Deficiência intelectual (DI), associada ou não a outras alterações congênitas, é a razão mais frequente de procura por aconselhamento genético pelas famílias. Até alguns anos atrás, a realização de cariótipo, triagem para doenças metabólicas e fra(x) elucidavam apenas ∼40% dos casos de pacientes com DI idiopática. Com o surgimento de arrays genômicos, as causas moleculares por trás de outros ∼20% dos quadros de DI foram elucidadas; porém, mesmo com esse avanço, muitos pacientes ainda permanecem sem causa molecular clara que justifique o fenótipo. O sequenciamento do exoma (WES) é hoje um dos recursos disponíveis para o diagnóstico e possível elucidação das causas genéticas por trás da deficiência intelectual idiopática, abrindo caminho também à identificação de novos genes. O presente trabalho realizou o sequenciamento de exoma de 8 probandos que tinham em comum a deficiência intelectual esporádica, acompanhada ou não de outros sinais clínicos, e de seus genitores não afetados (trios). Esses pacientes foram previamente triados para a síndrome do X frágil, e submetidos a exame de array CGH para investigação de perdas e ganhos de segmentos cromossômicos, ambos com resultados negativos. O objetivo desse estudo foi detectar alterações e possivelmente novos genes associados com a DI, usando pipelines de padrões de herança mendeliano. Treze alterações em 9 genes foram detectadas por sequenciamento de exoma e confirmadas por sequenciamento Sanger: 8 mutações bialélicas em genes recessivos (TBC1D24, ADAMTSL2, NALCN, VPS13B), uma ligada ao X (MID1), e 4 alterações de novo (RYR2, GABBR2, CDK13, DDX3X); 5 dessas alterações ainda não haviam sido descritas nos bancos de dados consultados, caracterizando mutações novas. Dos 8 trios, em 5 identificamos alterações moleculares provavelmente responsáveis pelos quadros apresentados; dois desses casos foram em genes recessivos (mutações homozigotas ou em heterozigose composta) e potencialmente teriam sido detectados mesmo se apenas os probandos houvessem sido sequenciados. Para as alterações em heterozigose, porém, a avaliação dos genitores e constatação de status de novo da mutação foram importantes para avaliar o impacto da variante. Esse trabalho resultou em uma taxa de diagnóstico de 62,5%; mesmo considerando o pequeno tamanho da amostra, esse valor está bem acima dos 15-30% relatados na literatura quando essa metodologia é utilizada para o estudo de casos esporádicos de DI. Em dois casos, mutações foram identificadas em genes que só foram descritos como mutados recentemente e que ainda não são considerados genes de deficiência intelectual no OMIM: o gene CDK13 foi descrito como mutado em pacientes de uma única coorte com malformação cardíaca congênita (sindrômica ou não), porém sua contribuição para coortes de DI ainda não foi investigada. O gene GABBR2, identificado mutado em heterozigose em um dos nossos pacientes, já havia sido considerado um candidato potencial para DI, mas apenas 2 trabalhos detectaram mutações nesse gene entre pacientes com DI e epilepsia. Os resultados aqui apresentados substanciam o papel desses genes como implicados na DI sindrômica de herança autossômica dominante, e devem contribuir para serem considerados genes OMIM de deficiência intelectual / Intellectual disability (ID), associated or not with other congenital abnormalities, is the most frequent reason for families to seek genetic counseling. Until some years ago, karyotyping, metabolic disease and FRAXA screening elucidated only ∼40% of patients with idiopathic ID. Importantly, with the introduction of genomic arrays, the molecular cause behind a further ∼20% of ID cases was determined; however, despite this improvement, many patients are still not provided with a clear molecular explanation and cause for their phenotype. Nowadays, whole exome sequencing (WES) is one of the methods available for diagnosis and a further means of possible elucidation of the genetic causes of idiopathic intellectual disability; in many cases this method also allows identification of genes that have not been previously related to ID. In the present project, we sequenced the exome (WES) of 8 sporadic patients that all had ID, with or without other clinical signs, and their unaffected parents (trios); these patients had been previously screened for fragile X syndrome and for losses and gains of chromosomal segments by array CGH, both with negative results. The objective of this study was to detect mutations and possibly new genes associated with ID, using pipelines for Mendelian inheritance patterns. Thirteen mutations in 9candidate genes were detected by exome sequencing and confirmed by Sanger sequencing, among them 8 biallelic mutations in autossomal recessive genes (TBC1D24, ADAMTSL2, NALCN, VPS13B), one mutation in an X-linked gene (MID1), and 4 de novo alterations (RYR2, GABBR2, CDK13, DDX3X); 5 of these mutations had not been described in the databases consulted characterizing new variants. Of the 8 trios, we obtained a probable diagnosis of the molecular alteration responsible for the presented phenotypes in 5. Two of these cases were in recessive genes (homozygous mutations or compound heterozygous), and the mutations would probably have been detected even if only the probands had been sequenced. However, for the heterozygous mutations, the assessment of the parents and the confirmation of the de novo status of the mutation was important to evaluate the impact of the variant. This work resulted in a diagnosis rate of 62.5%; even considering the small sample size, this value is well above the average of 15-30% reported in the literature when the methodology used for the study of ID sporadic cases is considered. In two cases, mutations were detected in genes only recently described as mutated and which are not considered yet as OMIM ID genes. The CDK13 gene had already been described as mutated in a single cohort of patients with syndromic congenital heart defects, but its contribution to ID cohorts has not been established. The GABBR2 gene, where a heterozygous mutation was identified in the patient, had already been considered a potential candidate for ID; there are only 2 studies that detected mutations in this gene among patients with ID and epilepsy. This contribution may pave the way to establishing GABBR2 and CDK13 as causations of ID and acceptance by OMIM

