Os prejuízos causados por Escherichia coli patogênica para aves (APEC) na produção de aves é justificativa de pesquisas realizadas no mundo todo há décadas. Recentemente, o potencial zoonótico e a multirresistência das cepas desse patotipo têm sido alvo frequente dos trabalhos realizados com APEC. O objetivo desse trabalho foi caracterizar 225 cepas APEC isoladas de perus condenados por aerossaculite em abatedouros em relação à resistência a 14 antimicrobianos, perfil de virulência e grupos filogenéticos. 92% das amostras apresentaram perfil de multirresistência (MDR) e os índices mais altos de resistência foram a sulfonamidas (94%), tetraciclina (83%), eritromicina (82%), estreptomicina (60%), amoxicilina (53%) e ácido nalidíxico (48%). Metade das cepas foram classificadas no grupo filogenético B2 (50%), seguido por B1 (28,6%), grupo A (17,1%) e grupo D (4,8%). Os genes de virulência pesquisados tiveram prevalência de iroN (95%), iss (93%), cvi/cva (67%), iucD (67%), tsh (56%), irp2 (51%), ibeA (31%), vat (24%), neuS (19%), astA (17%) e papC (15%). Considerando o potencial zoonótico e a associação a um maior número de genes de virulência quando comparadas aos outros grupos filogenéticos, as cepas B2 foram selecionadas para pesquisa de integrons de classe 1 e clonalidade. As 112 amostras B2 eram pertencentes a 83 diferentes perfis ERIC, sendo classificadas como multiclonais. Os integrons de classe 1 estiveram presentes em 107 isolados (95,5%). Esses resultados demonstram que a maioria das cepas pesquisadas pertencia ao grupo mais virulento (B2) e relacionado a cepas ExPEC humanas. Aliado ao alto índice de multirresistência encontrado, esses dados sugerem que as aves podem servir como reservatório de cepas patogênicas e multirresistentes, tanto para humanos como para animais, reforçando a ideia de que as aves representem importante papel na cadeia epidemiológica das ExPEC. / Avian Pathogenic Escherichia coli (APEC) has been studied for decades because of its economic impact on the poultry industry. Recently, the zoonotic potential of APEC and multidrug-resistant strains have emerged. The aim of this study was to investigate the virulence profile, phylogenetic background and antimicrobial resistance in 225 strains of Escherichia coli isolated from turkeys presenting airsacculitis. The results showed that 92% of strains presented a multidrug-resistance (MDR) profile, and the highest levels of resistance were to sulfamethazine (94%), tetracycline (83%). Half of these strains (112/225) were classified in phylogenetic group B2, followed by groups B1 (28.6%), A (17.1%) and D (4.8%). The prevalence of virulence genes was as follows: iroN (95%), iss (93%), cvi/cva (67%), iucD (67%), tsh (56%), irp2 (51%), ibeA (31%), vat (24%) neuS (19%), astA (17%) and papC (15%). Considering the zoonotic potential and association to a greater number of virulence genes when compared to other phylogenetic groups, B2 strains were selected for screening of class 1 integrons and clonality. The 112 samples belonging to 83 ERIC profiles and classified as multiclonal. Class 1 integrons were present in 107 isolates (95.5%).These results demonstrate that the majority of the investigated strains belonged to group B2, which is more virulent and is related to human ExPEC strains. Coupled with the high rate of multidrug-resistance found, these data suggest that turkeys may serve as a reservoir for pathogenic and multidrug-resistance strains, for humans and animals, reinforcing the idea that poultry plays an important role in the epidemiological chain of ExPEC.

