aEPEC é capaz de causar lesão A/E, provocada por proteínas codificadas na região LEE. Foi realizada a análise estrutural e funcional da região LEE de amostras de aEPEC que expressam os padrões ALL, AA e AD, e amostra não aderente (NA). O padrão de adesão característico e capacidade de causar a lesão A/E foram investigados em células epiteliais. As amostras mantiveram o padrão de adesão independentemente da origem da linhagem celular. A lesão A/E foi detectada em algumas linhagens celulares após o contato com as amostras ALL e AD. A presença da região LEE foi detectada intacta e ensaios de PCR em tempo real, microarray e imunodetecção, mostrando a funcionalidade da mesma em todas as amostras. Um plasmídio que expressa a proteína EspFu foi introduzido em todas as 4 amostras, demonstrando não influenciar nos padrões de adesão e nem na capacidade de causar a lesão A/E nas amostras ALL, AA e AD. Mas, a amostra NA expressou o padrão ALL e foi capaz de causar a lesão A/E. Assim, EspFu desempenhou papel na adesão celular além do estabelecimento da lesão A/E in vitro. / aEPEC is capable to cause A/E lesion, triggered by proteins encoded by LEE region. We analyzed structurally and functionally the LEE region of aEPEC strains displaying LAL, AA, DA, and one nonadherent (NA) strain. The adherence characteristics and ability to cause A/E were investigated in epithelial cells. The displayed adherence patterns were independent of the cell line origin. A/E lesion was detected in some cellular lines after contact only with ALL- and AD-strains. LEE region presence was detected intact and real time PCR, microarray and immunodetection, in all samples tested. An EspFu-expressing plasmid was introduced in all strains, demonstrating no influence of this protein neither in the adherence patterns nor in the capacity to cause A/E of the LAL-, AA- and DA-strains. But, NA-strain expressed the LAL pattern and was able to cause A/E. Therefore, EspFu was shown to play a role in cell adhesion in addition to the establishment of the A/E lesion in vitro.

aEPEC é capaz de causar lesão A/E, provocada por proteínas codificadas na região LEE. Foi realizada a análise estrutural e funcional da região LEE de amostras de aEPEC que expressam os padrões ALL, AA e AD, e amostra não aderente (NA). O padrão de adesão característico e capacidade de causar a lesão A/E foram investigados em células epiteliais. As amostras mantiveram o padrão de adesão independentemente da origem da linhagem celular. A lesão A/E foi detectada em algumas linhagens celulares após o contato com as amostras ALL e AD. A presença da região LEE foi detectada intacta e ensaios de PCR em tempo real, microarray e imunodetecção, mostrando a funcionalidade da mesma em todas as amostras. Um plasmídio que expressa a proteína EspFu foi introduzido em todas as 4 amostras, demonstrando não influenciar nos padrões de adesão e nem na capacidade de causar a lesão A/E nas amostras ALL, AA e AD. Mas, a amostra NA expressou o padrão ALL e foi capaz de causar a lesão A/E. Assim, EspFu desempenhou papel na adesão celular além do estabelecimento da lesão A/E in vitro. / aEPEC is capable to cause A/E lesion, triggered by proteins encoded by LEE region. We analyzed structurally and functionally the LEE region of aEPEC strains displaying LAL, AA, DA, and one nonadherent (NA) strain. The adherence characteristics and ability to cause A/E were investigated in epithelial cells. The displayed adherence patterns were independent of the cell line origin. A/E lesion was detected in some cellular lines after contact only with ALL- and AD-strains. LEE region presence was detected intact and real time PCR, microarray and immunodetection, in all samples tested. An EspFu-expressing plasmid was introduced in all strains, demonstrating no influence of this protein neither in the adherence patterns nor in the capacity to cause A/E of the LAL-, AA- and DA-strains. But, NA-strain expressed the LAL pattern and was able to cause A/E. Therefore, EspFu was shown to play a role in cell adhesion in addition to the establishment of the A/E lesion in vitro.