Deficiência intelectual (DI) é um distúrbio frequente do neurodesenvolvimento que afeta ~1% da população mundial e a causa genética é desconhecida em grande parte dos casos. O sequenciamento de exoma é uma ferramenta valiosa na elucidação da etiologia da DI e foi utilizada neste trabalho para investigar 25 famílias com dois ou mais indivíduos afetados. Nosso objetivo foi identificar novos genes ou variantes em genes já conhecidos que pudessem explicar a DI nessas famílias. Identificamos variantes que podem explicar a DI em nove das 25 famílias (36%); três variantes em genes já associados a DI de herança autossômica dominante (SETBP1, MED13L e MBD5), duas em um gene já associado a DI de herança autossômica recessiva (CDK5RAP2 - heterozigose composta) e cinco em genes de herança ligada ao X (UBE2A, MED12, SCL6A8, ARHGAP4 e PHF6). Nenhuma dessas variantes havia sido previamente descrita. O gene ARHGAP4 aparece como um novo candidato e novos estudos serão necessários para estabelecer seu papel na DI. No gene PHF6, a variante identificada mapeia na região 3´UTR e potencialmente interfere com as interações de miRNA reguladores. A variante no gene SETBP1, que apresenta padrão de herança dominante, foi detectada em duas irmãs, indicando que um genitor seria portador obrigatório; essa variante foi detectada em 0,13% das células de sangue periférico da mãe com a utilização da técnica de PCR digital. Essa variante em SETBP1, juntamente com as variantes em MED13L e no gene MBD5, salientam a contribuição de mosaicismo gonadal assim como genitor também com quadro clínico na DI de herança autossômica dominante. A repetição da DI nas irmandades foi essencial para determinar a patogenicidade das variantes identificadas do tipo missense. Dois irmãos portadores de variante missense ainda não descrita no gene UBE2A apresentavam quadro clínico atipicamente leve, trazendo dúvidas sobre a patogenicidade dessa variante; o estudo funcional do gene demonstrou que a mutação de fato prejudicava a função da proteína. Embora estudos funcionais sejam o padrão-ouro para determinar a patogenicidade de uma variante, é difícil sua implementação na rotina diagnóstica / Intellectual deficiency (ID) is a common neurodevelopmental disorder affecting ~1% of the world population, and in which the genetic underlying condition is not determined in many cases. Whole exome sequencing is a valuable tool to elucidate ID etiology and was used in the present work to investigate 25 families with two or more affected individuals. Our main goal was to identify either new genes or variants in already known genes that might explain ID in these families. We detected variants in nine out of the 25 families (36%), with three variants in autossomal dominant ID genes (SETBP1, MED13L e MBD5), two in an autossomal recessive ID gene (compound heterozygote - CDK5RAP2) and five in X-linked ID genes (UBE2A, MED12, SCL6A8, ARHGAP4 e PHF6). None of the variants had been previously described. ARHGAP4 emerged as a new candidate gene and further studies are needed to establish its role in ID. In PHF6, the identified variant mapped to the 3\'UTR region and potentially interferes with miRNA interactions. The variant in SETBP1, which segregates as an autossomal dominant, is present in two sisters, indicating that one parent is an obligate carrier; in fact, the variant was only identified in 0.13% of the mother\'s blood cells after using digital PCR. This case, together with the variants in MED13L and MBD5, highlight the contribution of gonadal mosaicism and affected parent in the autossomal dominant ID. The ID reccurrence in the sibships was essential to determine the putative pathogenicity of missense variants. Two affected brothers carrying a novel missense variant in UBE2A exhibited an atypically mild phenotype, and raised questions regarding the pathogenicity of this variant; associated functional studies showed that the variant impairs gene function. Although functional studies are the gold standard to determine a variant pathogenicity, its implementation as a diagnostic routine is still difficult

Submitted by Leonardo Cavalcante (leo.ocavalcante@gmail.com) on 2018-04-23T22:50:06Z No. of bitstreams: 1 Arquivototal.pdf: 7015058 bytes, checksum: 0d8c1dd0bc2f42ab36a2d917f1dc6a05 (MD5) / Made available in DSpace on 2018-04-23T22:50:06Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Arquivototal.pdf: 7015058 bytes, checksum: 0d8c1dd0bc2f42ab36a2d917f1dc6a05 (MD5) Previous issue date: 2015-07-06 / A part of the populations in Northeastern Brazil are relatively isolated geographically and these populations maintain the tradition of consanguineous marriages for generations. These two factors (isolation and inbreeding) increase the risk of birth of people with autosomal recessive intellectual disabilities. The objective of this study was to determine the genetic causes of intellectual disabilities in two large consanguineous families of Paraiba backlands. In 2012, we conducted an epidemiological study to investigate the contribution of genetic factors in determining the deficiencies in six municipalities of Paraíba previously selected by presenting high consanguinity rate. Families who had patients with neurodegenerative disorders and/or intellectual disabilities (ID) were invited by community health agents for a first screening realized by biologists in order to select patients with deficiency probably caused by genetic mutations. In total, 276 patients were screened, of which, 109 were selected for medical evaluation with neurologists. After medical evaluation, two families with multiple affected individuals in two different forms of autosomal recessive intellectual disability were selected for clinical and genetic research. We performed the linkage study using SNPs array analysis to determine homozygous regions. Subsequently, the whole exome sequencing (WES) of one affected individual of each family was sequenciated. Potentially deleterious variants detected in regions of homozigosity-by descent which were not present in Brazilian population controls or in exomes of global online databases were subject to further scrutiny and segregation analysis by Sanger sequencing. Family A has seven adult siblings with syndromic ID. Phenotype includes tall forehead, prognatism, prominent chin, very large and overhanging nose tip. Homozigosity-by-descent analysis found a 4.0 Mb region in 19q13.32-q13.33 (lod score: 3.24). WES disclosed a homozygous variant (c.418C>T, p.Arg140Trp) in mediator complex subunit 25 (MED25), predicted as deleterious by Provean, Mutation Taster, PolyPhen-2 and SIFT. MED25 is a component of the Mediator complex, involved in regulation of transcription of nearly all RNA polymerase II-dependent genes. Deleterious mutations in MED12, MED17, MED23 and recently after our publication another mutation in the MED25 have been associated with ID. Family B has nine affected adults descending from four closely related first-cousin couples affected by severe non-syndromic ID. Homozigosity-by-descent analysis disclosed a 20.7 Mb region in 8q12.3-q21.2 (lod score: 3.11). WES identified a homozygous deleterious variant in inositol monophosphatase1 gene (IMPA1), consisting of a 5 bp duplication (c.489_493dupGGGCT) leading to frameshift (p.Ser165Trpfs*10). IMPA1 gene product is responsible for the final step of biotransformation of inositol triphosphate and diacylglycerol, two second messengers, and up to now, despite its many physiological functions, no clinical phenotype has been assigned to this gene dysfunction. From this study, it was possible to develop diagnostic test by restriction enzyme and therapeutic perspective for cases associated with IMPA1. / Uma parte das populações do Nordeste brasileiro está relativamente isolada geograficamente e mantêm, há várias gerações, a tradição de casamentos consanguíneos. Esses dois fatores associados (isolamento e endocruzamento) elevam o risco de nascimento de pessoas com deficiência intelectual com herança genética autossômica recessiva. O objetivo deste trabalho foi determinar as causas genéticas da deficiência intelectual em duas