A produção de espécies reativas de oxigênio (ROS) nos sistemas biológicos é contrabalanceada pelos sistemas antioxidantes enzimáticos e não-enzimáticos. Quando há um desequilíbrio entre a geração de ROS e esses sistemas, ocorre um aumento dessas espécies reativas causando estresse oxidativo, que pode levar a danos a macromoléculas, como lipídios, proteínas e o DNA. Os fármacos doxorrubicina (antineoplásico) e benzonidazol (antiparasitário) são conhecidos por induzir efeitos colaterais que podem estar relacionados ao aumento de ROS. Além disso, ensaios de mutagenicidade demonstram que esses fármacos apresentam atividade mutagênica por danos oxidativos. O Grupo NEQUIMED desenvolve substâncias com potencial atividade antineoplásica e antiparasitária, as quais ainda não foram avaliadas em relação às propriedades tóxicas e genotóxicas. Dessa forma, o objetivo deste trabalho foi analisar as propriedades mutagênicas e de estresse oxidativo dessas novas substâncias, comparando aos fármacos benzonidazol e doxorrubicina. Para detecção de ROS foi realizado o ensaio fluorimétrico utilizando o marcador 2,7-diacetato de diclorofluoresceína (DCFH-DA) em linhagens celulares de hepatocarcinoma humano (HepG2) e fibroblasto de camundongo (Balb/C 3T3 clone A31). O estado redox destas células foi avaliado através da quantificação da expressão gênica e do conteúdo proteico das enzimas antioxidantes através das técnicas de qRT-PCR e Western blot, respectivamente. A atividade mutagênica foi analisada com o ensaio Ames miniaturizado Salmonella/microssoma utilizando a linhagem TA102 de Salmonella typhimurium que detecta agentes mutagênicos que causam danos por oxidação. Os resultados mostraram que as substâncias estudadas pelo Grupo não induzem aumento na produção de ROS ou induzem em menores níveis do que doxorrubicina e benzonidazol, além de levar a alterações menos proeminentes que os fármacos para a expressão das proteínas antioxidantes. No ensaio mutagênico, o benzonidazol apresentou o pior perfil, doxorrubicina e Neq0438 somente foram mutagênicos com ativação enzimática, enquanto Neq0551 foi inativo. Assim, as novas substâncias (Neq0438 e Neq0551) apresentaram um perfil melhor do que os fármacos de referência, tornando-os candidatos promissores para estudos in vitro e in vivo subsequentes. / The production of reactive oxygen species (ROS) in biological systems is compensated by the enzymatic and non-enzymatic antioxidant systems. The excessive ROS production causes oxidative stress, which can damage important cellular macromolecules such as lipids, proteins and DNA. The drugs doxorubicin (antineoplastic) and benzonidazole (antiparasitic) are both known for their side effects, which can be related to the increase of ROS. Besides, mutagenicity assays show that these drugs have a mutagenic activity via oxidative damages. The research group NEQUIMED studies new substances with potential antineoplastic and antiparasitic activities, but their toxic and genotoxic properties have not been fully evaluated yet. Thus, the aim of this work is to assess the mutagenic potential and the oxidative stress generated by these substances, comparing them to benzonidazole and doxorubicin. The fluorimetric assay using the probe dichloro-dihydro-fluorescein diacetate (DCFH-DA) was used for ROS detection in human hepatocarcinoma (HepG2) and mouse fibroblast (Balb/C 3T3 clone A31) cell lines. The redox state of these cells was evaluate by qRT-PCR and Western blot methods to quantifying gene expression and protein content of the antioxidant enzymes. The mutagenic potential was assessed by the miniaturized Ames text with the Salmonella/microssome mutagenicity assay, using the TA102 strain of Salmonella typhimurium, which detects oxidation damages to the DNA. The new substances did not induce an increase on ROS production, or did in lower levels when compared to doxorubicin and benzonidazole. Moreover, reference drugs also induced greater changes on the expression of the antioxidant enzymes. Benznidazole had a higher mutagenic activity, while Neq0438 and doxorubicin were mutagenic only when incubated with enzymatic activation. Neq0551 was inactive for Ames assay. Therefore, these new substances (Neq0438 and Neq0551) had a better overall profile than the reference drugs, turning out to be promising candidates for further in vitro and in vivo studies.

