Plant cell wall degradation into fermentable sugars by cellulases is one of the greatest barriers to biofuel production. Expansin protein loosens the plant cell wall by opening up the complex of cellulose microfibrils and polysaccharide matrix components thereby increasing its accessibility to cellulases. We over-expressed cucumber expansin in maize kernels to produce enough protein to assess its potential to serve as an industrial enzyme for applications particularly in biomass conversion. We used the globulin-1 embryo-preferred promoter to express the cucumber expansin gene in maize seed. Expansin protein was targeted to one of three sub-cellular locations: the cell wall, the vacuole, or the endoplasmic reticulum (ER). To assess the level of expansin accumulation in seeds of transgenic kernels, a high throughput expansin assay was developed. The highest expressing plants were chosen and enriched crude expansin extract from those plants was tested for synergistic effects with cellulase on several lignocellulosic substrates. Activity of recombinant cucumber expansin from transgenic kernels was confirmed on these pretreated substrates. The best transgenic lines (ER-targeted) can now be used for breeding to increase expansin expression for use in the biomass conversion industry. Results of these experiments show the success of expansin over-expression and accumulation in transgenic maize seed without negative impact on growth and development and confirm its synergistic effect with cellulase on deconstruction of complex cell wall substrates.

Com o crescente aumento da demanda energética e a redução dos recursos fósseis, os biocombustíveis obtidos a partir de biomassa lignocelulósica emergem como uma importante fonte de energia alternativa e sustentável. A biomassa lignocelulósica é formada basicamente por celulose, hemicelulose e lignina, cujo agrupamento compõem a complexa matriz da parede vegetal. A celulose é o principal composto de interesse presente na biomassa, uma vez que pode ser quebrada em glicose e usada no metabolismo de microrganismos para a posterior produção de etanol combustível. No entanto, diversos fatores tornam a biomassa recalcitrante ao processo de conversão, o que eleva o custo de produção dos biocombustíveis. Nesse contexto, proteínas aditivas, como as Expansinas vegetais vêm ganhando grande destaque devido à sua capacidade de afrouxar a parede celular por meio do enfraquecimento da ligação entre os polissacarídeos de forma não covalente, o que diminuí o estresse da parede celular e facilita assim a quebra da celulose por enzimas específicas. Assim, o presente trabalho teve como objetivo identificar genes da superfamília das Expansinas em quatro espécies de gramíneas (Zea mays, Sorghum bicolor, Brachypodium distachyon e Saccharum spp.). As sequências nucleotídicas obtidas a partir de bancos transcriptômicos de cana-deaçúcar foram usados na construção de árvores filogenéticas, por meio das quais pode se inferir as relações de ortologia entre espécies e selecionar sequências com potencial aplicação biotecnológica na promoção da sacarificação enzimática, aumento de biomassa e resistência vegetal à estresse abiótico, sendo estes ShEXPA14, ShEXPA24, ShEXPB22, ShEXPL3, ShEXPA1- zm, ShEXPA33, ShEXPB28, ShEXPB3, ShEXPB21, ShEXPB25 e ShEXPB4. Adicionalmente, os genes de sorgo e cana-de-açúcar foram caracterizados quanto aos domínios e motivos conservados das Expansinas de plantas, identificando as diferenças estre as subfamílias que podem contribuir para a maior especificidade das ?-expansinas em parede celular de gramíneas. / With increasing energy demand and the reduction of fossil resources, biofuels obtained from lignocellulosic biomass emerge as an important source of alternative and sustainable energy. The lignocellulosic biomass is basically formed by cellulose, hemicellulose and lignin, whose grouping makes up the complex matrix of the vegetal cell wall. Cellulose is the main compound of interest present in biomass since it can be broken down into glucose and used in the metabolism of microorganisms for the subsequent production of fuel ethanol. However, several factors make the biomass recalcitrant to the conversion process, which raises the biofuel production cost. In this context, additive proteins, such as vegetable Expansins have been gaining prominence due to their ability to loosen the cell wall by weakening the bond between the polysaccharides in a non-covalent way, which decreases the stress of the cell wall and thus facilitates the break of cellulose by specific enzymes. Thus, the present work aimed to identify nucleotide sequences of the Expansinas superfamily in four species of grasses (Zea mays, Sorghum bicolor, Brachypodium distachyon and Saccharum spp.). Sugarcane transcripts were used in the construction of phylogenetic trees, through which one can infer the relations of orthology between species and obtain sequences with potential biotechnological application in the promotion of enzymatic saccharification, biomass increase and plant resistance to abiotic stress, these being ShEXPA14, ShEXPA24, ShEXPB22, ShEXPL3, ShEXPA1-zm, ShEXPA33, ShEXPB28, ShEXPB3, ShEXPB21, ShEXPB25 and ShEXPB4. In addition, sorghum and sugarcane genes were characterized by the conserved domains and motifs of plant Expansins, identifying the differences between the subfamilies that may contribute to the greater specificity of the EXPB in the cell wall of grasses.