grandes famílias consanguíneas do sertão paraibano. Em 2012, nosso grupo de pesquisa realizou um estudo epidemiológico para determinar a contribuição de fatores genéticos na determinação das deficiências em seis municípios do sertão paraibano selecionados previamente por apresentarem elevada taxa de consanguinidade. As famílias que apresentavam repetições de indivíduos com doenças neurodegenerativas e/ou deficiência intelectual (DI) foram convocadas pelos agentes comunitários de saúde para uma primeira triagem, realizada pelos biólogos geneticistas, a fim de selecionar pacientes que apresentavam deficiência por prováveis causas genéticas. No total, foram triados 276 pacientes, sendo que, 109 foram selecionados para avaliação médica com neurologistas. Após a avaliação médica, duas famílias com múltiplos indivíduos acometidos por duas diferentes formas de DI de herança autossômica recessiva foram selecionadas para investigação clínico-genética. O estudo de ligação para determinar regiões em homozigose foi realizado com o uso da técnica de array de SNPs. Posteriormente, foi feito o sequenciamento do exoma completo de um indivíduo afetado de cada família. Variantes potencialmente deletérias detectadas em regiões em homozigose e que não estavam presentes em controles brasileiros e em banco de dados mundiais, foram objetos de uma análise mais aprofundada e feito a análise de co-segregação através do sequenciamento de Sanger. A primeira família estudada, a família A, possui sete adultos com DI sindrômica. O fenótipo inclui testa alta, prognatismo, queixo proeminente e ponta do nariz saliente, além da DI grave. O estudo de ligação apontou duas regiões com LOD scores máximos = 3,234, uma região de 26 Mb no cromossomo 2 (2p12 - q11.2) e uma região de 4,0 Mb no cromossomo 19 (19q13.32 - q13.33). O sequenciamento do exoma revelou uma variante em homozigose (c.418C>T, p.Arg140Trp) no gene MED25 (subunidade 25 do complexo mediador), predita como deletéria por diferentes softwares (Polyphen, Provean, Mutation Taster e SIFT). O complexo mediador está envolvido na regulação da transcrição de quase todos os genes dependentes da RNA polimerase II. Mutações deletérias nos genes MED12, MED17, MED23 e, recentemente, outra mutação no MED25, têm sido associadas com DI. Já a segunda família estudada, a família B, possui nove adultos afetados, descendentes de quatro relações consanguíneas entre primos de primeiro grau, com DI grave não-sindrômica. O estudo de ligação apontou uma região de 20,7 Mb no cromossomo 8 (8q12.3-q21.2) com LOD score = 3,11. O sequenciamento do exoma identificou uma variante deletéria em homozigose no gene inositol monofosfatase1 (IMPA1), que consiste em uma duplicação de 5 pares de bases (c.489_483dupGGGCT), levando a uma mutação do tipo frameshift (p.Ser165Trpfs*10). O produto do gene IMPA1 é uma enzima responsável pela etapa final da biotransformação dos segundos mensageiros inositol trifosfato e diacilglicerol, e até o momento, apesar de apresentar importantes funções fisiológicas, não havia fenótipo clínico atribuído a esse gene. A partir deste estudo, foi possível desenvolver teste diagnóstico com triagem por enzima de restrição e perspectiva de tratamento terapêutico para os casos associados ao IMPA1.

Deficiência intelectual (DI), associada ou não a outras alterações congênitas, é a razão mais frequente de procura por aconselhamento genético pelas famílias. Até alguns anos atrás, a realização de cariótipo, triagem para doenças metabólicas e fra(x) elucidavam apenas ∼40% dos casos de pacientes com DI idiopática. Com o surgimento de arrays genômicos, as causas moleculares por trás de outros ∼20% dos quadros de DI foram elucidadas; porém, mesmo com esse avanço, muitos pacientes ainda permanecem sem causa molecular clara que justifique o fenótipo. O sequenciamento do exoma (WES) é hoje um dos recursos disponíveis para o diagnóstico e possível elucidação das causas genéticas por trás da deficiência intelectual idiopática, abrindo caminho também à identificação de novos genes. O presente trabalho realizou o sequenciamento de exoma de 8 probandos que tinham em comum a deficiência intelectual esporádica, acompanhada ou não de outros sinais clínicos, e de seus genitores não afetados (trios). Esses pacientes foram previamente triados para a síndrome do X frágil, e submetidos a exame de array CGH para investigação de perdas e ganhos de segmentos cromossômicos, ambos com resultados negativos. O objetivo desse estudo foi detectar alterações e possivelmente novos genes associados com a DI, usando pipelines de padrões de herança mendeliano. Treze alterações em 9 genes foram detectadas por sequenciamento de exoma e confirmadas por sequenciamento Sanger: 8 mutações bialélicas em genes recessivos (TBC1D24, ADAMTSL2, NALCN, VPS13B), uma ligada ao X (MID1), e 4 alterações de novo (RYR2, GABBR2, CDK13, DDX3X); 5 dessas alterações ainda não haviam sido descritas nos bancos de dados consultados, caracterizando mutações novas. Dos 8 trios, em 5 identificamos alterações moleculares provavelmente responsáveis pelos quadros apresentados; dois desses casos foram em genes recessivos (mutações homozigotas ou em heterozigose composta) e potencialmente teriam sido detectados mesmo se apenas os probandos houvessem sido sequenciados. Para as alterações em heterozigose, porém, a avaliação dos genitores e constatação de status de novo da mutação foram importantes para avaliar o impacto da variante. Esse trabalho resultou em uma taxa de diagnóstico de 62,5%; mesmo considerando o pequeno tamanho da amostra, esse valor está bem acima dos 15-30% relatados na literatura quando essa metodologia é utilizada para o estudo de casos esporádicos de DI. Em dois casos, mutações foram identificadas em genes que só foram descritos como mutados recentemente e que ainda não são considerados genes de deficiência intelectual no OMIM: o gene CDK13 foi descrito como mutado em pacientes de uma única coorte com malformação cardíaca congênita (sindrômica ou não), porém sua contribuição para coortes de DI ainda não foi investigada. O gene GABBR2, identificado mutado em heterozigose em um dos nossos pacientes, já havia sido considerado um candidato potencial para DI, mas apenas 2 trabalhos detectaram mutações nesse gene entre pacientes com DI e epilepsia. Os resultados aqui apresentados substanciam o papel desses genes como implicados na DI sindrômica de herança autossômica dominante, e devem contribuir para serem considerados genes OMIM de deficiência intelectual / Intellectual disability (ID), associated or not with other congenital abnormalities, is the most frequent reason for families to seek genetic counseling. Until some years ago, karyotyping, metabolic disease and FRAXA screening elucidated only ∼40% of patients with idiopathic ID. Importantly, with the introduction of genomic arrays, the molecular cause behind a further ∼20% of ID cases was determined; however, despite this improvement, many patients are still not provided with a clear molecular explanation and cause for their phenotype. Nowadays, whole exome sequencing (WES) is one of the methods available for diagnosis and a further means of possible elucidation of the genetic causes of idiopathic intellectual disability; in many