Resumo: A terapia pró-droga/enzima direcionada por anticorpo (ADEPT) consiste em uma primeira etapa , no direcionamento de uma enzima veiculada por anticorpo à uma célula tumoral. Numa segunda etapa uma pró-droga inócua é administrada, e, na presença da enzima, produz compostos citotóxicos restritos à localização do tumor. O par enzima/pró-droga horseradish peroxidase (HRP)/ ácido 3- indol acético (IAA) tem sido aplicada nas estratégias ADEPT. Nesta combinação, o hormônio de planta não tóxico IAA é ativado para espécies citotóxicas pela ação catalítica da HRP. A elucidação das etapas e produtos da reação IAA/HRP levou uma série de moléculas produto a serem apontadas como responsáveis pelos efeitos citotóxicos sem que, até o presente momento, o mecanismo de citotoxicidade tenha sido elucidado. Nesse trabalho, utilizando-se células McCoy como alvo, foi constatado um efeito citotóxico dose dependente do sistema IAA/HRP, por necrose. Esse efeito é quase completamente abolido com a utilização de substâncias antioxidantes ou em anaerobiose. Também foi estudado o uso de um Ester derivado do IAA, o Etil Ester do IAA, como uma nova combinação citotóxica pró-droga/ enzima. Foi constatado que a HRP isolada não consegue catalizar a oxidação do Etil Ester do IAA na ausência de uma enzima adicional (esterase). Dessa forma, pode-se controlar a citotoxicidade do IAA pelo uso de duas enzimas, HRP e esterase. Finalmente, foram apresentadas evidências da aplicação potencial da tríade: Etil Ester IAA/ esterase/ HRP como uma estratégia potencial para a metodologia ADEPT e correlata. / Abstract: The antibody-directed enzyme pro-drug therapy (ADEPT) in a first stage, it's directed to an enzyme carried to an antibody to a tumor cell. In a second stage a pro-drug harmless is administered, and in the presence of the enzyme, produces cytotoxic compounds restricted the location of the tumor. The pair enzyme / pro-drug horseradish peroxidase (HRP)/ 3 - indole acetic acid (IAA) has been applied in ADEPT strategies. In this combination, the nontoxic plant hormone nontoxic IAA is activated for cytotoxic species by the action of catalytic HRP. The elucidation of the steps and products of the reaction IAA/ HRP led to a series of product molecules identified as being responsible for cytotoxic effects, without, so far, the mechanism of cytotoxicity has been elucidated. In this work, using cells McCoy as a target, we have seen a cytotoxic effect dosedependent system IAA/ HRP, for necrosis. This effect is almost completely abolished with the use of antioxidant substances or oxygen depletion. We also studied the use of an Ester derived from the IAA, the Ethyl Ester of the IAA, as a new combination cytotoxic pro-drug/ enzyme. We have seen that the HRP alone can not catalyze the oxidation of Ethyl Ester of the IAA in the absence of an additional enzyme (esterase). Thus, we can control the cytotoxicity of the IAA for the use of two enzymes, HRP and esterase. Finally, we showed evidence of the potential application of the triad: Ethyl Ester IAA/esterase/ HRP as a potential strategy for the methodology ADEPT and correlates. / Orientador: Luiz Marcos da Fonseca / Coorientador: Valdecir Farias Ximenes / Banca: Maria das Graças Carvalho / Banca: Eliana Aparecida Varanda / Mestre

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:26:04Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2008-02-21Bitstream added on 2014-06-13T20:33:42Z : No. of bitstreams: 1 paulino_rm_me_sjrp.pdf: 631732 bytes, checksum: 8c76eb651a555b24c6330a87635738fb (MD5) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / Zaprionus indianus (Diptera:Drosophilidae) é uma espécie provavelmente de origem africana e que rapidamente se dispersou por parte do continente sul-americano. Hoje, indivíduos dessa espécie são encontrados numa amplitude latitudinal de 35°, do Uruguai a Belém (Brasil). Em Z. indianus e nos demais insetos, as esterases constituem um grupo multifuncional e heterogêneo de enzimas que participam da hidrólise de ésteres, além de estarem relacionadas a diversos processos metabólicos. Neste estudo, foram realizadas análises de esterases de Z. indianus e Drosophila melanogaster, em géis de poliacrilamida (PAGE) a 10% de concentração, em indivíduos dos dois sexos e em diferentes fases do desenvolvimento. Os resultados indicaram que algumas carboxilesterases (respectivamente EST-2 e EST-5 de Z. indianus e EST-6 D. melanogaster) apresentam atividade acentuada em machos. Estas enzimas mostraram similaridades nas duas espécies, tais como o mesmo padrão de inibição, expressão principalmente no estágio adulto e aumento da atividade enzimática com o aumento da idade dos indivíduos. As similaridades bioquímicas entre as enzimas dos dois drosofilídeos sugerem ortologia entre seus genes codificadores. Foram então realizadas reações de PCR, utilizando oligonucleotídeos iniciadores desenhados com base na seqüência do gene Est-6 de D. melanogaster e o DNA genômico de Z. indianus. O fragmento amplificado foi seqüenciado, com composição GC de 48,5% e similaridade de 73% com a seqüência do gene de Est-6 de D. melanogaster. A análise da razão das substituições sinônimas e não sinônimas sugere uma proteína sob ação de seleção normalizadora, onde as trocas sinônimas são em sua maioria neutras e as não sinônimas, na maioria das vezes deletérias, foram