Os prejuízos causados por Escherichia coli patogênica para aves (APEC) na produção de aves é justificativa de pesquisas realizadas no mundo todo há décadas. Recentemente, o potencial zoonótico e a multirresistência das cepas desse patotipo têm sido alvo frequente dos trabalhos realizados com APEC. O objetivo desse trabalho foi caracterizar 225 cepas APEC isoladas de perus condenados por aerossaculite em abatedouros em relação à resistência a 14 antimicrobianos, perfil de virulência e grupos filogenéticos. 92% das amostras apresentaram perfil de multirresistência (MDR) e os índices mais altos de resistência foram a sulfonamidas (94%), tetraciclina (83%), eritromicina (82%), estreptomicina (60%), amoxicilina (53%) e ácido nalidíxico (48%). Metade das cepas foram classificadas no grupo filogenético B2 (50%), seguido por B1 (28,6%), grupo A (17,1%) e grupo D (4,8%). Os genes de virulência pesquisados tiveram prevalência de iroN (95%), iss (93%), cvi/cva (67%), iucD (67%), tsh (56%), irp2 (51%), ibeA (31%), vat (24%), neuS (19%), astA (17%) e papC (15%). Considerando o potencial zoonótico e a associação a um maior número de genes de virulência quando comparadas aos outros grupos filogenéticos, as cepas B2 foram selecionadas para pesquisa de integrons de classe 1 e clonalidade. As 112 amostras B2 eram pertencentes a 83 diferentes perfis ERIC, sendo classificadas como multiclonais. Os integrons de classe 1 estiveram presentes em 107 isolados (95,5%). Esses resultados demonstram que a maioria das cepas pesquisadas pertencia ao grupo mais virulento (B2) e relacionado a cepas ExPEC humanas. Aliado ao alto índice de multirresistência encontrado, esses dados sugerem que as aves podem servir como reservatório de cepas patogênicas e multirresistentes, tanto para humanos como para animais, reforçando a ideia de que as aves representem importante papel na cadeia epidemiológica das ExPEC. / Avian Pathogenic Escherichia coli (APEC) has been studied for decades because of its economic impact on the poultry industry. Recently, the zoonotic potential of APEC and multidrug-resistant strains have emerged. The aim of this study was to investigate the virulence profile, phylogenetic background and antimicrobial resistance in 225 strains of Escherichia coli isolated from turkeys presenting airsacculitis. The results showed that 92% of strains presented a multidrug-resistance (MDR) profile, and the highest levels of resistance were to sulfamethazine (94%), tetracycline (83%). Half of these strains (112/225) were classified in phylogenetic group B2, followed by groups B1 (28.6%), A (17.1%) and D (4.8%). The prevalence of virulence genes was as follows: iroN (95%), iss (93%), cvi/cva (67%), iucD (67%), tsh (56%), irp2 (51%), ibeA (31%), vat (24%) neuS (19%), astA (17%) and papC (15%). Considering the zoonotic potential and association to a greater number of virulence genes when compared to other phylogenetic groups, B2 strains were selected for screening of class 1 integrons and clonality. The 112 samples belonging to 83 ERIC profiles and classified as multiclonal. Class 1 integrons were present in 107 isolates (95.5%).These results demonstrate that the majority of the investigated strains belonged to group B2, which is more virulent and is related to human ExPEC strains. Coupled with the high rate of multidrug-resistance found, these data suggest that turkeys may serve as a reservoir for pathogenic and multidrug-resistance strains, for humans and animals, reinforcing the idea that poultry plays an important role in the epidemiological chain of ExPEC.