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Corynebacterium diphtheriae é um importante patógeno humano e agente causal da difteria. Embora seja observada uma redução mundial no número de casos da doença, a difteria permanece endêmica em muitos países e surtos são esporadicamente notificados. No Brasil, o último surto ocorreu no estado no Maranhão e revelou mudanças em aspectos clínico-epidemiológicos da doença. Diferentemente da maioria das cepas de difteria brasileiras, que pertencem ao biovar mitis, nesse surto dois diferentes pulsotipos de C. diphtheriae biovar intermedius foram isolados. Além disso, sinais patognomônicos da doença não foram relatados em parte dos casos. C. diphtheriae também vem sendo relacionado com quadros de infecções invasivas, apesar de ser reconhecido como patógeno tipicamente extracelular. Em conjunto, estas mudanças no perfil das infecções por C. diphtheriae sugerem a existência de outros fatores de virulência além da produção da toxina diftérica. Neste sentindo, foram realizadas análises de tipagem molecular e de genômica comparativa para avaliar a diversidade genética e o potencial de virulência de cepas de C. diphtheriae isoladas de difteria clássica e infecções invasivas. Os resultados obtidos demonstram a circulação de diferentes clones invasores no Brasil. Além disso, revelaram diferenças marcantes na presença e na composição de ilhas de patogenicidade entre as amostras, bem como nos genes sob regulação do DtxR e nas sequências dos corinefagos integradas ao cromossomo bacteriano. Uma vez que o potencial invasor bacteriano e a persistência no ambiente podem estar relacionados à tolerância ao estresse oxidativo, foram procurados nos genomas sequenciados, genes possivelmente envolvidos neste processo. Dentre estes, os genes DIP0906, predito como gene de resistência ao oxidante telurito (TeO32-), e DIP1421, codificador do regulador transcricional OxyR, foram caracterizados funcionalmente e tiveram seus papéis na patogenicidade investigados. Ensaios in vivo utilizando o nematódeo Caenorhabditis elegans demonstraram que ambos são importantes para a virulência de C. diphtheriae. Além da resistência ao TeO32, DIP0906 parece contribuir para a resistência ao peróxido de hidrogênio (H2O2) e para a viabilidade no interior de células respiratórias humanas. Já OxyR, além de controlar negativamente a resposta ao H2O2, parece estar envolvido com a ligação de C. diphtheriae a proteínas plasmáticas e de matriz extracelular. Adicionalmente, foi investigada resistência e a capacidade de adaptação de C. diphtheriae frente a agentes oxidantes, através da indução de resposta adaptativa e/ou resistência cruzada e da formação de biofilme. As cepas de C. diphtheriae apresentaram diferentes níveis de resistência e um comportamento heterogêneo na presença dos agentes oxidantes, o que sugere a existência de diferentes estratégias de sobrevivência e adaptação de C. diphtheriae nas condições de estresse oxidativo. / Corynebacterium diphtheriae is an important human pathogen and the main causal agent of diphtheria. Although a reduction in the number of diphtheria cases is observed worldwide, diphtheria remains endemic in many countries and outbreaks are still reported sporadically. In Brazil, the last outbreak occurred in Maranhão and revealed changes in clinical and epidemiological diphtheria aspects. Despite most Brazilian C. diphtheriae belong to mitis biovar, in this outbreak were isolated two different pulsotypes of C. diphtheriae biovar intermedius. Furthermore, diphtheria pathognomonic features were absent in some cases. C. diphtheriae has also been associated with invasive infections, although typically recognized as extracellular pathogen. Together, these changes in profile of C. diphtheriae infections suggest the existence of other virulence factors besides the diphtheria toxin. In order to access the genetic diversity and the potential virulence of C. diphtheriae strains isolated from classical diphtheria and invasive infections, molecular typing and comparative genomics analyzes were conducted. The results demonstrated the circulation of different invasive clones in Brazil. Furthermore, they revealed differences in the presence and in the gene content of pathogenicity islands among C. diphtheriae strains. Differences were also found in DtxR regulon and in corynephages sequences. Once the bacterial invasiveness and persistence in the environment may be related to the tolerance to oxidative stress, determinants involved in this process were searched in C. diphtheriae genomes. Among these, the genes DIP0906, predicted as tellurite (TeO32-) resistance gene and DIP1421, an oxyR homolog, were characterized. Moreover, their roles in diphtheria bacilli pathogenesis were investigated. In vivo assays, using the nematode Caenorhabditis elegans, showed that both genes are important for C. diphtheriae virulence. DIP0906 seems to contribute to the resistance to hydrogen peroxide (H2O2) and to intracellular survival in human respiratory cells, besides involved in resistance to TeO32-. OxyR negatively controls the H2O2 response and appears to be involved with C. diphtheriae binding to plasma and extracellular matrix proteins. Additionally, bacterial resistance and adaptation, through the induction of adaptive response and / or cross-resistance and biofilm formation, of C. diphtheriae strains against oxidative agents were investigated. C. diphtheriae strains showed different oxidative resistance levels and a heterogeneous behavior in the presence of the agents, which suggest the existence of different strategies for adaptation of diphtheria bacilli under oxidative stress conditions.