cases this method also allows identification of genes that have not been previously related to ID. In the present project, we sequenced the exome (WES) of 8 sporadic patients that all had ID, with or without other clinical signs, and their unaffected parents (trios); these patients had been previously screened for fragile X syndrome and for losses and gains of chromosomal segments by array CGH, both with negative results. The objective of this study was to detect mutations and possibly new genes associated with ID, using pipelines for Mendelian inheritance patterns. Thirteen mutations in 9candidate genes were detected by exome sequencing and confirmed by Sanger sequencing, among them 8 biallelic mutations in autossomal recessive genes (TBC1D24, ADAMTSL2, NALCN, VPS13B), one mutation in an X-linked gene (MID1), and 4 de novo alterations (RYR2, GABBR2, CDK13, DDX3X); 5 of these mutations had not been described in the databases consulted characterizing new variants. Of the 8 trios, we obtained a probable diagnosis of the molecular alteration responsible for the presented phenotypes in 5. Two of these cases were in recessive genes (homozygous mutations or compound heterozygous), and the mutations would probably have been detected even if only the probands had been sequenced. However, for the heterozygous mutations, the assessment of the parents and the confirmation of the de novo status of the mutation was important to evaluate the impact of the variant. This work resulted in a diagnosis rate of 62.5%; even considering the small sample size, this value is well above the average of 15-30% reported in the literature when the methodology used for the study of ID sporadic cases is considered. In two cases, mutations were detected in genes only recently described as mutated and which are not considered yet as OMIM ID genes. The CDK13 gene had already been described as mutated in a single cohort of patients with syndromic congenital heart defects, but its contribution to ID cohorts has not been established. The GABBR2 gene, where a heterozygous mutation was identified in the patient, had already been considered a potential candidate for ID; there are only 2 studies that detected mutations in this gene among patients with ID and epilepsy. This contribution may pave the way to establishing GABBR2 and CDK13 as causations of ID and acceptance by OMIM

As neuropatias periféricas hereditárias são um grupo heterogêneo de doenças relacionadas que afetam o sistema nervoso periférico. Elas podem ser classificadas de acordo com a velocidade de condução motora nos membros superiores (tipo 1 - CMT1, tipo 2 - CMT2 ou intermediário - iCMT), de acordo com o padrão de herança (autossômicas dominantes, autossômicas recessivas ou ligadas ao X) e quanto ao fenótipo de apresentação (neuropatias hereditária sensitivo e motora - CMT, neuropatia hereditária sensitiva - HSN ou neuropatia motora hereditária distal - dHMN). O uso das tecnologias de sequenciamento de nova geração (NGS) para diagnóstico de pacientes com neuropatia hereditária é particularmente eficiente uma vez que representa uma doença Mendeliana com mais de 90 genes diferentes relacionados. Foram avaliados 30 pacientes com diferentes subtipos de neuropatia hereditária (3 CMT1, 12 CMT2, 8 iCMT, 4 dHMN e 3 HSN). Foram identificadas 6 mutações (SH3TC2, GDAP1, MME, IGHMBP2, 2 AARS) e 7 variantes provavelmente patogênicas (KIF1A, DRP2, MME, MPZ, VRK1, SIGMAR1, FLVCR1). Com uma taxa de positividade de 43.3%. As variantes provavelmente patogênicas foram consideradas como a causa da apresentação fenotípica apresentada pelos pacientes baseado na frequência de variantes nos bancos de população normal, no efeito bioquímico das variantes sobre a estrutura proteica e pela análise in silico. No entanto, essas variantes necessitam de evidências adicionais que confirmem sua patogenicidade. Foram identificadas variantes novas nos genes MPZ, KIF1A, DRP2, IGHMBP2, VRK1, SIGMAR1 e FLVCR1 ampliando a variabilidade genotípica desses genes. A associação das mutações identificadas nos genes VRK1, KIF1A, IGHMBP2 e FLVRC1 permitiu a expansão dos fenótipos relacionados a esses genes. Mutações no gene VRK1 podem causar uma dHMN com sinais de liberação piramidal e envolviemento preferencial do compartimento posterior da perna. Transtorno do espectro autista pode ser observado em associação a mutações no gene KIF1A e mutações no gene FLVRC1 podem causar um fenótipo grave caracterizado por insensibilidade congénita a dor e acromutilações. Mutações no gene IGHMBP2 podem causar uma sobreposição entre os fenótipos SMARD1/CMT2S com disautonomia restrita ao trato gastro intestinal. Esse estudo demonstra que o uso de WES para o diagnóstico molecular de doenças geneticamente heterogêneas como as neuropatias hereditárias é uma ferramenta útil. / The hereditary peripheral neuropathies are a heterogeneous group of genetic disorders in which peripheral nervous system degeneration leads to weakness, atrophy and loss of sensation. It can be classified according motor conduction velocities in the upper limbs (type 1 - CMT1, type 2 - CMT2 or intermediate - iCMT), according to inheritance pattern (autosomal dominant, autosomal recessive or X linked) and according to the mainly group of fibres clinically involved (hereditary sensory and motor neuropathy - CMT, hereditary sensory neuropathy - HSN or distal hereditary motor neuropathy - dHMN). The use of next generation sequencing technologies (NGS) for the diagnosis of patients with genetic diseases is well established, as CMT is a Mendelian disease with more than 90 different related genes already reported. We evaluated 30 patients with all subtypes of hereditary neuropathy (3 CMT1, 12 CMT2, 8 iCMT, 4 dHMN and 3 HSN). Six mutations (SH3TC2, GDAP1, MME, IGHMBP2, 2 AARS) and 7 likely pathogenic variants (KIF1A, DRP2, MME, MPZ, VRK1, SIGMAR1, FLVCR1) were detected, leading to a positive rate of 43.3%. Likely pathogenic variants were considered based on their frequency in normal population, in silico analysis and segregation with phenotype. Despite they have strong evidences to support their causative status further evidence of their pathogenicity is required. New variants were identified in the genes MPZ, KIF1A, DRP2, IGHMBP2, VRK1, SIGMAR1 and FLVCR1 amplifying their genotypic variability. The mutations identified in VRK1, KIF1A, IGHMBP2 and FLVRC1 expanded their phenotype spectrum. Mutations in the VRK1 gene may cause dHMN with upper motor neuron signs. Autistic spectrum disorder may be observed in association with mutations in the KIF1A gene and mutations in the FLVRC1 gene may cause a severe phenotype characterized by congenital insensitivity to pain and acromutilations. Mutations in the IGHMBP2 gene may cause an overlap between SMARD1 and CMT2S phenotypes with organ specific dysautonomia. This study demonstrates that WES is a powerful tool for molecular diagnosis of hereditary neuropathies. Additionally, this study provides new information on the mutations in the VRK1, KIF1A and FLVRC1 genes by adding new mutations and increasing the phenotypic variability of the neuropathies associated with these genes.This study demonstrates WES is a powerful tool for molecular diagnosis of hereditary neuropathies.

