Autism spectrum disorder (ASD) is a neurodevelopment disorder characterized by impairment in communication skills, behavior and social interactions that affects around 1-2% worldwide. To date the etiology of ASD has not yet been fully understood, but in the last 18 years many advances have been made to understand the genetic component related to the development of the clinical phenotype. With the advent of genomic scan analysis such as chromosome analysis by microarray and whole exome sequencing (WHE) many advances have been made to understand the pathophysiology of the disease. About 10-15% of the cases can be explained by large losses or gains (deletions or duplications greater than 1000 base pairs) of the genetic material, which generally involve the disruption of one or more genes. Next generation sequencing methodologies were fundamental in the description of point mutations and small insertions and deletions associated with ASD. The WES has allowed many discoveries to be made about new candidate genes and mechanisms for the development of the disease. It is now claimed that de novo (non-inherited) and likely gene disruptive mutations, such as loss-of-function and non-synonymous changes with high prediction of damage by computational tools, in genes related to neurodevelopment are a major contributor to the disease mechanism. However, these mutations, in addition to not explaining the majority of cases, are rarely recurrent in the population, which makes it difficult to establish a definitive molecular diagnosis for most patients. WES is already a practice in clinical genetics laboratories and demonstrates high effectiveness for diseases that follow a Mendelian pattern of inheritance, and have an established genetic cause. In clinical practice WES is requested for cases of ASD, despite having different modes of inheritance and having more than 1,000 genes associated with the disease. Due to these characteristics the analysis of WES for ASD is a major challenge for the clinical laboratory. This study proposes the construction of a computerized WES analysis routine that can test different candidate genes for their sensitivity and specificity for the detection of affected individuals. The proposed approach consists in the counting of variants separated by their possible protein damage and population frequency for each individual from affected and control groups, this study analyzed 168 WES, being 49 with ASD and 119 controls. After counting formulation, these values are subjected to a sequence of statistical tests, seeking a significant difference in the amount of mutations of all the variants alone, loss-of-function or damaging missense mutations, and the application of models of multivariate analysis such as: logistic regression, decision tree, neural network, vector support machine and principal component analysis for the elaboration of more complex models for disease development. A total of 21 lists of genes were tested, of which 19 presented at least one significant result, and the analysis of variants alone was the one that obtained the largest number of significant events. From apparently protective variants (higher number in the control group), such as the missense variants in RAS/MAPK pathway as variants of stopgain with population frequency above 0.05 in chromatin genes in greater number in individuals with ASD. None of the multivariate analysis models had significant discrimination results between the two groups. Due to the small sample size, the results of this study should be interpreted with limitations, and it is necessary to replicate these scenarios in other databases. However, these findings suggest that different types and frequencies of variants may have distinct contributions to disease development depending on the genes analyzed, rather than complex relationships between variants of the same gene list / O transtorno do espectro autista (TEA) é um distúrbio do neurodesenvolvimento caracterizado por uma incapacidade de comunicação comportamento e interações sociais que afeta em torno de 1-2% da população mundial. Até o momento a etiologia do TEA ainda não é totalmente compreendida, mas nos últimos 18 anos muitos avanços foram feitos para entender o componente genético relacionado ao desenvolvimento do quadro clínico. Com o advento das análises de varredura genômica como a análise cromossômica por microarray e o sequenciamento completo de exoma (SCE) muitos avanços foram feitos para a compreensão da fisiopatologia da doença. Em torno de 10-15% dos casos podem ser explicados por grandes perdas ou ganhos (deleções ou duplicações superiores a 1000 pares de bases) do material genético, que geralmente envolvem a disrupção de um ou mais genes. As metodologias de sequenciamento de nova geração foram fundamentais para a descrição das mutações de ponto e pequenas inserções e deleções associadas ao TEA. O SCE permitiu que muitas descobertas fossem feitas sobre novos genes candidatos e mecanismos para o desenvolvimento da doença. Atualmente afirma-se que as alterações de novo (não herdadas) e de