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Corynebacterium diphtheriae é um importante patógeno humano e agente causal da difteria. Embora seja observada uma redução mundial no número de casos da doença, a difteria permanece endêmica em muitos países e surtos são esporadicamente notificados. No Brasil, o último surto ocorreu no estado no Maranhão e revelou mudanças em aspectos clínico-epidemiológicos da doença. Diferentemente da maioria das cepas de difteria brasileiras, que pertencem ao biovar mitis, nesse surto dois diferentes pulsotipos de C. diphtheriae biovar intermedius foram isolados. Além disso, sinais patognomônicos da doença não foram relatados em parte dos casos. C. diphtheriae também vem sendo relacionado com quadros de infecções invasivas, apesar de ser reconhecido como patógeno tipicamente extracelular. Em conjunto, estas mudanças no perfil das infecções por C. diphtheriae sugerem a existência de outros fatores de virulência além da produção da toxina diftérica. Neste sentindo, foram realizadas análises de tipagem molecular e de genômica comparativa para avaliar a diversidade genética e o potencial de virulência de cepas de C. diphtheriae isoladas de difteria clássica e infecções invasivas. Os resultados obtidos demonstram a circulação de diferentes clones invasores no Brasil. Além disso, revelaram diferenças marcantes na presença e na composição de ilhas de patogenicidade entre as amostras, bem como nos genes sob regulação do DtxR e nas sequências dos corinefagos integradas ao cromossomo bacteriano. Uma vez que o potencial invasor bacteriano e a persistência no ambiente podem estar relacionados à tolerância ao estresse oxidativo, foram procurados nos genomas sequenciados, genes possivelmente envolvidos neste processo. Dentre estes, os genes DIP0906, predito como gene de resistência ao oxidante telurito (TeO32-), e DIP1421, codificador do regulador transcricional OxyR, foram caracterizados funcionalmente e tiveram seus papéis na patogenicidade investigados. Ensaios in vivo utilizando o nematódeo Caenorhabditis elegans demonstraram que ambos são importantes para a virulência de C. diphtheriae. Além da resistência ao TeO32, DIP0906 parece contribuir para a resistência ao peróxido de hidrogênio (H2O2) e para a viabilidade no interior de células respiratórias humanas. Já OxyR, além de controlar negativamente a resposta ao H2O2, parece estar envolvido com a ligação de C. diphtheriae a proteínas plasmáticas e de matriz extracelular. Adicionalmente, foi investigada resistência e a capacidade de adaptação de C. diphtheriae frente a agentes oxidantes, através da indução de resposta adaptativa e/ou resistência cruzada e da formação de biofilme. As cepas de C. diphtheriae apresentaram diferentes níveis de resistência e um comportamento heterogêneo na presença dos agentes oxidantes, o que sugere a existência de diferentes estratégias de sobrevivência e adaptação de C. diphtheriae nas condições de estresse oxidativo. / Corynebacterium diphtheriae is an important human pathogen and the main causal agent of diphtheria. Although a reduction in the number of diphtheria cases is observed worldwide, diphtheria remains endemic in many countries and outbreaks are still reported sporadically. In Brazil, the last outbreak occurred in Maranhão and revealed changes in clinical and epidemiological diphtheria aspects. Despite most Brazilian C. diphtheriae belong to mitis biovar, in this outbreak were isolated two different pulsotypes of C. diphtheriae biovar intermedius. Furthermore, diphtheria pathognomonic features were absent in some cases. C. diphtheriae has also been associated with invasive infections, although typically recognized as extracellular pathogen. Together, these changes in profile of C. diphtheriae infections suggest the existence of other virulence factors besides the diphtheria toxin. In order to access the genetic diversity and the potential virulence of C. diphtheriae strains isolated from classical diphtheria and invasive infections, molecular typing and comparative genomics analyzes were conducted. The results demonstrated the circulation of different invasive clones in Brazil. Furthermore, they revealed differences in the presence and in the gene content of pathogenicity islands among C. diphtheriae strains. Differences were also found in DtxR regulon and in