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No. of bitstreams: 2 license_rdf: 23148 bytes, checksum: 9da0b6dfac957114c6a7714714b86306 (MD5) Tese - Hilari Wanderley Hidasi - 2014.pdf: 1654829 bytes, checksum: b50671bb3feb0625688191733ad9b696 (MD5) Previous issue date: 2013-04-12 / Aves sinantrópicas aproximam-se de atividades humanas em busca de abrigo, água e alimento, podendo percorrer grandes distâncias para tanto. Em busca de informações acerca da importância dessas aves na transmissão de agentes patogênicos de importância na avicultura comercial, foi realizado estudo com 260 aves de comportamento sinantrópico, sendo 200 pombos comuns (Columba livia) e 60 urubus de cabeça preta (Coragyps atratus), na região metropolitana de Goiânia - Goiás. Foram colhidas amostras de fezes, soro e suabes traqueais que foram submetidos a testes para detecção de Salmonella sp. por bacteriologia convencional e Reação em Cadeia da Polimerase em Tempo Real (rPCR), Mycoplasma galisepticum e M. synoviae pela Soroaglutinação Rápida em Placa (SAR) e rPCR, além de isolamento de Escherichia coli pela bacteriologia convencional com detecção de genes de virulência de E. coli patogênica para aves (APEC) pela PCR e perfil de suscetibilidade a antimicrobianos dos isolados. Os resultados observados, na pesquisa de Salmonella sp. das amostras de pombos, 13% (26/200) foram positivas no exame bacteriológico e 27% (54/200) das amostras positivas no rPCR. Do total de 60 amostras obtidas dos urubus, nenhuma amostra foi positiva no bacteriológico convencional e 8,3% (5/60) foram positivas no rPCR. Para a pesquisa de Mycoplasma, das amostras colhidas dos pombos, 7,5% (15/200) amostras foram reativas no teste sorológico, sendo 4,5% (9/200) positivas para M. galliisepticum e 3% (6/200) para M. synoviae. Já no rPCR, 2,5% (5/200) foram positivas para M. gallisepticum. Das amostras colhidas dos urubus, nenhuma foi positiva nos dois testes aos quais foram submetidas. Foi isolado E. coli das excretas e detectado pela PCR os genes de virulência papC, tsh, iuc e iss, com resultado para amostras de pombos de 11,23%(20/178) para iuc, 2,24% (4/178) papC, 11,79% (21/179) tsh e 6, 17% (11/178). Para urubus 8,16% (4/49) iuc, 14,28% (7/49) tsh, 6,12% (3/49) iss, e nenhuma positiva para papC. Adicionalmente, os isolados de E. coli foram submetidos a teste de perfil de resistência à antibióticos em que se obteve: sulfametazina122/178 (68,53%), ampicilina 130/178 (73,03%), ciprofloxacina 40/178 (22,47%), apramicina 57/178 (32,02%), sulfametropin 110/178 (61,79%), enrofloxacina 71/178 (39,88%), tetraciclina 119/178 (66,85%), sulfonamida 123/172 (69,10%), neomicina 59/178 (33,14%), doxaciclina 67/178 (37,64%), oxitetraciclina 51/178(28,65%), gentamicina 42/178 (23,59%), ceftiofur 79/178 (44,38%), amoxicilina + ac. clavulânico 92/178 (51,68%) de resistência nas amostras isoladas de pombos, e em amostras isoladas de urubus: sulfametazina 36/49 (73,46%), ampicilina 39/49 (79,59%), ciprofloxacina 12/49 (24,48%), apramicina 9/49(18,36%), sulfametropin 30/49 (61,22%), enrofloxacina 7/49 (14,28%), tetraciclina 27/49 (55,10%), sulfonamida 32/49 (65,30%), neomicina 12/49 (24,48%), doxaciclina 11/49 (22,44%), neomicina 9/49 (18,36%), oxitetraciclina 11/49 (22,44%), gentamicina 10/49 (20,40%), ceftiofur 12/49 (24,48%), associação de amoxicilina e ácido clavulânico 31/49 (63,26%) de resistência. Os resultados sugerem que essas aves de comportamento sinantrópico, são potenciais veiculadores de agentes causadores de perdas na produção avícola e preocupantes para a saúde pública. Além disso, podem constituir em suporte de transferência de fenótipos de E.coli resistentes. / Aves sinantrópicas aproximam-se de atividades humanas em busca de abrigo, água e alimento, podendo percorrer grandes distâncias para tanto. Em busca de informações acerca da importância dessas aves na transmissão de agentes patogênicos de importância na avicultura comercial, foi realizado estudo com 260 aves de comportamento sinantrópico, sendo 200 pombos comuns (Columba livia) e 60 urubus de cabeça preta (Coragyps atratus), na região metropolitana de Goiânia - Goiás. Foram colhidas amostras de fezes, soro e suabes traqueais que foram submetidos a testes para detecção de Salmonella sp. por bacteriologia convencional e Reação em Cadeia da Polimerase em Tempo Real (rPCR), Mycoplasma galisepticum e M. synoviae pela Soroaglutinação Rápida em Placa (SAR) e rPCR, além de isolamento de Escherichia coli pela bacteriologia convencional com detecção de genes de virulência de E. coli patogênica para aves (APEC) pela PCR e perfil de suscetibilidade a antimicrobianos dos isolados. Os resultados observados, na pesquisa de Salmonella sp. das amostras de pombos, 13% (26/200) foram positivas no exame bacteriológico e 27% (54/200) das amostras positivas no rPCR. Do total de 60 amostras obtidas dos urubus, nenhuma amostra foi positiva no bacteriológico convencional e 8,3% (5/60) foram positivas no rPCR. Para a pesquisa de Mycoplasma, das amostras colhidas dos pombos, 7,5% (15/200) amostras foram reativas no teste sorológico, sendo 4,5% (9/200) positivas para M. galliisepticum e 3% (6/200) para M. synoviae. Já no rPCR, 2,5% (5/200) foram positivas para M. gallisepticum. Das amostras colhidas dos urubus, nenhuma foi positiva nos dois testes aos quais foram submetidas. Foi isolado E. coli das excretas e detectado pela PCR os genes de virulência papC, tsh, iuc e iss, com resultado para amostras de pombos de 11,23%(20/178) para iuc, 2,24% (4/178) papC, 11,79% (21/179) tsh e 6, 17% (11/178). Para urubus 8,16% (4/49) iuc, 14,28% (7/49) tsh, 6,12% (3/49) iss, e nenhuma positiva para papC. Adicionalmente, os isolados de E. coli foram submetidos a teste de perfil de resistência à antibióticos em que se obteve: sulfametazina122/178 (68,53%), ampicilina 130/178 (73,03%), ciprofloxacina 40/178 (22,47%), apramicina 57/178 (32,02%), sulfametropin 110/178 (61,79%), enrofloxacina 71/178 (39,88%), tetraciclina 119/178 (66,85%), sulfonamida 123/172 (69,10%), neomicina 59/178 (33,14%), doxaciclina 67/178 (37,64%), oxitetraciclina 51/178(28,65%), gentamicina 42/178 (23,59%), ceftiofur 79/178 (44,38%), amoxicilina + ac. clavulânico 92/178 (51,68%) de resistência nas amostras isoladas de pombos, e em amostras isoladas de urubus: sulfametazina 36/49 (73,46%), ampicilina 39/49 (79,59%), ciprofloxacina 12/49 (24,48%), apramicina 9/49(18,36%), sulfametropin 30/49 (61,22%), enrofloxacina 7/49 (14,28%), tetraciclina 27/49 (55,10%), sulfonamida 32/49 (65,30%), neomicina 12/49 (24,48%), doxaciclina 11/49 (22,44%), neomicina 9/49 (18,36%), oxitetraciclina 11/49 (22,44%), gentamicina 10/49 (20,40%), ceftiofur 12/49 (24,48%), associação de amoxicilina e ácido clavulânico 31/49 (63,26%) de resistência. Os resultados sugerem que essas aves de comportamento sinantrópico, são potenciais veiculadores de agentes causadores de perdas na produção avícola e preocupantes para a saúde pública. Além disso, podem constituir em suporte de transferência de fenótipos de E.coli resistentes.

Orientadores: Wanderley Dias da Silveira, Marcelo Brocchi / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-25T05:13:36Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Paiva_JacquelineBoldrinde_D.pdf: 5619127 bytes, checksum: 79177e4233fdbb891e6530eb0f3438bd (MD5) Previous issue date: 2014 / Resumo: Escherichia coli patogênica para aves (APEC) é responsável por inúmeras perdas no setor avícola mundial, por causar uma série de doenças nas aves que se apresentam de forma sistêmica ou localizada as quais são, coletivamente, denominadas colibacilose. Os mecanismos de virulência destas linhagens patogênicas para aves e, possivelmente, patogênicas para seres humanos ainda não foram totalmente elucidados. Este trabalho foi desenvolvido com o intuito de estudar genes possivelmente envolvidos com a patogenicidade de uma linhagem APEC causadora de Síndrome da Cabeça Inchada (SCI-07) ONT:H31, a partir de resultados obtidos em um microarranjo realizado in vitro, o qual comparou a linhagem em estudo à linhagem padrão E. coli EHEC 8624 (linhagem enterohemorrágica). Nove genes, detectados como sendo super-expressos no microarranjo, nas condições estudadas, foram selecionados para construção de mutantes nulos e de seus complementos [feoA (transporte de ferro), nirC (transportador de nitrito), flgE ( gancho flagelar), tyrR (regulador de transcrição da síntese de aminoácidos aromáticos), potF (subunidade periplasmática do transportador putrescina), yehD (possível fimbria), bfr (bacterioferrina), csgA ( subunidade principal da curlina) e entD (enteroquelina)]. Os mutantes construídos foram