maior probabilidade de ruptura gênica, como as mutações de perda-de-função e as alterações não-sinônimas com alta predição de dano por ferramentas computacionais, em genes de susceptibilidade a doenças do neurodesenvolvimento sejam um grande contribuidor para o mecanismo da doença. Entretanto essas mutações, além de não explicar a totalidade dos casos raramente são recorrentes na população, o que dificulta o estabelecimento de um diagnóstico molecular definitivo para a maioria dos pacientes. O SCE já é uma prática nos laboratórios clínicos de genética e demonstra uma alta efetividade para as doenças que seguem um padrão de herança mendeliano, e têm uma causa genética estabelecida. Na prática clínica o SCE é solicitado para os casos de TEA, apesar de ter diferentes modos de herança e terem mais de 1,000 genes associados à doença. Devido a estas características o SCE para os casos de TEA são um grande desafio para o laboratório clínico. Este estudo propõem a construção de uma rotina computacional de análise do SCE que possa testar diferentes genes candidatos quanto à sua sensibilidade e especificidade para a detecção dos indivíduos afetados. A abordagem proposta é a contagem de variantes separadas por seu possível dano à proteína e frequência populacional para cada indivíduo de grupos afetado e controle em 168 indivíduos com SCE, sendo 49 com TEA e 119 controles. Após a formulação da contagem esses valores são submetidos a uma sequência de testes estatísticos, buscando diferença significativa em quantidade de mutações de todas as variantes isoladamente, das mutações de perda-de-função, ou não-sinônimas danosas como um conjunto e a aplicação de modelos de análise multivariada como: regressão logística, árvore de decisão, rede neural, máquinas de suporte de vetor e análise de componente principal para a elaboração de modelos mais complexos para o desenvolvimento na doença. Ao todo foram testadas 21 listas de genes, destas, 19 apresentaram ao menos um resultado significativo, sendo a análise de variantes isoladamente a que obteve maior número de eventos significativos. Desde variantes aparentemente protetoras (maior número no grupo controle), como as variantes não-sinônimas em via de RAS/MAPK quanto variantes de perda de códon de parada com frequência populacional acima de 0.05 em genes de cromatina em maior número nos indivíduos com TEA. Nenhum dos modelos de análise multivariada obteve resultados significativos na discriminação entre os dois grupos. Devido ao pequeno número amostral os resultados deste estudo devem ser interpretados com limitações, sendo necessária a replicação deste cenário em outros bancos de dados. Entretanto, estes achados sugerem que diferentes tipos e frequências de variantes podem ter contribuições distintas para o desenvolvimento da doença a depender dos genes analisados, mais de que relações complexas entre as variantes de uma mesma lista de genes

Mutações nos genes envolvidos na embriogênese hipofisária já foram descritas relacionadas a quadros isolados de deficiência hormonal múltipla e/ou associado a fenótipos extra-pituitários. As mutações encontradas em humanos foram descritas em genes envolvidos na embriogênese hipofisária e cujos fenótipos foram gerados em animais a partir de nocaute, servindo de ponto de partida para sua busca em pacientes com fenótipo similar. Essa estratégia é conhecida como busca por gene candidato, e é feita pela técnica de sequenciamento tradicional Sanger. Na última década, com o avanço de novas tecnologias de sequenciamento, diversos genes foram associados ao hipopituitarismo, principalmente utilizando-se a metodologia de exoma. Contudo, ainda há uma grande parcela dessa população sem diagnóstico molecular, como evidenciado em um levantamento na literatura por Fang e colaboradores e cuja tendência foi observada no ambulatório de Endocrinologia do Desenvolvimento do Hospital das Clínicas, onde apenas 14% dos pacientes tiveram o seu diagnóstico molecular determinado. Com isso, as tecnologias de sequenciamento de última geração, passaram a ser uma ferramenta promissora para determinação molecular dos fenótipos dos pacientes. Logo, alguns pacientes em seguimento no ambulatório de endocrinologia do desenvolvimento tiveram o exoma sequenciado, e uma análise das métricas do sequenciamento evidenciou regiões de cobertura muito baixa, o que não permitiu a conclusão sobre a presença ou ausência de variantes nessas regiões. Entre essas regiões estão os genes SOX2 e SOX3, os quais possuem variantes conhecidas causadoras do fenótipo. Esse trabalho tem como objetivo analisar a cobertura dos genes envolvidos na embriogênese hipofisária assim como os relacionados ao hipopituitarismo congênito em quatro diferentes kits de preparação de biblioteca para exoma, a fim de identificar a melhor metodologia para um diagnóstico molecular dos pacientes alem determinar variantes especificas da população brasileira na região de interesse através de busca no site ABraOM. Foram analisados 76 genes em um total de 119 amostras separadas em três grupos, sendo o primeiro grupo de amostras