A produção de espécies reativas de oxigênio (ROS) nos sistemas biológicos é contrabalanceada pelos sistemas antioxidantes enzimáticos e não-enzimáticos. Quando há um desequilíbrio entre a geração de ROS e esses sistemas, ocorre um aumento dessas espécies reativas causando estresse oxidativo, que pode levar a danos a macromoléculas, como lipídios, proteínas e o DNA. Os fármacos doxorrubicina (antineoplásico) e benzonidazol (antiparasitário) são conhecidos por induzir efeitos colaterais que podem estar relacionados ao aumento de ROS. Além disso, ensaios de mutagenicidade demonstram que esses fármacos apresentam atividade mutagênica por danos oxidativos. O Grupo NEQUIMED desenvolve substâncias com potencial atividade antineoplásica e antiparasitária, as quais ainda não foram avaliadas em relação às propriedades tóxicas e genotóxicas. Dessa forma, o objetivo deste trabalho foi analisar as propriedades mutagênicas e de estresse oxidativo dessas novas substâncias, comparando aos fármacos benzonidazol e doxorrubicina. Para detecção de ROS foi realizado o ensaio fluorimétrico utilizando o marcador 2,7-diacetato de diclorofluoresceína (DCFH-DA) em linhagens celulares de hepatocarcinoma humano (HepG2) e fibroblasto de camundongo (Balb/C 3T3 clone A31). O estado redox destas células foi avaliado através da quantificação da expressão gênica e do conteúdo proteico das enzimas antioxidantes através das técnicas de qRT-PCR e Western blot, respectivamente. A atividade mutagênica foi analisada com o ensaio Ames miniaturizado Salmonella/microssoma utilizando a linhagem TA102 de Salmonella typhimurium que detecta agentes mutagênicos que causam danos por oxidação. Os resultados mostraram que as substâncias estudadas pelo Grupo não induzem aumento na produção de ROS ou induzem em menores níveis do que doxorrubicina e benzonidazol, além de levar a alterações menos proeminentes que os fármacos para a expressão das proteínas antioxidantes. No ensaio mutagênico, o benzonidazol apresentou o pior perfil, doxorrubicina e Neq0438 somente foram mutagênicos com ativação enzimática, enquanto Neq0551 foi inativo. Assim, as novas substâncias (Neq0438 e Neq0551) apresentaram um perfil melhor do que os fármacos de referência, tornando-os candidatos promissores para estudos in vitro e in vivo subsequentes. / The production of reactive oxygen species (ROS) in biological systems is compensated by the enzymatic and non-enzymatic antioxidant systems. The excessive ROS production causes oxidative stress, which can damage important cellular macromolecules such as lipids, proteins and DNA. The drugs doxorubicin (antineoplastic) and benzonidazole (antiparasitic) are both known for their side effects, which can be related to the increase of ROS. Besides, mutagenicity assays show that these drugs have a mutagenic activity via oxidative damages. The research group NEQUIMED studies new substances with potential antineoplastic and antiparasitic activities, but their toxic and genotoxic properties have not been fully evaluated yet. Thus, the aim of this work is to assess the mutagenic potential and the oxidative stress generated by these substances, comparing them to benzonidazole and doxorubicin. The fluorimetric assay using the probe dichloro-dihydro-fluorescein diacetate (DCFH-DA) was used for ROS detection in human hepatocarcinoma (HepG2) and mouse fibroblast (Balb/C 3T3 clone A31) cell lines. The redox state of these cells was evaluate by qRT-PCR and Western blot methods to quantifying gene expression and protein content of the antioxidant enzymes. The mutagenic potential was assessed by the miniaturized Ames text with the Salmonella/microssome mutagenicity assay, using the TA102 strain of Salmonella typhimurium, which detects oxidation damages to the DNA. The new substances did not induce an increase on ROS production, or did in lower levels when compared to doxorubicin and benzonidazole. Moreover, reference drugs also induced greater changes on the expression of the antioxidant enzymes. Benznidazole had a higher mutagenic activity, while Neq0438 and doxorubicin were mutagenic only when incubated with enzymatic activation. Neq0551 was inactive for Ames assay. Therefore, these new substances (Neq0438 and Neq0551) had a better overall profile than the reference drugs, turning out to be promising candidates for further in vitro and in vivo studies.