A Síndrome Ablefaria Macrostomia (SAM) é uma condição rara, onde os pacientes apresentam características clínicas marcantes como o encurtamento ou ausência das pálpebras superiores e inferiores, ausência de sobrancelhas e cílios, macrostomia por defeitos na fusão dos lábios, entre outros. O padrão de herança da síndrome não está elucidado, tendo a herança autossômica dominante com expressividade variável sido sugerida. SAM possui sobreposição fenotípica com a Síndrome de Barber-Say e com a Síndrome de Fraser, porém nenhum gene já descrito apresentou mutação nos pacientes portadores da SAM. A abordagem genômica no estudo de doenças raras tem sido amplamente utilizada, devido principalmente ao surgimento da Nova Geração de Sequenciamento, que possui alto poder de descriminar as seqüencias nucleotídicas com grande cobertura, em um curto período de tempo. No presente estudo o sequenciamento completo do exoma foi realizado, com cinco indivíduos de uma mesma família, três membros afetados e dois não, e permitiu a análise das regiões codificantes nestes indivíduos. A base molecular da Síndrome Ablefaria Macrostomia é aqui sugerida como autossômica dominante, e decorrente da mutação nova não sinônima c.223G>A (p.E75K) no gene TWIST2. Essa mutação patogênica ocasiona a troca de um aminoácido pequeno de carga negativa, o ácido glutâmico, para um aminoácido de cadeia maior carregado positivamente, a lisina. A modelagem in silico da proteína Twist2 mostrou que a estrutura geral tridimensional da proteína não foi alterada, mas a troca do aminoácido ocorre na posição 75 dentro do domínio básico HLH, e pode impedir a formação de dímeros, ou a própria ligação ao DNA. Sugere-se ainda que a heterogeneidade de fenótipos associados a mutações no gene TWIST2, pode ser atribuída às interações que essa proteína é capaz de formar, e a ampla ação regulatória que ela desempenha em diversos genes do desenvolvimento. / Ablepharon-Macrostomia Syndrome (AMS) is a rare condition characterised by absent or hypoplastic eyelids, absent eyebrows and eyelashes, macrostomia caused by fusion defects of the mouth with unfused lateral commissures, as well as other clinical features. The inheritance pattern has not been confirmed and while autosomal dominant inheritance with variable expressivity has been suggested, recessive inheritance has not been ruled out. The phenotype of AMS overlaps that of Barber-Say and Fraser Syndrome, but any reported gene for these syndromes is mutated on AMS patients. The genomic approach for rare disease studies has been widely used mainly due to the emergence of Next Generation Sequencing, which is very effective at determining nucleotide sequences with large coverage in a short period of time. The whole exome sequencing of five family members was undertaken, with three affected and two unaffected, and the coding regions of the individuals were subsequently analysed. The molecular basis of AMS is suggested here as autosomal dominant, and due to a novel non-synonymous mutation c.223G>A (p.E75K), in TWIST2 gene. This pathogenic mutation causes glutamic acid, a small negatively charged amino acid, to be substituted for a larger and positively charged lysine. The in silico protein modeling of Twist2 shows that the general 3D-structure of the protein is not affected, but the amino acid change is located inside the basic Helix-Loop-Helix domain which could disrupt dimerization and DNA binding. It has also been suggested that the phenotype heterogeneity associated with mutations on TWIST2 gene can be attributed to the interactions that this protein is capable of, and the role that it plays in the regulation of several developmental genes.