corynephages sequences. Once the bacterial invasiveness and persistence in the environment may be related to the tolerance to oxidative stress, determinants involved in this process were searched in C. diphtheriae genomes. Among these, the genes DIP0906, predicted as tellurite (TeO32-) resistance gene and DIP1421, an oxyR homolog, were characterized. Moreover, their roles in diphtheria bacilli pathogenesis were investigated. In vivo assays, using the nematode Caenorhabditis elegans, showed that both genes are important for C. diphtheriae virulence. DIP0906 seems to contribute to the resistance to hydrogen peroxide (H2O2) and to intracellular survival in human respiratory cells, besides involved in resistance to TeO32-. OxyR negatively controls the H2O2 response and appears to be involved with C. diphtheriae binding to plasma and extracellular matrix proteins. Additionally, bacterial resistance and adaptation, through the induction of adaptive response and / or cross-resistance and biofilm formation, of C. diphtheriae strains against oxidative agents were investigated. C. diphtheriae strains showed different oxidative resistance levels and a heterogeneous behavior in the presence of the agents, which suggest the existence of different strategies for adaptation of diphtheria bacilli under oxidative stress conditions.

Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Streptococcus agalactiae, ou Streptococcus do grupo B (GBS), é um importante patógeno oportunista que causa pneumonia, sepse e meningite em recém-nascidos e infecções em adultos imunocomprometidos. O pulmão aparentemente é o portal de entrada para o EGB na corrente sanguínea o que pode evoluir para uma septicemia. Os mecanismos de virulência relevantes envolve a habilidade do EGB em penetrar e sobreviver intracelularmente em células hospedeiras. Neste trabalho, foram analisados os mecanismos moleculares da apoptose epitelial induzida pelo EGB, e a produção de óxido nítrico (NO) e espécies reativas de oxigênio (ROS) em células epiteliais respiratórias A549 durante a infecção por EGB. Todas as amostras de EGB exibiram a capacidade de aderir e invadir células A549. A sobrevivência intracelular do EGB em células A549 ocorreu durante 24 h de incubação sem replicação do patógeno. No entanto, a amsotra 88641-V isolada de vagina não sobreviveu após 0,5 h de interação. O EGB promoveu a perda de viabilidade do epitélio durante a infecção. As alterações morfológicas em células A549 infectadas com o EGB incluem arredondamento celular, condensação nuclear, encolhimento celular e perda de contato célula-célula e célula-substrato. A dupla marcação AV/IP revelou que amostras de EGB sorotipo III induziram apoptose enquanto amostras do sorotipo V induziram morte celular semelhante a necrose em células A549. Caspase-3 foi ativada durante a apoptose induzida por EGB em células epiteliais. No entanto, a ativação de caspases-8 e -9 foi detectada apenas para a amostra 88641-V e as amostras EGB do sorotipo III, respectivamente. Experimentos comparativos de Immunoblotting revelaram que o EGB induziu um aumento da expressão Bim, uma proteína pró-apoptótica e diminuiu a expressão de Bcl-2 e Bcl-xL, proteínas anti-apoptóticas. As células A549 apresentaram perda de potencial de membrana mitocondrial Δψm e co-localização com o Bax. Ensaio de espectrometria de massa identificou a proteína PI-2a, uma proteína estrutural de pili, que exibe atividade carboxipepdidase. Descobrimos que os dois sorotipos (III e V) induziram a produção ROS e NO em células A549. Em conclusão, a apoptose induzida pelo EGB em células A549 é um mecanismo importante de virulência, resultando na destruição de tecidos, escape do sistema imune do hospedeiro com espalhamento bacteriano e, em consequência, a doença invasiva ou uma infecção sistémica. / Streptococcus agalactiae, or group B Streptococcus (GBS), is an important opportunistic pathogen that causes pneumonia, sepsis, and meningitis in neonates and severe diseases in immunocompromised adults. The lung is the apparent portal of entry for GBS into the bloodstream, after which septicemia may ensue. A relevant virulence mechanism involves the ability of GBS to penetrate and to survive intracellularly within these host cells. In this work, we analyzed the molecular mechanisms of GBS-induced epithelial apoptosis, and nitric oxide (NO) and