eliminadas pela seleção natural. A modelagem... / Zaprionus indianus has expanded its geographical distribution since its recent invasion of the South American continent. The first record data of only eight years, and the origin is probably the South Africa. Nowadays, this species can be found in a latitudinal range of 35º, from Uruguay to Belem (Brazil). Esterases comprise a multi-functional and heterogeneous group of enzymes that participated in ester hydrolysis. In insects, they are related to several metabolic processes, including the reproductive function. Esterase patterns in Z. indianus and Drosophila melanogaster were characterized in polyacrylamide gels (PAGE). Two - esterases from Z. indianus, EST-2 and EST-5, showed similarity preference for substrate - naftil acetate and patterns of inhibition as compared to the EST-6 of D. melanogaster, suggesting a possible role in reproductive biology for both enzymes. Biochemical characterization of these esterases and its differential expression in males, suggest orthology among their genes. In this work, the genomic DNA from Z. indianus was submitted to PCR experiments using 3 sets of D. melanogaster Est-6 sequence primers. The PCR products were directly sequenced; its GC content was 48.5% and presented a 73% similarity compared to Est-6 D. melanogaster sequence. Analysis of sequence data, by estimates of nonsynonymous/synonymous rate ratios, showed that the majority of sites evolves under strong or moderate negative selection (81%) and a minority of sites (19%). is under significant positive selection. Molecular modeling indicates that the fundamental structural features important for catalysis are conserved in the esterase of Z. indianus and human bilesalt activated lipase (BAL), which was used as structural model. Structural and sequence comparisons suggest the evolutionary relationship between ...(Complete abstract click electronic access below)

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:26:19Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2008-10-07Bitstream added on 2014-06-13T18:29:59Z : No. of bitstreams: 1 pereira_dh_me_arafcf.pdf: 425995 bytes, checksum: 068eeb34dc2b20bf30e7a59473c11414 (MD5) / Universidade Estadual Paulista (UNESP) / A terapia pró-droga/enzima direcionada por anticorpo (ADEPT) consiste em uma primeira etapa , no direcionamento de uma enzima veiculada por anticorpo à uma célula tumoral. Numa segunda etapa uma pró-droga inócua é administrada, e, na presença da enzima, produz compostos citotóxicos restritos à localização do tumor. O par enzima/pró-droga horseradish peroxidase (HRP)/ ácido 3- indol acético (IAA) tem sido aplicada nas estratégias ADEPT. Nesta combinação, o hormônio de planta não tóxico IAA é ativado para espécies citotóxicas pela ação catalítica da HRP. A elucidação das etapas e produtos da reação IAA/HRP levou uma série de moléculas produto a serem apontadas como responsáveis pelos efeitos citotóxicos sem que, até o presente momento, o mecanismo de citotoxicidade tenha sido elucidado. Nesse trabalho, utilizando-se células McCoy como alvo, foi constatado um efeito citotóxico dose dependente do sistema IAA/HRP, por necrose. Esse efeito é quase completamente abolido com a utilização de substâncias antioxidantes ou em anaerobiose. Também foi estudado o uso de um Ester derivado do IAA, o Etil Ester do IAA, como uma nova combinação citotóxica pró-droga/ enzima. Foi constatado que a HRP isolada não consegue catalizar a oxidação do Etil Ester do IAA na ausência de uma enzima adicional (esterase). Dessa forma, pode-se controlar a citotoxicidade do IAA pelo uso de duas enzimas, HRP e esterase. Finalmente, foram apresentadas evidências da aplicação potencial da tríade: Etil Ester IAA/ esterase/ HRP como uma estratégia potencial para a metodologia ADEPT e correlata. / The antibody-directed enzyme pro-drug therapy (ADEPT) in a first stage, it’s directed to an enzyme carried to an antibody to a tumor cell. In a second stage a pro-drug harmless is administered, and in the presence of the enzyme, produces cytotoxic compounds restricted the location of the tumor. The pair enzyme / pro-drug horseradish peroxidase (HRP)/ 3 - indole acetic acid (IAA) has been applied in ADEPT strategies. In this combination, the nontoxic plant hormone nontoxic IAA is activated for cytotoxic species by the action of catalytic HRP. The elucidation of the steps and products of the reaction IAA/ HRP led to a series of product molecules identified as being responsible for cytotoxic effects, without, so far, the mechanism of cytotoxicity has been elucidated. In this work, using cells McCoy as a target, we have seen a cytotoxic effect dosedependent system IAA/ HRP, for necrosis. This effect is almost completely abolished with the use of antioxidant substances or oxygen depletion. We also studied the use of an Ester derived from the IAA, the Ethyl Ester of the IAA, as a new combination cytotoxic pro-drug/ enzyme. We have seen that the HRP alone can not catalyze the oxidation of Ethyl Ester of the IAA in the absence of an additional enzyme (esterase). Thus, we can control the cytotoxicity of the IAA for the use of two enzymes, HRP and esterase. Finally, we showed evidence of the potential application of the triad: Ethyl Ester IAA/esterase/ HRP as a potential strategy for the methodology ADEPT and correlates.