Saccharomyces cerevisiae teve seu seqüenciamento genômico finalizado em 1996, sendo composto de cerca de 6600 ORF\'s ( \"open reading frames\", quadros abertos de leitura) das quais aproximadamente 20% estão anotadas como não caracterizadas e de função molecular desconhecida. Com o objetivo de caracterizar algumas dessas ORF\'s relacionadas aos processos antioxidantes, escolhemos a proteína Yjl077cp. Através de nossos experimentos foi possível relacionar a proteína Yjl077cp com a resposta antioxidante, pois a linhagem mutante para o gene YJL077C apresentou letalidade quando exposta por 24 horas a uma concentração de 3mM de peróxido de hidrogênio (H2O2) . Testes de tolerância ao cobre, demonstraram que esse metal na concentração de 10mM, adicionado diretamente ao meio de cultura YPD, após um período de 4 horas de incubação afeta a cinética de crescimento, e após 24 horas de incubação, essa concentração é letal para a linhagem mutante. Observamos que a adição de CuSO4, causa modificação de pH do meio de cultura YPD, foram realizados experimentos para que verificássemos o efeito da acidificação do meio de cultura na viabilidade de Δics3, através de experimentos de tolerância em meio YPD ácido (pH 4.0) e com pH corrigido com adição de CuSO4. De acordo com os resultados obtidos, o efeito da letalidade de 10 mM de CuSO4 observado sem correção de pH, não ocorre quando em meio de cultura com o pH corrigido (pH6.0), demonstrando que, a letalidade da linhagem Δics3 é causada pelo acréscimo do metal e a mudança de pH (ácido, pH4.0). Testes de ICP-AES detectaram uma maior absorção intracelular de cobre na linhagem mutante Δics3, em condições de pH 4.0, quando comparada a absorção desse mesmo metal em condições de pH 6.0, demonstrando que grandes quantidades de cobre, estão sendo incorporadas para o meio intracelular, devido a acidificação do meio, sugerindo o envolvimento de Δics3, às ações das VATP-ases. Em conjunto esses resultados demonstram que o gene ICS3 é importante para a manutenção da viabilidade celular de S. cerevisiae crescida em meio de cultura com pH ácido e em condições de altas concentrações de CuSO4. O objetivo do presente trabalho foi entender a relação de ICS3 na resposta antioxidante e sensibilidade ao cobre através de experimentos de tolerância e em meio YPD ácido (pH 4.5) e com pH corrigido após adição de CuSO4. / Saccharomyces cerevisiae had its genome sequencing completed in 1996, consisting of about 6600 ORF\'s (\"open reading frames\" open reading frames) of which approximately 20% are annotated as uncharacterized and unknown molecular function. In order to characterize some of these ORF\'s related to antioxidants processes, we chose Yjl077cp protein . Through our experiments it was possible to relate the Yjl077cp protein with the antioxidant response, because the mutant strain to YJL077C gene showed lethality when exposed for 24 hours at a concentration of 3 mM hydrogen peroxide (H2O2). Copper tolerance tests demonstrated that this metal at concentration 10mM added directly to the medium YPD culture after a 4-hour period of incubation affects the growth kinetics, and after 24 hours of incubation, these concentration is lethal to mutant strain. We found that the addition of CuSO4, causes pH modification in the YPD culture medium, experiments were conducted to we check the effect of acidification of the culture medium on the viability of Δics3 through experiments of acid tolerance in YPD medium (pH 4.0) and pH adjusted with addition of CuSO4. According to the results, the effect of mortality of 10 mM CuSO4 observed without pH correction, does not occur when the culture medium with the Ph adjusted (pH6.0), demonstrating that the lethality of the strain Δics3 is caused by adding the metal and the change of pH (acid, pH4.0). ICP-OES tests detected greater intracellular uptake of copper in the mutant strain l1ics3 under conditions of pH 4.0 when compared to absorption of the same metal under conditions of pH 6.0, demonstrating that large amounts of copper, are being incorporated into the intracellular medium due to acidification of the medium, suggesting the involvement of Δics3 to the actions of the VATP-ases. Together, these results demonstrate that ICS3 gene is important for maintaining cell viability of S. cerevisiae grown in culture medium at acidic pH, and under conditions of high concentrations of CuSO4. The objective of this study was to understand the relationship ICS3 in antioxidant response and sensitivity to copper through experiments tolerance and YPD medium acid (pH 4.5) and fixed pH after addition of CuSO4.