reactive oxygen species (ROS) production by lung epithelial cell line A549 cells during infection with GBS. All GBS exhibited the ability to adhere and to invade A549 cells. The survival of GBS within A549 cells without replication was shown during 24 h incubation. However, the 88641-V strain isolated from vagina did not survive after 0.5 h of interaction. GBS promoted the loss of viability of the epithelium during infection. The morphological changes in A549 cells infected with GBS included cell rounding, nuclear condensation, cellular shrinkage and loss of cell-cell contact and cell-substrate. The double staining AV / IP revealed that GBS serotype III induced apoptosis while GBS serotype V induced like necrosis cell death in A549 cells. Caspase-3 was activated during GBS-induced endothelial apoptosis. However, activation of caspases-8 and -9 was detected only by GBS 88641-V and GBS-III, respectively. Comparative immunoblotting experiments revealed that GBS induced an increasing pro-apoptotic Bim expression and decreasing anti-apoptotic Bcl-2 and Bcl-XL expression. A549 cells exhibited loss of mitochondrial membrane potential Δψm with Bax colocalization. Mass spectrometry assay identified protein PI-2a, a structural protein pili, which exhibit carboxipepdidase activity. We found that both serotypes (III and V) induced ROS and NO production in A549 cells. In conclusion, apoptosis of A549 cell induced by GBS is an important virulence mechanism resulting in tissue destruction, escape from the host immune system with bacterial spreading and, in consequence, invasive disease or systemic infection.

Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Streptococcus agalactiae, ou Streptococcus do grupo B (GBS), é um importante patógeno oportunista que causa pneumonia, sepse e meningite em recém-nascidos e infecções em adultos imunocomprometidos. O pulmão aparentemente é o portal de entrada para o EGB na corrente sanguínea o que pode evoluir para uma septicemia. Os mecanismos de virulência relevantes envolve a habilidade do EGB em penetrar e sobreviver intracelularmente em células hospedeiras. Neste trabalho, foram analisados os mecanismos moleculares da apoptose epitelial induzida pelo EGB, e a produção de óxido nítrico (NO) e espécies reativas de oxigênio (ROS) em células epiteliais respiratórias A549 durante a infecção por EGB. Todas as amostras de EGB exibiram a capacidade de aderir e invadir células A549. A sobrevivência intracelular do EGB em células A549 ocorreu durante 24 h de incubação sem replicação do patógeno. No entanto, a amsotra 88641-V isolada de vagina não sobreviveu após 0,5 h de interação. O EGB promoveu a perda de viabilidade do epitélio durante a infecção. As alterações morfológicas em células A549 infectadas com o EGB incluem arredondamento celular, condensação nuclear, encolhimento celular e perda de contato célula-célula e célula-substrato. A dupla marcação AV/IP revelou que amostras de EGB sorotipo III induziram apoptose enquanto amostras do sorotipo V induziram morte celular semelhante a necrose em células A549. Caspase-3 foi ativada durante a apoptose induzida por EGB em células epiteliais. No entanto, a ativação de caspases-8 e -9 foi detectada apenas para a amostra 88641-V e as amostras EGB do sorotipo III, respectivamente. Experimentos comparativos de Immunoblotting revelaram que o EGB induziu um aumento da expressão Bim, uma proteína pró-apoptótica e diminuiu a expressão de Bcl-2 e Bcl-xL, proteínas anti-apoptóticas. As células A549 apresentaram perda de potencial de membrana mitocondrial Δψm e co-localização com o Bax. Ensaio de espectrometria de massa identificou a proteína PI-2a, uma proteína estrutural de pili, que exibe atividade carboxipepdidase. Descobrimos que os dois sorotipos (III e V) induziram a produção ROS e NO em células A549. Em conclusão, a apoptose induzida pelo EGB em células A549 é um mecanismo importante de virulência, resultando na destruição de tecidos, escape do sistema imune do hospedeiro com espalhamento bacteriano e, em consequência, a doença invasiva ou uma infecção sistémica. / Streptococcus agalactiae, or group B Streptococcus (GBS), is an important opportunistic pathogen that causes pneumonia, sepsis, and meningitis in neonates and severe diseases in immunocompromised adults. The lung is the apparent portal of entry for GBS into