Submitted by Caroline Xavier (caroline.xavier@pucrs.br) on 2017-05-04T17:15:51Z No. of bitstreams: 1 TES_HENRIQUE_VIEIRA_FIGUEIRO_COMPLETO.pdf: 4680551 bytes, checksum: 8695b78fe6812f4690586975941c4c31 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-05-04T17:15:51Z (GMT). No. of bitstreams: 1 TES_HENRIQUE_VIEIRA_FIGUEIRO_COMPLETO.pdf: 4680551 bytes, checksum: 8695b78fe6812f4690586975941c4c31 (MD5) Previous issue date: 2016-03-11 / Coordena??o de Aperfei?oamento de Pessoal de N?vel Superior - CAPES / Conselho Nacional de Pesquisa e Desenvolvimento Cient?fico e Tecnol?gico - CNPq / In the past 10 years, high throughput sequencing has revolutionized evolutionary biology. With the technical advances that emerged with the genome sequencing of model species, it is now possible to apply these techniques to taxonomic groups without any previously available genetic resources. Complete genome sequencing and reduced representation methods have enabled us to explore deeper evolutionary questions, such as detecting ancient hybridization and signatures of selection on a genomic scale. Among the groups that could benefit from these methods is the Panthera genus. The group is composed by five species (P. onca, P. tigris, P. leo, P. pardus and P. uncia), all of which are large felids that exert important ecological role as apex predators in their habitats. Their low densities, alarming rates of habitat loss and chronic conflict with humans, all of them are threatened with extinction in the wild and thus important targets for conservation. One of the species in this group, the jaguar (P. onca), is the only member of the genus currently present in the Neotropical region, and the focus of our study. The jaguar has a color pattern similar to that of the leopard, but a much more robust constitution, with massive jaws and shorter limbs. The present study aims to characterize for the first time the jaguar genome, and to perform comparative analyses with the genomes from all other Panthera species. In addition, we seek to perform population genomic analyses with Brazilian jaguar populations and search for signatures of divergent selection in different regions. We have sequenced four genomic libraries, with an estimated coverage depth of 84x. The complete genome sequence allowed the annotation of 25,441 genes and the description of other genomic features (e.g. ncRNA, microsatellites, numts). Additionally, we have sequenced the genome of a leopard at low coverage, with an estimated depth of 25x. With the addition of these two genomes, we were able obtain a genomic data set containing all five Panthera species, which was used to perform phylogenetic discordance analyses and to detect signatures of selection using a dataset encompassing 13,143 orthologous genes. We were able to demonstrate the presence of hybridization events during the speciation process of the species, as well as signatures of selection in genes potentially involved in important characteristics of these iconic animals. Among them, the jaguar?s robust build, the social behavior of lions, cold environment adaptations in the snow leopard and the tiger?s stripes. Using an exome capture approach, we performed a population genomics study targeting jaguar populations from different Brazilian biomes. In addition to assessments of genetic diversity and population structure, we detected signals of local adaptation using multiple methods. Among the obtained results is the presence of genes under selection that are related to energetic metabolism in the Amazon, body development in the Pantanal and immunity in the Atlantic Forest. Additionally, we observed several pigmentation-related genes under selection in different biomes. Those genes affect not only pigmentation, but also have pleiotropic effects in development and immunity routes. Overall, these results help to understand the evolutionary processes that have shaped the adaptation of Panthera species, and particularly the jaguar, to the environments where they currently live. / Nos ?ltimos 10 anos, o sequenciamento gen?mico de alto desempenho revolucionou a biologia evolutiva. Com os avan?os gerados pelo sequenciamento do genoma completo de esp?cies modelo, agora ? poss?vel aplicar essas t?cnicas em animais com praticamente nenhum recurso gen?tico dispon?vel. O sequenciamento completo de genomas, bem como o uso de t?cnicas de representa??o reduzida, permitem explorar quest?es evolutivas complexas como, por exemplo, detec??o de hibrida??o e assinaturas de sele??o natural em uma escala gen?mica. Dentre os grupos taxon?micos que podem se beneficiar de tais t?cnicas est? o g?nero Panthera. O grupo ? composto por cinco esp?cies atuais (P. onca, P. tigris, P. leo, P. pardus e P. uncia), todas elas apresentando grande porte e atuando como predadores de topo nos ambientes que ocupam. Devido ?s baixas densidades, alarmante perda de habitat e constantes conflitos com humanos, o n?vel de amea?a em que essas esp?cies se encontram ? preocupante. Dentre as esp?cies do grupo, est? a on?a-pintada (P. onca), ?nica integrante do g?nero na regi?o Neotropical e o principal foco deste trabalho. Nesse sentido, o presente estudo busca caracterizar pela primeira vez o genoma da on?a-pintada, incluindo an?lises comparativas com as outras quatro esp?cies do g?nero. Al?m disso, o trabalho tem como objetivo avaliar as popula??es de on?a no Brasil e buscar assinaturas de sele??o divergente nos biomas que ela ocupa. Para o sequenciamento do genoma da esp?cie, foram utilizadas quatro bibliotecas gen?micas, com uma cobertura estimada de 84x. A sequ?ncia do genoma completo permitiu a anota??o de 25.441 genes e a descri??o de outros componentes do genoma (p.ex. ncRNA, microssat?lites, numts). Adicionalmente, foi sequenciado o genoma de um leopardo (P. pardus) com cobertura estimada de 25x. Com esses dois novos genomas, completou-se um conjunto abrangendo todas as cinco esp?cies do g?nero, permitindo a realiza??o de an?lises de discord?ncia filogen?tica para o grupo e detec??o de sele??o positiva utilizando um conjunto de 13.143 genes ort?logos. Foi poss?vel demonstrar eventos de hibrida??o durante o processo de especia??o das esp?cies do g?nero, bem como sinais de sele??o positiva em genes envolvidos em caracter?sticas que se destacam nos grandes fel?deos. Entre eles, fen?tipos potencialmente afetados por genes sob sele??o incluem o cr?nio e membros robustos da on?a-pintada, o comportamento social no le?o, adapta??o ao frio no leopardo das neves e a presen?a de listras no tigre. Com o uso de captura de exoma, que tem como objetivo o sequenciamento do conjunto de exons da esp?cie, foi poss?vel realizar uma nova avalia??o das caracter?sticas gen?ticas de popula??es de on?a-pintada, bem como a detec??o de assinaturas de adapta??o local. Entre os resultados obtidos est? a presen?a de genes sob sele??o relacionados com metabolismo energ?tico em popula??es da Amaz?nia, adapta??es relacionadas com desenvolvimento corporal no Pantanal e imunidade na Mata Atl?ntica. Adicionalmente, foram observados diversos genes de pigmenta??o com assinaturas de sele??o em diferentes biomas. Esses genes, al?m de afetarem a colora??o dos animais, possuem efeitos pleiotr?picos no desenvolvimento e imunidade da esp?cie. Esses resultados auxiliam no entendimento dos processos evolutivos que moldaram a adapta??o das esp?cies do g?nero, e em especial a on?a pintada, aos ambientes que elas ocupam atualmente.