Saccharomyces cerevisiae teve seu seqüenciamento genômico finalizado em 1996, sendo composto de cerca de 6600 ORF\'s ( \"open reading frames\", quadros abertos de leitura) das quais aproximadamente 20% estão anotadas como não caracterizadas e de função molecular desconhecida. Com o objetivo de caracterizar algumas dessas ORF\'s relacionadas aos processos antioxidantes, escolhemos a proteína Yjl077cp. Através de nossos experimentos foi possível relacionar a proteína Yjl077cp com a resposta antioxidante, pois a linhagem mutante para o gene YJL077C apresentou letalidade quando exposta por 24 horas a uma concentração de 3mM de peróxido de hidrogênio (H2O2) . Testes de tolerância ao cobre, demonstraram que esse metal na concentração de 10mM, adicionado diretamente ao meio de cultura YPD, após um período de 4 horas de incubação afeta a cinética de crescimento, e após 24 horas de incubação, essa concentração é letal para a linhagem mutante. Observamos que a adição de CuSO4, causa modificação de pH do meio de cultura YPD, foram realizados experimentos para que verificássemos o efeito da acidificação do meio de cultura na viabilidade de Δics3, através de experimentos de tolerância em meio YPD ácido (pH 4.0) e com pH corrigido com adição de CuSO4. De acordo com os resultados obtidos, o efeito da letalidade de 10 mM de CuSO4 observado sem correção de pH, não ocorre quando em meio de cultura com o pH corrigido (pH6.0), demonstrando que, a letalidade da linhagem Δics3 é causada pelo acréscimo do metal e a mudança de pH (ácido, pH4.0). Testes de ICP-AES detectaram uma maior absorção intracelular de cobre na linhagem mutante Δics3, em condições de pH 4.0, quando comparada a absorção desse mesmo metal em condições de pH 6.0, demonstrando que grandes quantidades de cobre, estão sendo incorporadas para o meio intracelular, devido a acidificação do meio, sugerindo o envolvimento de Δics3, às ações das VATP-ases. Em conjunto esses resultados demonstram que o gene ICS3 é importante para a manutenção da viabilidade celular de S. cerevisiae crescida em meio de cultura com pH ácido e em condições de altas concentrações de CuSO4. O objetivo do presente trabalho foi entender a relação de ICS3 na resposta antioxidante e sensibilidade ao cobre através de experimentos de tolerância e em meio YPD ácido (pH 4.5) e com pH corrigido após adição de CuSO4. / Saccharomyces cerevisiae had its genome sequencing completed in 1996, consisting of about 6600 ORF\'s (\"open reading frames\" open reading frames) of which approximately 20% are annotated as uncharacterized and unknown molecular function. In order to characterize some of these ORF\'s related to antioxidants processes, we chose Yjl077cp protein . Through our experiments it was possible to relate the Yjl077cp protein with the antioxidant response, because the mutant strain to YJL077C gene showed lethality when exposed for 24 hours at a concentration of 3 mM hydrogen peroxide (H2O2). Copper tolerance tests demonstrated that this metal at concentration 10mM added directly to the medium YPD culture after a 4-hour period of incubation affects the growth kinetics, and after 24 hours of incubation, these concentration is lethal to mutant strain. We found that the addition of CuSO4, causes pH modification in the YPD culture medium, experiments were conducted to we check the effect of acidification of the culture medium on the viability of Δics3 through experiments of acid tolerance in YPD medium (pH 4.0) and pH adjusted with addition of CuSO4. According to the results, the effect of mortality of 10 mM CuSO4 observed without pH correction, does not occur when the culture medium with the Ph adjusted (pH6.0), demonstrating that the lethality of the strain Δics3 is caused by adding the metal and the change of pH (acid, pH4.0). ICP-OES tests detected greater intracellular uptake of copper in the mutant strain l1ics3 under conditions of pH 4.0 when compared to absorption of the same metal under conditions of pH 6.0, demonstrating that large amounts of copper, are being incorporated into the intracellular medium due to acidification of the medium, suggesting the involvement of Δics3 to the actions of the VATP-ases. Together, these results demonstrate that ICS3 gene is important for maintaining cell viability of S. cerevisiae grown in culture medium at acidic pH, and under conditions of high concentrations of CuSO4. The objective of this study was to understand the relationship ICS3 in antioxidant response and sensitivity to copper through experiments tolerance and YPD medium acid (pH 4.5) and fixed pH after addition of CuSO4.