the bloodstream, after which septicemia may ensue. A relevant virulence mechanism involves the ability of GBS to penetrate and to survive intracellularly within these host cells. In this work, we analyzed the molecular mechanisms of GBS-induced epithelial apoptosis, and nitric oxide (NO) and reactive oxygen species (ROS) production by lung epithelial cell line A549 cells during infection with GBS. All GBS exhibited the ability to adhere and to invade A549 cells. The survival of GBS within A549 cells without replication was shown during 24 h incubation. However, the 88641-V strain isolated from vagina did not survive after 0.5 h of interaction. GBS promoted the loss of viability of the epithelium during infection. The morphological changes in A549 cells infected with GBS included cell rounding, nuclear condensation, cellular shrinkage and loss of cell-cell contact and cell-substrate. The double staining AV / IP revealed that GBS serotype III induced apoptosis while GBS serotype V induced like necrosis cell death in A549 cells. Caspase-3 was activated during GBS-induced endothelial apoptosis. However, activation of caspases-8 and -9 was detected only by GBS 88641-V and GBS-III, respectively. Comparative immunoblotting experiments revealed that GBS induced an increasing pro-apoptotic Bim expression and decreasing anti-apoptotic Bcl-2 and Bcl-XL expression. A549 cells exhibited loss of mitochondrial membrane potential Δψm with Bax colocalization. Mass spectrometry assay identified protein PI-2a, a structural protein pili, which exhibit carboxipepdidase activity. We found that both serotypes (III and V) induced ROS and NO production in A549 cells. In conclusion, apoptosis of A549 cell induced by GBS is an important virulence mechanism resulting in tissue destruction, escape from the host immune system with bacterial spreading and, in consequence, invasive disease or systemic infection.

Highly fluorescent conjugated polymers (CPs) are an important class of biomaterials used for various biological applications including labelling, sensing, and delivery of biological substances. Synthetic versatility and tunable emission make CPs a superior class of biomaterials. Understanding the structure-function relationship of CPs plays a vital role in designing high performing biomaterials. The cationic CPs are self-assembled to conjugated polymer nanoparticles (CPNs) in an aqueous environment due to their amphiphilicity. The physical and biophysical properties of CPNs are highly dependent on the chemical functionality and backbone structure of CPs. Modulation of the surface property and backbone structure of CPNs play an important role for efficient internalization of CPNs into cells. The goal of this dissertation is to understand the structure function relationship of CPNs in an aqueous environment and the change in their photo physical properties upon the self-assembly of CPNs with different backbone structure upon complexation with biologically significant polysaccharides and cell membrane. This work presents the self-assembly of a set of four cationic CPs with different connectivity and backbone structure upon complexation with a linear polyanion hyaluronic acid (HA). The study of photo physical properties changes upon the complexation with series of Glycosaminoglycans (GAGs) provides more insight about how the self-assembly behavior of cationic CPs changes upon the exposure to negatively charged polysaccharides. The understanding of the self-assembly of CPNs with negatively charged biologically important macromolecules under in vitro conditions can give us an idea of photophysical property changes of CPNs during the treatment of CPNs in the cellular environment. The study of the interaction of CPNs with cell membranes using scanning ion conductance microscopy (SICM)-based topography, potential mapping, and confocal microscopy imaging is presented. CPNs are able to induce transient pore like feature formation on the cell membrane during the cellular internalization process. A comparative study of cellular labelling and delivery of siRNA of five CPNs with guanidine motif is presented. The subcellular localization and delivery of siRNA were dependent on the side chain hydrophilicity. The CPNs fabricated with hydrophilic aminoethoxyethanol possesses excellent cellular imaging with higher siRNA delivery.