Autism spectrum disorder (ASD) is a neurodevelopment disorder characterized by impairment in communication skills, behavior and social interactions that affects around 1-2% worldwide. To date the etiology of ASD has not yet been fully understood, but in the last 18 years many advances have been made to understand the genetic component related to the development of the clinical phenotype. With the advent of genomic scan analysis such as chromosome analysis by microarray and whole exome sequencing (WHE) many advances have been made to understand the pathophysiology of the disease. About 10-15% of the cases can be explained by large losses or gains (deletions or duplications greater than 1000 base pairs) of the genetic material, which generally involve the disruption of one or more genes. Next generation sequencing methodologies were fundamental in the description of point mutations and small insertions and deletions associated with ASD. The WES has allowed many discoveries to be made about new candidate genes and mechanisms for the development of the disease. It is now claimed that de novo (non-inherited) and likely gene disruptive mutations, such as loss-of-function and non-synonymous changes with high prediction of damage by computational tools, in genes related to neurodevelopment are a major contributor to the disease mechanism. However, these mutations, in addition to not explaining the majority of cases, are rarely recurrent in the population, which makes it difficult to establish a definitive molecular diagnosis for most patients. WES is already a practice in clinical genetics laboratories and demonstrates high effectiveness for diseases that follow a Mendelian pattern of inheritance, and have an established genetic cause. In clinical practice WES is requested for cases of ASD, despite having different modes of inheritance and having more than 1,000 genes associated with the disease. Due to these characteristics the analysis of WES for ASD is a major challenge for the clinical laboratory. This study proposes the construction of a computerized WES analysis routine that can test different candidate genes for their sensitivity and specificity for the detection of affected individuals. The proposed approach consists in the counting of variants separated by their possible protein damage and population frequency for each individual from affected and control groups, this study analyzed 168 WES, being 49 with ASD and 119 controls. After counting formulation, these values are subjected to a sequence of statistical tests, seeking a significant difference in the amount of mutations of all the variants alone, loss-of-function or damaging missense mutations, and the application of models of multivariate analysis such as: logistic regression, decision tree, neural network, vector support machine and principal component analysis for the elaboration of more complex models for disease development. A total of 21 lists of genes were tested, of which 19 presented at least one significant result, and the analysis of variants alone was the one that obtained the largest number of significant events. From apparently protective variants (higher number in the control group), such as the missense variants in RAS/MAPK pathway as variants of stopgain with population frequency above 0.05 in chromatin genes in greater number in individuals with ASD. None of the multivariate analysis models had significant discrimination results between the two groups. Due to the small sample size, the results of this study should be interpreted with limitations, and it is necessary to replicate these scenarios in other databases. However, these findings suggest that different types and frequencies of variants may have distinct contributions to disease development depending on the genes analyzed, rather than complex relationships between variants of the same gene list / O transtorno do espectro autista (TEA) é um distúrbio do neurodesenvolvimento caracterizado por uma incapacidade de comunicação comportamento e interações sociais que afeta em torno de 1-2% da população mundial. Até o momento a etiologia do TEA ainda não é totalmente compreendida, mas nos últimos 18 anos muitos avanços foram feitos para entender o componente genético relacionado ao desenvolvimento do quadro clínico. Com o advento das análises de varredura genômica como a análise cromossômica por microarray e o sequenciamento completo de exoma (SCE) muitos avanços foram feitos para a compreensão da fisiopatologia da doença. Em torno de 10-15% dos casos podem ser explicados por grandes perdas ou ganhos (deleções ou duplicações superiores a 1000 pares de bases) do material genético, que geralmente envolvem a disrupção de um ou mais genes. As metodologias de sequenciamento de nova geração foram fundamentais para a descrição das mutações de ponto e pequenas inserções e deleções associadas ao TEA. O SCE permitiu que muitas descobertas fossem feitas sobre novos genes candidatos e mecanismos para o desenvolvimento da doença. Atualmente afirma-se que as alterações de novo (não herdadas) e de maior probabilidade de ruptura gênica, como as mutações de perda-de-função e as alterações não-sinônimas com alta predição de dano por ferramentas computacionais, em genes de susceptibilidade a doenças do neurodesenvolvimento sejam um grande contribuidor para o mecanismo da doença. Entretanto essas mutações, além de não explicar a totalidade dos casos raramente são recorrentes na população, o que dificulta o estabelecimento de um diagnóstico molecular definitivo para a maioria dos pacientes. O SCE já é uma prática nos laboratórios clínicos de genética e demonstra uma alta efetividade para as doenças que seguem um padrão de herança mendeliano, e têm uma causa genética estabelecida. Na prática clínica o SCE é solicitado para os casos de TEA, apesar de ter diferentes modos de herança e terem mais de 1,000 genes associados à doença. Devido a estas características o SCE para os casos de TEA são um grande desafio para o laboratório clínico. Este estudo propõem a construção de uma rotina computacional de análise do SCE que possa testar diferentes genes candidatos quanto à sua sensibilidade e especificidade para a detecção dos indivíduos afetados. A abordagem proposta é a contagem de variantes separadas por seu possível dano à proteína e frequência populacional para cada indivíduo de grupos afetado e controle em 168 indivíduos com SCE, sendo 49 com TEA e 119 controles. Após a formulação da contagem esses valores são submetidos a uma sequência de testes estatísticos, buscando diferença significativa em quantidade de mutações de todas as variantes isoladamente, das mutações de perda-de-função, ou não-sinônimas danosas como um conjunto e a aplicação de modelos de análise multivariada como: regressão logística, árvore de decisão, rede neural, máquinas de suporte de vetor e análise de componente principal para a elaboração de modelos mais complexos para o desenvolvimento na doença. Ao todo foram testadas 21 listas de genes, destas, 19 apresentaram ao menos um resultado significativo, sendo a análise de variantes isoladamente a que obteve maior número de eventos significativos. Desde variantes aparentemente protetoras (maior número no grupo controle), como as variantes não-sinônimas em via de RAS/MAPK quanto variantes de perda de códon de parada com frequência populacional acima de 0.05 em genes de cromatina em maior número nos indivíduos com TEA. Nenhum dos modelos de análise multivariada obteve resultados significativos na discriminação entre os dois grupos. Devido ao pequeno número amostral os resultados deste estudo devem ser interpretados com limitações, sendo necessária a replicação deste cenário em outros bancos de dados. Entretanto, estes achados sugerem que diferentes tipos e frequências de variantes podem ter contribuições distintas para o desenvolvimento da doença a depender dos genes analisados, mais de que relações complexas entre as variantes de uma mesma lista de genes