Resumo: Zaprionus indianus (Diptera:Drosophilidae) é uma espécie provavelmente de origem africana e que rapidamente se dispersou por parte do continente sul-americano. Hoje, indivíduos dessa espécie são encontrados numa amplitude latitudinal de 35°, do Uruguai a Belém (Brasil). Em Z. indianus e nos demais insetos, as esterases constituem um grupo multifuncional e heterogêneo de enzimas que participam da hidrólise de ésteres, além de estarem relacionadas a diversos processos metabólicos. Neste estudo, foram realizadas análises de esterases de Z. indianus e Drosophila melanogaster, em géis de poliacrilamida (PAGE) a 10% de concentração, em indivíduos dos dois sexos e em diferentes fases do desenvolvimento. Os resultados indicaram que algumas carboxilesterases (respectivamente EST-2 e EST-5 de Z. indianus e EST-6 D. melanogaster) apresentam atividade acentuada em machos. Estas enzimas mostraram similaridades nas duas espécies, tais como o mesmo padrão de inibição, expressão principalmente no estágio adulto e aumento da atividade enzimática com o aumento da idade dos indivíduos. As similaridades bioquímicas entre as enzimas dos dois drosofilídeos sugerem ortologia entre seus genes codificadores. Foram então realizadas reações de PCR, utilizando oligonucleotídeos iniciadores desenhados com base na seqüência do gene Est-6 de D. melanogaster e o DNA genômico de Z. indianus. O fragmento amplificado foi seqüenciado, com composição GC de 48,5% e similaridade de 73% com a seqüência do gene de Est-6 de D. melanogaster. A análise da razão das substituições sinônimas e não sinônimas sugere uma proteína sob ação de seleção normalizadora, onde as trocas sinônimas são em sua maioria neutras e as não sinônimas, na maioria das vezes deletérias, foram eliminadas pela seleção natural. A modelagem ...(Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Zaprionus indianus has expanded its geographical distribution since its recent invasion of the South American continent. The first record data of only eight years, and the origin is probably the South Africa. Nowadays, this species can be found in a latitudinal range of 35º, from Uruguay to Belem (Brazil). Esterases comprise a multi-functional and heterogeneous group of enzymes that participated in ester hydrolysis. In insects, they are related to several metabolic processes, including the reproductive function. Esterase patterns in Z. indianus and Drosophila melanogaster were characterized in polyacrylamide gels (PAGE). Two - esterases from Z. indianus, EST-2 and EST-5, showed similarity preference for substrate - naftil acetate and patterns of inhibition as compared to the EST-6 of D. melanogaster, suggesting a possible role in reproductive biology for both enzymes. Biochemical characterization of these esterases and its differential expression in males, suggest orthology among their genes. In this work, the genomic DNA from Z. indianus was submitted to PCR experiments using 3 sets of D. melanogaster Est-6 sequence primers. The PCR products were directly sequenced; its GC content was 48.5% and presented a 73% similarity compared to Est-6 D. melanogaster sequence. Analysis of sequence data, by estimates of nonsynonymous/synonymous rate ratios, showed that the majority of sites evolves under strong or moderate negative selection (81%) and a minority of sites (19%). is under significant positive selection. Molecular modeling indicates that the fundamental structural features important for catalysis are conserved in the esterase of Z. indianus and human bilesalt activated lipase (BAL), which was used as structural model. Structural and sequence comparisons suggest the evolutionary relationship between ...(Complete abstract click electronic access below) / Orientador: Carlos Roberto Ceron / Coorientador: Claudia Marcia Aparecida Carareto / Banca: Maura Helena Manfrin / Banca: Hermione de Campos Bicudo / Mestre