma ilha de patogenicidade denominada região LEE (locus of enterocyte effacement). A transcrição de genes da região LEE está sujeita a regulação por vários fatores, entre eles quorum sensing, termo utilizado para designar um mecanismo de regulação gênica dependente da concentração celular. Esse mecanismo é usado por bactérias Gram-positivas e Gram-negativas e em ambos os casos envolve a produção e detecção de moléculas sinalizadoras extracelulares, denominadas autoindutores. Até o momento, pelo menos quatro sistemas de quorum sensing foram descritos, entre eles o sistema de autoindutor AI-3 encontrado em bactérias Gram-positivas e Gram-negativas. Diversos mecanismos celulares, entre eles a expressão de fatores de virulência em amostras de EPEC e EHEC, são regulados por esse fenômeno. O principal objetivo deste estudo foi verificar se existe uma possível regulação por quorum sensing na interação in vitro de uma amostra de E. coli da microbiota intestinal com amostras de aEPEC. Após a confirmação da produção de AI-3 por amostras de E.coli da microbiota intestinal foram realizados ensaios de adesão e quantificação utilizando meio pré-condicionado com esta amostra, epinefrina e bloqueadores que confirmaram que os padrões de adesão de aEPEC obtidos em menor tempo são devidos a presença de AI-3 no meio pré-condicionado, indicando a participação de quorum sensing nessa interação. Além disso, foi observado um fenômeno citotóxico nas células que não é produzido pelo AI-3. / Atypical Enteropathogenic Escherichia coli (aEPEC) are part of a group of pathogens capable of forming a type of lesion characteristic of epithelial tissues in culture, called attaching and effacing (A/E). The genes that are required for production of A/E lesion are located in a pathogenicity island called LEE region (locus of enterocyte effacement). The transcription of LEE genes in the region is subject to regulation by various factors, including quorum sensing, a term used to describe a mechanism of gene regulation dependent on cell concentration. This mechanism is used by Gram-positive and Gram-negative and in both cases involves the production and detection of extracellular signaling molecules, called autoinducers. So far, four systems of quorum sensing have been described, including the system of autoinducers AI-3 found in Gram-positive and Gram-negative bacteria. Several cellular mechanisms, including expression of virulence factors in EPEC and EHEC are regulated by this phenomenon. The main objective of this study was to determine whether there is a possible regulation by quorum sensing in the in vitro interaction of a strains of E. coli of the intestinal microbiota with strains aEPEC. After confirming the production of AI-3 in E. coli of the intestinal microbiota were performed adhesion assays and quantification using means preconditioned with this strains, epinephrine, and blockers who confirmed that patterns of adherence of aEPEC obtained in less time are due to the presence of AI-3 in the preconditioned means, indicating the involvement of quorum sensing in this interaction. Furthermore, we observed a phenomenon that cytotoxic cells is not produced by AI-3.

Escherichia coli enteropatogênica (EPEC) é uma das principais causas de diarreia em crianças. Na carência de fosfato (Pi), um conjunto de genes conhecido como regulon PHO é induzido. Esse regulon é controlado pelo sistema Pst, que além de ser um transportador de Pi, reprime a expressão de PHO quando Pi é abundante, e pelo sistema de dois componentes PhoB/PhoR. A deleção de pst reduziu a adesão de EPEC à células epiteliais in vitro, pois diminuiu da expressão dos reguladores PerA/PerC, que por sua vez controlam a expressão de genes envolvidos na adesão. Este efeito foi exclusivo de pst e não devido a expressão constitutiva dos genes de PHO causada pela deleção de pst. A expressão da fímbria BFP, PerA e PerC também dependem da síntese de ppGpp, uma molécula de alarme envolvida na regulação de genes relacionados à carência nutricional. ppGpp regula positivamente a expressão de PerA e PerC. Entretanto, RpoS, o fator relacionado à resposta ao estresse, afetou negativamente o nível de adesão de EPEC e a expressão de BFP. / Enteropathogenic E. coli (EPEC) is one of the causes of diarrhea in children. Phosphate (Pi) shortage induces transcription of the genes known as the PHO regulon. These genes are controlled by the Pst system, that is also a high-affinity Pi transporter, and represses PHO expression under Pi-replete conditions. PHO is also controlled by the two-component system PhoB/PhoR. Deletion of the pst operon reduced the adhesion of EPEC to epithelial cells in vitro due to a decrease in the expression of the regulators PerA and PerC that in turn control the expression of genes related to adhesion. The constitutive expression of the PHO genes in the pst mutant was not the cause of adhesion inhibition. Expression of bfp and the regulators PerA and PerC was also dependent on ppGpp, an alarmone involved in the regulation of genes related to nutrient limitation. On the other hand, RpoS, the factor that controls the general stress response, negatively affected EPEC adhesion and bfpA expression.

Escherichia coli enteropatogênica (EPEC) é uma das principais causas de diarreia em crianças. Na carência de fosfato (Pi), um conjunto de genes conhecido como regulon PHO é induzido. Esse regulon é controlado pelo sistema Pst, que além de ser um transportador de Pi, reprime a expressão de PHO quando Pi é abundante, e pelo sistema de dois componentes PhoB/PhoR. A deleção de pst reduziu a adesão de EPEC à células epiteliais in vitro, pois diminuiu da expressão dos reguladores PerA/PerC, que por sua vez controlam a expressão de genes envolvidos na adesão. Este efeito foi exclusivo de pst e não devido a expressão constitutiva dos genes de PHO causada pela deleção de pst. A expressão da fímbria BFP, PerA e PerC também dependem da síntese de ppGpp, uma molécula de alarme envolvida na regulação de genes relacionados à carência nutricional. ppGpp regula positivamente a expressão de PerA e PerC. Entretanto, RpoS, o fator relacionado à resposta ao estresse, afetou negativamente o nível de adesão de EPEC e a expressão de BFP. / Enteropathogenic E. coli (EPEC) is one of the causes of diarrhea in children. Phosphate (Pi) shortage induces transcription of the genes known as the PHO regulon. These genes are controlled by the Pst system, that is also a high-affinity Pi transporter, and represses PHO expression under Pi-replete conditions. PHO is also controlled by the two-component system PhoB/PhoR. Deletion of the pst operon reduced the adhesion of EPEC to epithelial cells in vitro due to a decrease in the expression of the regulators PerA and PerC that in turn control the expression of genes related to adhesion. The constitutive expression of the PHO genes in the pst mutant was not the cause of adhesion inhibition. Expression of bfp and the regulators PerA and PerC was also dependent on ppGpp, an alarmone involved in the regulation of genes related to nutrient limitation. On the other hand, RpoS, the factor that controls the general stress response, negatively affected EPEC adhesion and bfpA expression.