As fissuras orofaciais, ou fissuras labiopalatinas, são malformações prevalentes na população mundial, presente em cerca de um a cada 700 nascimentos. Dentro das fissuras orofaciais, um grupo etiologicamente distinto é composto pelas fissuras de lábio com ou sem fissura de palato, que, em 70% dos casos, não estão associadas a nenhuma comorbidade (fissuras de lábio com ou sem palato não sindrômicas, FL/P NS). A etiologia das FL/P NS é complexa, e em muitos casos apresenta herança multifatorial. A contribuição genética para as FL/P NS, embora sabidamente relevante, ainda é pouco conhecida. Ainda, os loci de suscetibilidade consistentemente associados às FL/P NS, não conferem um risco que explique a herdabilidade total da doença. O objetivo do presente trabalho foi investigar, por meio de diferentes estratégias, variantes de risco às FL/P NS. Utilizando sequenciamento de exoma em casos familiais, verificamos que o gene codificante da caderina epitelial, CDH1, contribui importantemente com variantes raras de efeito moderado a alto na etiologia das FL/Ps. Além disso, propusemos que também podem ter relevância etiológica genes envolvidos na via de polaridade planar celular, transição epitélio-mesênquima, adesão celular, regulação de ciclo celular ou de interação com microtúbulos. Por meio de um estudo de associação com correção para estratificação populacional, caracterizamos o intervalo de associação da região 8q24, o principal locus de suscetibilidade às FL/P, e identificamos associação significativa também para a região 20q12. Por fim, combinando o estudo de associação com mapeamento de eQTLs, encontramos pela primeira vez a associação entre marcadores na região 2p13, que regulam MRPL53, em FL/P NS. Em conclusão, este trabalho contribui para o melhor entendimento da relevância de variantes raras, de efeito moderado a alto, e comuns, de efeito pequeno, na etiologia das FL/P NS / Orofacial clefts (or cleft lip/palate) are congenital malformations with high prevalence in population (∼1:700 births). Among the orofacial cleft types, an etiologically distinct group is composed by cleft lip with or without cleft palate, which, in 70% of cases, is not accompanied by other malformations (nonsyndromic cleft lip with or without cleft palate, NSCL/P). NSCL/P presents complex etiology, often with multifactorial inheritance. Although important, the genetic contribution to NSCL/P is still poorly comprehended, and the susceptibility loci that have been associated with NSCL/P do not explain the totality of the disease\'s heritability. In light of this, our aim was to investigate risk variants for NSCL/P by means of different strategies. With exome sequencing for NSCL/P familial cases, we report that the epithelial cadherin-encoding gene contributes with rare, moderate-to-high risk variants to NSCL/P etiology. In addition, we suggest an etiological contribution of genes laying in planar cell polarity pathway, or involved with epithelial-mesenchymal transition, cell adhesion, cell cycle regulation, and interaction with microtubules. Using structured association approach, we narrowed the associated interval of 8q24 region in a Brazilian population, and also validated the association for 20q12. Finally, by combining association analysis with eQTL mapping, we found association of regulatory variants of MRPL53, in 2p13, with NSCL/P. In conclusion, this study contributes with a deeper comprehension of the etiological role of rare and common variants for NSCL/P

A Síndrome Ablefaria Macrostomia (SAM) é uma condição rara, onde os pacientes apresentam características clínicas marcantes como o encurtamento ou ausência das pálpebras superiores e inferiores, ausência de sobrancelhas e cílios, macrostomia por defeitos na fusão dos lábios, entre outros. O padrão de herança da síndrome não está elucidado, tendo a herança autossômica dominante com expressividade variável sido sugerida. SAM possui sobreposição fenotípica com a Síndrome de Barber-Say e com a Síndrome de Fraser, porém nenhum gene já descrito apresentou mutação nos pacientes portadores da SAM. A abordagem genômica no estudo de doenças raras tem sido amplamente utilizada, devido principalmente ao surgimento da Nova Geração de Sequenciamento, que possui alto poder de descriminar as seqüencias nucleotídicas com grande cobertura, em um curto período de tempo. No presente estudo o sequenciamento completo do exoma foi realizado, com cinco indivíduos de uma mesma família, três membros afetados e dois não, e permitiu a análise das regiões codificantes nestes indivíduos. A base molecular da Síndrome Ablefaria Macrostomia é aqui sugerida como autossômica dominante, e decorrente da mutação nova não sinônima c.223G>A (p.E75K) no gene TWIST2. Essa mutação patogênica ocasiona a troca de um aminoácido pequeno de carga negativa, o ácido glutâmico, para um aminoácido de cadeia maior carregado positivamente, a lisina. A modelagem in silico da proteína Twist2 mostrou que a estrutura geral tridimensional da proteína não foi alterada, mas a troca do aminoácido ocorre na posição 75 dentro do domínio básico HLH, e pode impedir a formação de dímeros, ou a própria ligação ao DNA. Sugere-se ainda que a heterogeneidade de fenótipos associados a mutações no gene TWIST2, pode ser atribuída às interações que essa proteína é capaz de formar, e a ampla ação regulatória que ela desempenha em diversos genes do desenvolvimento. / Ablepharon-Macrostomia Syndrome (AMS) is a rare condition characterised by absent or hypoplastic eyelids, absent eyebrows and eyelashes, macrostomia caused by fusion defects of the mouth with unfused lateral commissures, as well as other clinical features. The inheritance pattern has not been confirmed and while autosomal dominant inheritance with variable expressivity has been suggested, recessive inheritance has not been ruled out. The phenotype of AMS overlaps that of Barber-Say and Fraser Syndrome, but any reported gene for these syndromes is mutated on AMS patients. The genomic approach for rare disease studies has been widely used mainly due to the emergence of Next Generation Sequencing, which is very effective at determining nucleotide sequences with large coverage in a short period of time. The whole exome sequencing of five family members was undertaken, with three affected and two unaffected, and the coding regions of the individuals were subsequently analysed. The molecular basis of AMS is suggested here as autosomal dominant, and due to a novel non-synonymous mutation c.223G>A (p.E75K), in TWIST2 gene. This pathogenic mutation causes glutamic acid, a small negatively charged amino acid, to be substituted for a larger and positively charged lysine. The in silico protein modeling of Twist2 shows that the general 3D-structure of the protein is not affected, but the amino acid change is located inside the basic Helix-Loop-Helix domain which could disrupt dimerization and DNA binding. It has also been suggested that the phenotype heterogeneity associated with mutations on TWIST2 gene can be attributed to the interactions that this protein is capable of, and the role that it plays in the regulation of several developmental genes.