avaliados quanto as suas capacidades de adesão e invasão em cultivos celulares, e quanto ao seu potencial patogênico em aves de um dia de idade em comparação à cepa selvagem. As linhagens ?bfr, ?csgA e ?nirC apresentaram diminuição da capacidade de adesão em fibroblastos de aves (linhagem FEG) em comparação à linhagem selvagem em ambos os modelos adotados: na presença e ausência de alpha-D-mannopyranoside; a linhagem ?potF apresentou diminuição da adesão apenas na ausência de alpha-D-mannopyranoside. Os mutantes ?csgA e ?tyrR apresentaram redução na capacidade de invadir linhagem de células de trato respiratório humano (linhagem Hep-2). Nenhum mutante avaliado mostrou alteração na capacidade de invadir fibroblastos de aves (linhagem CEC-32). Os mutantes ?flgE e ?tyrR mostraram diminuição na capacidade de invadir e sobreviver em macrófagos de aves (linhagem HD11). A motilidade das linhagens mutantes ?csgA, ?bfr, ?yehD, ?potF, ?entD, ?nirC e ?feoA foi aumentada enquanto o mutante ?tyrR mostrou redução de motilidade e o mutante ?flgE tornou-se imóvel. Nenhuma linhagem mutante obtida mostrou a mesma capacidade da linhagem selvagem em causar mortalidade em aves de um dia; ?feoA tornou-se hipervirulenta e todos os demais mutantes apresentaram atenuação em diferentes graus, sendo a linhagem ?entD totalmente atenuada e, portanto, promissora quanto ao seu uso como linhagem vacinal.para o combate à colibacilose em aves, ou como linhagem carreadoras de epítopos presentes em outras linhagens APEC / Abstract: Avian Pathogenic Escherichia coli (APEC) is responsible for significant economic loses in the poultry industry worldwide, by cause a range of systemic or localized diseases in poultry collectively termed colibacillosis. The virulence mechanisms of these pathogenic strains for poultry and possibly pathogenic for humans have not been fully elucidated. This work was developed in order to study genes potentially involved in the pathogenicity of an APEC strain isolated from a Swollen Head Syndrome case (SCI- 07) ONT:H31; since the results obtained in a microarray performed in vitro, which compared the SCI-07 strain to the standard strain E. coli 8624 EHEC (enterohemorrhagic strain). Nine overexpressed genes in microarray under the conditions studied were selected for construction of null mutants and their complements [feoA (iron transport), nirC (nitrite transporter), flgE (flagellar hook), tyrR (transcriptional regulator of the aromatic amino acids biosynthesis), potF (periplasmic putrescine transporter subunit), yehD (putative adhesin), bfr (bacterioferritin), csgA (major curling subunit) and entD (enterochelin)]. The mutants constructed were evaluated for their capacity for adhesion and invasion in cell cultures, and for its pathogenic potential in one-day-old chickens in comparison to the wild type strain (WT). The ?bfr, ?csgA and ?nirC strains showed decreased adhesion capacity on avian fibroblasts (CEF cells) compared to the WT in both models adopted: in the presence and absence of alpha-D-mannopyranoside, the ?potF strain showed decrease on adhesion only in the absence of alpha-D-mannopyranoside. The ?csgA and ?tyrR mutants had reduced ability to invade human larynx cell line (Hep-2 cells). No mutant showed changes in the capacity of invade avian fibroblasts birds (CEC-32cells). The ?flgE and ?tyrR mutants showed decreased ability to invade and survive into avian macrophages (HD11 cells). The motility of mutant strains ?csgA, ?bfr, ?yehD, ?potF, ?entD, ?nirC and ?feoA was increased while the ?tyrR mutant showed reduced motility and the mutant ?flgE became nonmotile. No mutant strain showed the same capacity of the WT in cause mortality in one-day-old chickes; ?feoA became hipervirulenta and all other mutants showed attenuation in different degrees, including the ?entD that was completely attenuated and a promising vaccine candidate strain to combat colibacillosis in poultry, or as a carrier strain of epitopes present in other APEC strains / Doutorado / Genetica de Microorganismos / Doutora em Genética e Biologia Molecular