Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Estreptococos do grupo B (EGB), principalmente sorotipo III são a principal causa de pneumonia neonatal, sepse e meningite. O potencial de virulência das amostras de EGB pode determinar a colonização ou a infecção do hospedeiro. Como o pulmão constitui uns dos primeiros órgãos durante o processo de invasão sistêmica por EGB, nós decidimos investigar os mecanismos de adesão e invasão de amostras do sorotipo III (90356-líquor e 80340-vagina) com linhagem de células epiteliais do pulmão humano (A549). Desta forma, o principal objetivo deste estudo foi avaliar a capacidade de aderência e invasão de duas amostras de EGB sorotipo III com células de epiteliais pulmonares A549, a persistência bacteriana intracelular, a fusão com compartimentos acídicos, potencial citotóxico e indução de apoptose. As amostras mostraram capacidade de aderir e invadir o epitélio pulmonar A549, onde a amostra 90356-líquor isolada de paciente a que apresentou maior propriedade adesiva e invasiva que a amostra 80340-vagina (p<0,05). Ambas as cepas mostraram persistência intracelular sem replicação no interior do epitélio respiratório até 24h de incubação. Além disso, verificamos que os EGB são capazes de promover vacuolização celular permanecendo viáveis dentro de vacúolos acídicos, sugerindo a ocorrência de fusão lisossomo-fagossomo. A amostra 90356-líquor também mostrou maior citotoxidade quando comparada com a amostra 80340-vagina. A análise por citometria de fluxo demonstrou, pela primeira vez, que o EGB induz apoptose em epitélio respiratório, podendo representar um mecanismo importante para o desenvolvimento da lesão celular aguda e a patogênese bacteriana. / Group B streptococci (GBS), mainly serotype III, is a major cause of neonatal pneumonia, sepsis and meningitis. Virulence potential of GBS strains may determine the outcome of host colonization or infection. Because the lung constitutes a first step in GBS systemic invasion processes, we have investigates the adherence and invasion mechanisms of GBS-III isolates to human lung epithelial cell line (A549). Thus, the main objective of this study was to evaluate the ability of adhesion and invasion of GBS strains serotype III (90356-liquor and 80340-vagina) with A549 lung epithelial cells, intracellular bacterial persistence, fusion with acidic compartments, cytotoxic potential, and induction of apoptosis. The strains showed ability to adhere and invade the epithelial A549 cells; GBS 90356-liquor isolated from a patient showed a more efficient adherence and invasion properties than GBS-III 80340 isolated from vagina (P<0,05). Both strains showed persistent intracellular viability without replication into A549 cells up to 24h incubation. In addition, we found that GBS are able to promote cellular vacuolization and persisted viable inside acidic vacuoles, suggesting lysosome-phagosome fusion. The GBS 90356-líquor also showed higher cytotoxicity when compared with 80340-vagina strain. The present work describe for first time by flow cytometry that GBS induces apoptosis in respiratory epithelium and be an important mechanism for the development of acute cellular injury and bacterial pathogenesis.

Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Streptococcus agalactiae, ou Streptococcus do grupo B (GBS), é um importante patógeno oportunista que causa pneumonia, sepse e meningite em recém-nascidos e infecções em adultos imunocomprometidos. O pulmão aparentemente é o portal de entrada para o EGB na corrente sanguínea o que pode evoluir para uma septicemia. Os mecanismos de virulência relevantes envolve a habilidade do EGB em penetrar e sobreviver intracelularmente em células hospedeiras. Neste trabalho, foram analisados os mecanismos moleculares da apoptose epitelial induzida pelo EGB, e a produção de óxido nítrico (NO) e espécies reativas de oxigênio (ROS) em células epiteliais respiratórias A549 durante a infecção por EGB. Todas as amostras de EGB exibiram a capacidade de aderir e invadir células A549. A sobrevivência intracelular do EGB em células A549 ocorreu durante 24 h de incubação sem replicação do patógeno. No entanto, a amsotra 88641-V isolada de vagina não sobreviveu após 0,5 h de interação. O EGB promoveu a perda de viabilidade do epitélio durante a infecção. As alterações morfológicas em células A549 infectadas com o EGB incluem arredondamento celular, condensação nuclear, encolhimento celular e perda de contato célula-célula e célula-substrato. A dupla marcação AV/IP revelou que amostras de EGB sorotipo III induziram apoptose enquanto amostras do sorotipo V induziram morte celular semelhante a necrose em células A549. Caspase-3 foi ativada durante a apoptose induzida por EGB em células epiteliais. No entanto, a ativação de caspases-8 e -9 foi detectada apenas para a amostra 88641-V e as amostras EGB do sorotipo III, respectivamente. Experimentos comparativos de Immunoblotting revelaram que o EGB induziu um aumento da expressão Bim, uma proteína pró-apoptótica e diminuiu a expressão de Bcl-2 e Bcl-xL, proteínas anti-apoptóticas. As células A549 apresentaram perda de potencial de membrana mitocondrial &#916;&#968;m e co-localização com o Bax. Ensaio de espectrometria de massa identificou a proteína PI-2a, uma proteína estrutural de pili, que exibe atividade carboxipepdidase. Descobrimos que os dois sorotipos (III e V) induziram a produção ROS e NO em células A549. Em conclusão, a apoptose induzida pelo EGB em células A549 é um mecanismo importante de virulência, resultando na