HapMap, o segundo de um paciente com hipopituitarismo e sua mãe e o terceiro de amostras brasileiras aleatórias. Os kits utilizados foram NimbleGen (Roche), Nextera (Illumina), SureSelect e SureSelect+UTR (Agilent). Para isso, foram utilizados diversos programas de bioinformática, tendo entre eles o FASTQC, BWA, GATK, Annovar, Qualimap e bedTools. Análises da qualidade do sequenciamento, assim como a taxa de mapeamento e duplicação mostraram que as amostras utilizadas apresentavam qualidades adequadas e similares entre si para a análise. De acordo com os resultados obtidos em relação a cobertura, o kit da NimbleGen apresenta uma queda em sua cobertura dos genes de interesse em relação a sua capacidade de cobertura do exoma global, algo que pode ser devido à alta taxa de GC na região de interesse, uma vez que a capacidade do kit nessas regiões é deficiente em relação aos demais. Os genes com piores coberturas em todas as quatro tecnologias foram os genes HES5, que apesar de fazer parte da embriologia hipofisária, não possui variante relacionada ao fenótipo em humanos, e o SOX3 que, apesar de ter muita baixa cobertura na NimbleGen, é bem coberto na SureSelect. Isso corrobora com a análise de capacidade de cobertura em regiões com alta taxa de GC. Somado a isso observou-se que a população brasileira tem 885 variantes únicas e exclusivas. Concluímos, portanto, que o kit SureSelect, da Agilent, tem o melhor desempenho na região de interesse, assim como no exoma global, sendo o indicado para estudos em coortes de hipopituitarismo e a população brasileira possui variantes únicas inerentes a ela / Mutations in the genes involved in pituitary embryogenesis have been described related to isolated cases of multiple hormonal deficiency and/or associated with extra-pituitary phenotypes. Mutations found in humans were described in genes involved in pituitary embryogenesis by generating phenotypes knockout animals, serving as the starting point for their search in patients with similar phenotype. This strategy is known as gene candidate search and is performed by the traditional Sanger sequencing technique. In the last decade, with the advancement of new sequencing technologies, several genes have been associated with hypopituitarism, mainly using the exome methodology. However, there is still a large portion of this population without molecular diagnosis, as evidenced by a survey in the literature by Fang et al., This trend was also observed in the outpatient clinic of Developmental Endocrinology of Hospital das Clínicas, where only 14% of the patients had their molecular diagnosis. With this, high throughput sequencing technologies have become a promising tool for the molecular determination of patients\' phenotypes. Therefore, we sequenced the exome of some of our patients, and an analysis of the sequencing quality showed very low coverage regions, which harms the researcher\'s ability to reach a conclusion regarding presence or lack of variants in these regions. Among these regions are the SOX2 and SOX3 genes, which have many variants that are known to cause the phenotype. This work aims to analyze the coverage of the genes involved in pituitary embryogenesis as well as those related to congenital hypopituitarism in four different exome library preparation kits in order to identify the best methodology for a molecular diagnosis of the patients and to determine specific variants of the Brazilian population in the region of interest by searching the ABraOM website. A total of 76 genes were analyzed in a total of 119 samples in three groups: the first group of HapMap samples, the second of a patient with hypopituitarism and his mother, and the third group of random Brazilian samples. The kits used were NimbleGen (Roche), Nextera (Illumina), SureSelect and SureSelect + UTR (Agilent). For this, several bioinformatics programs were used, among them FASTQC, BWA, GATK, Annovar, Qualimap and bedTools. Sequencing quality analysis, as well as the mapping and duplication rate, showed that the samples used presented adequate and similar qualities for the comparison. According to the results obtained in relation to the coverage, the NimbleGen kit shows a drop in its coverage of the genes of interest in relation to its capacity to cover the global exome, something that may be due to the high GC rate in the region of interest, once the capacity of the kit in these regions is not as good as the others. The genes with the worst coverage in all four technologies were the HES5 gene, which despite being part of the pituitary embryology, have no phenotype-related variant in humans, and SOX3 which, despite having very low coverage in NimbleGen, is well covered on SureSelect. This corroborates the analysis of coverage capacity in regions with a high GC rate. In addition to this it was observed that the Brazilian population has 885 unique and exclusive variants. Therefore, we conclude that the Agilent\'s SureSelect kit has the best performance in the region of interest, as well as in the global exome, being recommended for studies in hypopituitarism cohorts, and that the Brazilian population has unique variants inherent to it