A demanda global por energia tem acompanhado o desenvolvimento de novas indústrias, o que exige um constante aprimoramento e busca por novas fontes de energia. Com a conscientização da população a respeito da necessidade de fontes de energia renovável se abriu uma expectativa otimista para o uso da biomassa como fonte de energia. Uma variedade de microrganismos, como bactérias e fungos produzem enzimas que podem ser usadas para a despolimerização de biomassa celulósica em monômeros de glicose. Dentro deste contexto, estudamos uma celulase (XCC3535) de Xanthomonas campestris. Esta proteína é um híbrido natural com dois domínios (um domínio glicosilhidrolase e um domínio semelhante à expansina) que podem possuir funções complementares. Acredita-se que expansinas e proteínas semelhantes a expansinas possam ajudar na degradação da celulose cristalina, participando na ligação ao substrato, seguida pela formação de complexos enzimáticos ou, possivelmente, associadas à superfície para degradação. Este trabalho foi iniciado com análises de bioinformática da sequência para a proteína Glicosilhidrolase permitindo três construções para clonagem : uma completa contendo ambos os domínios (catalítico e semelhante a Expansina), outro com apenas o domínio catalítico GH5, e uma terceiro com apenas o domínio semelhante a Expansina. Obtemos por expressão recombinante em Escherichia coli Rosetta proteína das três construções. A amostra protéica pura foi utilizada para estudos por espalhamento dinâmico de luz (DLS), espalhamento de raios-X a baixo ângulo (SAXS), dicroísmo circular (CD) e cristalização para uso aplicando difração de raios-X. Assim, nosso principal objetivo neste estudo foi a descrição da Glicosilhidrolase XCC3535, permitindo assim a geração de conhecimento para o entendimento da função desta proteína e de seus domínios. / Global demand for energy has grown with the development of new industries that requires constant improvement and search for new sources of energy. Nowadays, the growing awareness of the population about the need for renewable energy have opened an optimistic expectation for the use of biomass as energy source. A variety of microorganisms like bacteria and fungi produce enzymes that can be used for the depolymerization of cellulosic biomass into glucose monomers. Within this context, we study one cellulase (XCC3535) from Xanthomonas campestris organism. This protein is a natural hybrid with two domains (a glicosyl hidrolase domain and an expansin-like domain) which seem to have complementary functions. It is believed that expansins help in the degradation of crystalline cellulose by participating in substrate binding, followed by formation of enzyme complexes or possibly attaching to cell surface. This work was initiated using bioinformatics analysis of the protein sequence and three constructs were made: a full length containing both domains (catalytic and expansin), another with only the catalytic domain, and a third one with only the expansin-like domain. We were able to overexpress these recombinant proteins in Escherichia coli Rosetta strain. The pure protein sample was used for studied by Dynamic Light Scattering (DLS), Small angle X-ray scattering, Circular Dichroism (CD) and Crystallization for X-ray diffraction. Thus, our main objective in this study was structurally describe these proteins, thereby allowing the generation of knowledge for understanding function of these proteins.