destruição de tecidos, escape do sistema imune do hospedeiro com espalhamento bacteriano e, em consequência, a doença invasiva ou uma infecção sistémica. / Streptococcus agalactiae, or group B Streptococcus (GBS), is an important opportunistic pathogen that causes pneumonia, sepsis, and meningitis in neonates and severe diseases in immunocompromised adults. The lung is the apparent portal of entry for GBS into the bloodstream, after which septicemia may ensue. A relevant virulence mechanism involves the ability of GBS to penetrate and to survive intracellularly within these host cells. In this work, we analyzed the molecular mechanisms of GBS-induced epithelial apoptosis, and nitric oxide (NO) and reactive oxygen species (ROS) production by lung epithelial cell line A549 cells during infection with GBS. All GBS exhibited the ability to adhere and to invade A549 cells. The survival of GBS within A549 cells without replication was shown during 24 h incubation. However, the 88641-V strain isolated from vagina did not survive after 0.5 h of interaction. GBS promoted the loss of viability of the epithelium during infection. The morphological changes in A549 cells infected with GBS included cell rounding, nuclear condensation, cellular shrinkage and loss of cell-cell contact and cell-substrate. The double staining AV / IP revealed that GBS serotype III induced apoptosis while GBS serotype V induced like necrosis cell death in A549 cells. Caspase-3 was activated during GBS-induced endothelial apoptosis. However, activation of caspases-8 and -9 was detected only by GBS 88641-V and GBS-III, respectively. Comparative immunoblotting experiments revealed that GBS induced an increasing pro-apoptotic Bim expression and decreasing anti-apoptotic Bcl-2 and Bcl-XL expression. A549 cells exhibited loss of mitochondrial membrane potential &#916;&#968;m with Bax colocalization. Mass spectrometry assay identified protein PI-2a, a structural protein pili, which exhibit carboxipepdidase activity. We found that both serotypes (III and V) induced ROS and NO production in A549 cells. In conclusion, apoptosis of A549 cell induced by GBS is an important virulence mechanism resulting in tissue destruction, escape from the host immune system with bacterial spreading and, in consequence, invasive disease or systemic infection.

Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Estreptococos do grupo B (EGB), principalmente sorotipo III são a principal causa de pneumonia neonatal, sepse e meningite. O potencial de virulência das amostras de EGB pode determinar a colonização ou a infecção do hospedeiro. Como o pulmão constitui uns dos primeiros órgãos durante o processo de invasão sistêmica por EGB, nós decidimos investigar os mecanismos de adesão e invasão de amostras do sorotipo III (90356-líquor e 80340-vagina) com linhagem de células epiteliais do pulmão humano (A549). Desta forma, o principal objetivo deste estudo foi avaliar a capacidade de aderência e invasão de duas amostras de EGB sorotipo III com células de epiteliais pulmonares A549, a persistência bacteriana intracelular, a fusão com compartimentos acídicos, potencial citotóxico e indução de apoptose. As amostras mostraram capacidade de aderir e invadir o epitélio pulmonar A549, onde a amostra 90356-líquor isolada de paciente a que apresentou maior propriedade adesiva e invasiva que a amostra 80340-vagina (p<0,05). Ambas as cepas mostraram persistência intracelular sem replicação no interior do epitélio respiratório até 24h de incubação. Além disso, verificamos que os EGB são capazes de promover vacuolização celular permanecendo viáveis dentro de vacúolos acídicos, sugerindo a ocorrência de fusão lisossomo-fagossomo. A amostra 90356-líquor também mostrou maior citotoxidade quando comparada com a amostra 80340-vagina. A análise por citometria de fluxo demonstrou, pela primeira vez, que o EGB induz apoptose em epitélio respiratório, podendo representar um mecanismo importante para o desenvolvimento da lesão celular aguda e a patogênese bacteriana. / Group B streptococci (GBS), mainly serotype III, is a major cause of neonatal pneumonia, sepsis and meningitis. Virulence potential of GBS strains may determine the outcome of host colonization or infection. Because the lung constitutes a first step in GBS systemic invasion processes, we have investigates the adherence and invasion mechanisms of GBS-III isolates to human lung epithelial cell line (A549). Thus, the main objective of this study was to evaluate the ability of adhesion and invasion of GBS strains serotype III (90356-liquor and 80340-vagina) with A549 lung epithelial cells, intracellular bacterial persistence, fusion with acidic compartments, cytotoxic potential, and induction of apoptosis. The strains showed ability to adhere and invade the epithelial A549 cells; GBS 90356-liquor isolated from a patient showed a more efficient adherence and invasion properties than GBS-III 80340 isolated from vagina (P<0,05). Both strains showed persistent intracellular viability without replication into A549 cells up to 24h incubation. In addition, we found that GBS are able to promote cellular vacuolization and persisted viable inside acidic vacuoles, suggesting lysosome-phagosome fusion. The GBS 90356-líquor also showed higher cytotoxicity when compared with 80340-vagina strain. The present work describe for first time by flow cytometry that GBS induces apoptosis in respiratory epithelium and be an important mechanism for the development of acute cellular injury and bacterial pathogenesis.

Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Streptococcus agalactiae, ou Streptococcus do grupo B (GBS), é um importante patógeno oportunista que causa pneumonia, sepse e meningite em recém-nascidos e infecções em adultos imunocomprometidos. O pulmão aparentemente é o portal de entrada para o EGB na corrente sanguínea o que pode evoluir para uma septicemia. Os mecanismos de virulência relevantes envolve a habilidade do EGB em penetrar e sobreviver intracelularmente em células hospedeiras. Neste trabalho, foram analisados os mecanismos moleculares da apoptose epitelial induzida pelo EGB, e a produção de óxido nítrico (NO) e espécies reativas de oxigênio (ROS) em células epiteliais respiratórias A549 durante a infecção por EGB. Todas as amostras de EGB exibiram a capacidade de aderir e invadir células A549. A sobrevivência intracelular do EGB em células A549 ocorreu durante 24 h de incubação sem replicação do patógeno. No entanto, a amsotra 88641-V isolada de vagina não sobreviveu após 0,5 h de interação. O EGB promoveu a perda de viabilidade do epitélio durante a infecção. As alterações morfológicas em células A549 infectadas com o EGB incluem arredondamento celular, condensação nuclear, encolhimento celular e perda de contato célula-célula e célula-substrato. A dupla marcação AV/IP revelou que amostras de EGB sorotipo III induziram apoptose enquanto amostras do sorotipo V induziram morte celular semelhante a necrose em células A549. Caspase-3 foi ativada durante a apoptose induzida por EGB em células epiteliais. No entanto, a ativação de caspases-8 e -9 foi detectada apenas para a amostra 88641-V e as amostras EGB do sorotipo III, respectivamente. Experimentos comparativos de Immunoblotting revelaram que o EGB induziu um aumento da expressão Bim, uma proteína pró-apoptótica e diminuiu a expressão de Bcl-2 e Bcl-xL, proteínas anti-apoptóticas. As células A549 apresentaram perda de potencial de membrana mitocondrial &#916;&#968;m e co-localização com o Bax. Ensaio de espectrometria de massa identificou a proteína PI-2a, uma proteína estrutural de pili, que exibe atividade carboxipepdidase. Descobrimos que os dois sorotipos (III e V) induziram a produção ROS e NO em células A549. Em conclusão, a apoptose induzida pelo EGB em células A549 é um mecanismo importante de virulência, resultando na destruição de tecidos, escape do sistema imune do hospedeiro com espalhamento bacteriano e, em consequência, a doença invasiva ou uma infecção sistémica. / Streptococcus agalactiae, or group B Streptococcus (GBS), is an important opportunistic pathogen that causes pneumonia, sepsis, and meningitis in neonates and severe diseases in immunocompromised adults. The lung is the apparent portal of entry for GBS into the bloodstream, after which septicemia may ensue. A relevant virulence mechanism involves the ability of GBS to penetrate and to survive intracellularly within these host cells. In this work, we analyzed the molecular mechanisms of GBS-induced epithelial apoptosis, and nitric oxide (NO) and reactive oxygen species (ROS) production by lung epithelial cell line A549 cells during infection with GBS. All GBS exhibited the ability to adhere and to invade A549 cells. The survival of GBS within A549 cells without replication was shown during 24 h incubation. However, the 88641-V strain isolated from vagina did not survive after 0.5 h of interaction. GBS promoted the loss of viability of the epithelium during infection. The morphological changes in A549 cells infected with GBS included cell rounding, nuclear condensation, cellular shrinkage and loss of cell-cell contact and cell-substrate. The double staining AV / IP revealed that GBS serotype III induced apoptosis while GBS serotype V induced like necrosis cell death in A549 cells. Caspase-3 was activated during GBS-induced endothelial apoptosis. However, activation of caspases-8 and -9 was detected only by GBS 88641-V and GBS-III, respectively. Comparative immunoblotting experiments revealed that GBS induced an increasing pro-apoptotic Bim expression and decreasing anti-apoptotic Bcl-2 and Bcl-XL expression. A549 cells exhibited loss of mitochondrial membrane potential &#916;&#968;m with Bax colocalization. Mass spectrometry assay identified protein PI-2a, a structural protein pili, which exhibit carboxipepdidase activity. We found that both serotypes (III and V) induced ROS and NO production in A549 cells. In conclusion, apoptosis of A549 cell induced by GBS is an important virulence mechanism resulting in tissue destruction, escape from the host immune system with bacterial spreading and, in consequence, invasive disease or systemic infection.