A imunodeficiência combinada grave (SCID) é uma doença caracterizada por profunda deficiência de células T, que afeta as imunidades celular e humoral e gera anormalidades graves no desenvolvimento e funções do sistema imune. Recém-nascidos com SCID apresentam a doença nos primeiros meses de vida e tem grande susceptibilidade a infecções. Sem tratamento, essas condições são invariavelmente fatais, porém se reconhecidas precocemente, há a possibilidade da realização do transplante de células-tronco hematopoiéticas, o tratamento curativo, o que torna a SCID uma emergência pediátrica. A investigação do defeito genético é uma prerrogativa para o condicionamento adequado do transplante, a terapia gênica, o aconselhamento genético e o diagnóstico pré-natal. No Brasil, o conhecimento sobre SCID é incipiente e não existem dados moleculares sobre pacientes com a doença. Sendo assim, este estudo teve por objetivo investigar defeitos genético-moleculares de pacientes brasileiros com SCID. Foram incluídos 13 pacientes, todos com início precoce dos sintomas e manifestações clínicas esperadas em SCID (principalmente infecções respiratórias, de pele, diarreia crônica e atraso de crescimento). Os patógenos isolados foram vírus, bactérias e fungos oportunistas comumente encontrados em pacientes SCID. A partir da quantificação de TRECS e KRECs e imunofenotipagem de linfócitos, foi montado o perfil imunológico de cada paciente, que guiou o sequenciamento direto de Sangerdos genes mais frequentemente mutados em cada imunofenótipo de SCID. Mutações em 3 pacientes foram identificadas por Sanger e, posteriormente, 8 pacientes cujas mutações não foram encontradas no Sanger foram encaminhados para o sequenciamento completo de exoma, que resultou na identificação do gene afetado em 62,5% dos casos. Ao todo, foram identificadas mutações patogênicas em 8 dos 13 pacientes. Os resultados revelaram 6 alterações em 5 genes de SCID clássica (IL7R, RAG2, DCLRE1C, JAK3, IL2RG), 1 mutação no gene CD3G e 2 alterações em CECR1. Das 9 mutações encontradas, 5 não possuíam registro na literatura. O estudo genético de SCID em nosso país é problemático, principalmente porque ainda hoje, a esmagadora maioria dos pacientes não é diagnosticada. A implementação da quantificação de TRECs e KRECs como triagem neonatal para linfopenias graves é uma ferramenta fundamental para que os pacientes SCID possam ser identificados, investigados e tratados adequadamente. / Primary immunodeficiencies are a heterogeneous group of genetic diseases that lead to increased susceptibility to infections and affect mostly children. Severe Combined Immunodeficiency (SCID) is the most severe of all these diseases and is characterized by profound T cell deficiency, which affects cellular and humoral immunities and leads to severe abnormalities in the development and function of the immune system. Newborns with SCID present the disease in the first months of life and are highly susceptible to infections. Without treatment, these conditions are invariably fatal, but if recognized early, there is the possibility of hematopoietic stem cell transplantation, the curative treatment, which makes SCID a pediatric emergency. Identifying the genetic defect of SCID patients is a prerequisite for proper transplant conditioning, gene therapy, genetic counseling and prenatal diagnosis. Knowledge about SCID is still incipient in Brazil, and there are virtually no molecular data on patients with the disease. Therefore, this study aimed to investigate genetic-molecular defects of Brazilian patients with SCID. Thirteen patients were recruited, all with early onset of symptoms and clinical manifestations expected of classic SCIDs (mainly respiratory and skin infections, chronic diarrhea and failure to thrive). The pathogens isolated were opportunistic viruses, bacteria and fungi often reported in SCID patients. The immunological profile from each patient was defined by the quantification of TRECS and KRECs and lymphocyte immunophenotyping, which was meant to guide direct sequencing by Sanger of the most frequently mutated genes of each SCID immunophenotype. Mutations in 3 patients were identified by Sanger and, subsequently, 8 patients whose mutations were not identified by Sanger were referred for whole exome sequencing, which resulted in the identification of the affected gene in 62,5% of cases. Pathogenic mutations were identified in 8 of the 13 patients. The results revealed 6 mutations in 5 genes associated to classical SCID genes (IL7R, RAG2, DCLRE1C, JAK3, IL2RG), 1 mutation in the CD3G gene, and 2 mutations in CECR1. Five of the 9 mutations found had no record in the literature. SCID genetic investigation in our country is troublesome, mainly because even nowadays, the vast majority of patients are not diagnosed properly. Newborn screening for SCID and other severe lymphopenias by the quantification of TRECs and KRECs is key for the identification, investigation and proper treatment of SCID patients.

INTRODUÇÃO: Crianças com baixa estatura constituem um grupo heterogêneo. Em uma parcela dos casos, o mecanismo envolvido nesse processo decorre de alterações genéticas. OBJETIVO: Realizar uma investigação clínica e genético-molecular de um grupo de pacientes com baixa estatura de causa desconhecida. MÉTODOS: Selecionamos crianças com baixa estatura persistente (escore-Z de altura <= -2 para idade e sexo) de causa desconhecida para avaliação genômica. O estudo foi dividido em 2 etapas: 1ª etapa - avaliação de 229 pacientes com baixa estatura sindrômica [baixa estatura associada a outros achados dismórficos (atraso de desenvolvimento neuropsicomotor e/ou déficit intelectual, presença de dismorfismos faciais e/ou outras malformações)] por cariótipo molecular (aCGH/SNPa); 2ª etapa: avaliação de 99 crianças com baixa estatura persistente, nascidas pequenas para idade gestacional (PIG - escore-Z de peso e/ou comprimento ao nascer <= -2 para idade gestacional) e classificação de acordo com a presença ou ausência de dismorfismos associados. Essas crianças foram divididas em dois grupos: baixa estatura sindrômica (n=44) e baixa estatura isolada (n=55). Pacientes com baixa estatura sindrômica foram avaliados por sequenciamento exômico (WES). Pacientes com baixa estatura isolada foram avaliados através de painel gênico (n = 39) ou WES (n = 16). RESULTADOS: 1ª etapa: 32 (14%) pacientes com baixa estatura sindrômica apresentaram variações no número de cópias (CNVs) patogênicas ou possivelmente patogênicas. Sete delas são recorrentes em outros estudos e são responsáveis por cerca de 40% de todas as CNVs patogênicas/possivelmente patogênicas encontradas em pacientes com baixa estatura de causa desconhecida. 2ª fase: Dentre os 99 pacientes avaliados com baixa estatura nascidos PIG, foram encontradas 23 variantes patogênicas/possivelmente patogênicas em genes já associados à distúrbios de crescimento. Quinze (34%) nos pacientes com baixa estatura sindrômica, em genes relacionados a processos celulares fundamentais, vias de reparo de DNA e vias intracelulares; e oito (15%) em pacientes com baixa estatura isolada, em genes associados à cartilagem de crescimento e a via RAS/MAPK. CONCLUSÃO: A heterogeneidade dos pacientes com baixa estatura dificulta o diagnóstico clínico. As novas abordagens genômicas permitem estabelecer o diagnóstico etiológico de crianças com baixa estatura de causa desconhecida / BACKGROUND: Patients born small for gestational age (SGA) are a heterogenous group, and in several cases, it is due to genetic processes. AIM: To perform a clinical and genetic-molecular investigation of short stature patients of unknown cause. METHODS: We selected short stature children (height <= -2 SDS for age and sex) of unknown cause for genomic evaluation. The study had two stages: 1st stage - 229 syndromic short stature patients (patients with short stature and dysmorphic features, developmental delay, and/or intellectual disability) were evaluated by molecular karyotype (aCGH/SNPa); 2nd stage: We selected 99 short stature children born SGA (birth weight and/or length <=-2 SDS for gestational age). They were classified according to the presence or absence of dysmorphic features into two groups: syndromic short stature (n=44) and isolated short stature (n=55). Patients with syndromic short stature were evaluated by whole exome sequencing (WES), and patients with isolated short stature were evaluated through a target panel sequencing (n=39) or WES (n=16). RESULTS: 1st stage: 32 (14%) syndromic short stature patients had pathogenic or probably pathogenic copy number variations (CNVs). We observed seven recurrent CNVs that are responsible for about 40% of all pathogenic/probably pathogenic genomic imbalances found in short stature patients of unknown cause. 2nd stage: Of the 99 patients evaluated, 23 pathogenic/likely pathogenic variants were found in genes already associated with growth disorders. Fifteen (34%) syndromic short stature patients had pathogenic variants in genes related to fundamental cellular processes, DNA repair and intracellular pathways; and eight (15%) isolated short stature patients had pathogenic variants in genes associated with growth plate development and the RAS/MAPK pathway. CONCLUSION: The heterogeneity of short stature makes the clinical diagnosis difficult. The new genomic approaches are effective to diagnose a larger number of undiagnosed patients