Com o crescente aumento da demanda energética e a redução dos recursos fósseis, os biocombustíveis obtidos a partir de biomassa lignocelulósica emergem como uma importante fonte de energia alternativa e sustentável. A biomassa lignocelulósica é formada basicamente por celulose, hemicelulose e lignina, cujo agrupamento compõem a complexa matriz da parede vegetal. A celulose é o principal composto de interesse presente na biomassa, uma vez que pode ser quebrada em glicose e usada no metabolismo de microrganismos para a posterior produção de etanol combustível. No entanto, diversos fatores tornam a biomassa recalcitrante ao processo de conversão, o que eleva o custo de produção dos biocombustíveis. Nesse contexto, proteínas aditivas, como as Expansinas vegetais vêm ganhando grande destaque devido à sua capacidade de afrouxar a parede celular por meio do enfraquecimento da ligação entre os polissacarídeos de forma não covalente, o que diminuí o estresse da parede celular e facilita assim a quebra da celulose por enzimas específicas. Assim, o presente trabalho teve como objetivo identificar genes da superfamília das Expansinas em quatro espécies de gramíneas (Zea mays, Sorghum bicolor, Brachypodium distachyon e Saccharum spp.). As sequências nucleotídicas obtidas a partir de bancos transcriptômicos de cana-deaçúcar foram usados na construção de árvores filogenéticas, por meio das quais pode se inferir as relações de ortologia entre espécies e selecionar sequências com potencial aplicação biotecnológica na promoção da sacarificação enzimática, aumento de biomassa e resistência vegetal à estresse abiótico, sendo estes ShEXPA14, ShEXPA24, ShEXPB22, ShEXPL3, ShEXPA1- zm, ShEXPA33, ShEXPB28, ShEXPB3, ShEXPB21, ShEXPB25 e ShEXPB4. Adicionalmente, os genes de sorgo e cana-de-açúcar foram caracterizados quanto aos domínios e motivos conservados das Expansinas de plantas, identificando as diferenças estre as subfamílias que podem contribuir para a maior especificidade das ?-expansinas em parede celular de gramíneas. / With increasing energy demand and the reduction of fossil resources, biofuels obtained from lignocellulosic biomass emerge as an important source of alternative and sustainable energy. The lignocellulosic biomass is basically formed by cellulose, hemicellulose and lignin, whose grouping makes up the complex matrix of the vegetal cell wall. Cellulose is the main compound of interest present in biomass since it can be broken down into glucose and used in the metabolism of microorganisms for the subsequent production of fuel ethanol. However, several factors make the biomass recalcitrant to the conversion process, which raises the biofuel production cost. In this context, additive proteins, such as vegetable Expansins have been gaining prominence due to their ability to loosen the cell wall by weakening the bond between the polysaccharides in a non-covalent way, which decreases the stress of the cell wall and thus facilitates the break of cellulose by specific enzymes. Thus, the present work aimed to identify nucleotide sequences of the Expansinas superfamily in four species of grasses (Zea mays, Sorghum bicolor, Brachypodium distachyon and Saccharum spp.). Sugarcane transcripts were used in the construction of phylogenetic trees, through which one can infer the relations of orthology between species and obtain sequences with potential biotechnological application in the promotion of enzymatic saccharification, biomass increase and plant resistance to abiotic stress, these being ShEXPA14, ShEXPA24, ShEXPB22, ShEXPL3, ShEXPA1-zm, ShEXPA33, ShEXPB28, ShEXPB3, ShEXPB21, ShEXPB25 and ShEXPB4. In addition, sorghum and sugarcane genes were characterized by the conserved domains and motifs of plant Expansins, identifying the differences between the subfamilies that may contribute to the greater specificity of the EXPB in the cell wall of grasses.

A demanda global por energia tem acompanhado o desenvolvimento de novas indústrias, o que exige um constante aprimoramento e busca por novas fontes de energia. Com a conscientização da população a respeito da necessidade de fontes de energia renovável se abriu uma expectativa otimista para o uso da biomassa como fonte de energia. Uma variedade de microrganismos, como bactérias e fungos produzem enzimas que podem ser usadas para a despolimerização de biomassa celulósica em monômeros de glicose. Dentro deste contexto, estudamos uma celulase (XCC3535) de Xanthomonas campestris. Esta proteína é um híbrido natural com dois domínios (um domínio glicosilhidrolase e um domínio semelhante à expansina) que podem possuir funções complementares. Acredita-se que expansinas e proteínas semelhantes a expansinas possam ajudar na degradação da celulose cristalina, participando na ligação ao substrato, seguida pela formação de complexos enzimáticos ou, possivelmente, associadas à superfície para degradação. Este trabalho foi iniciado com análises de bioinformática da sequência para a proteína Glicosilhidrolase permitindo três construções para clonagem : uma completa contendo ambos os domínios (catalítico e semelhante a Expansina), outro com apenas o domínio catalítico GH5, e uma terceiro com apenas o domínio semelhante a Expansina. Obtemos por expressão recombinante em Escherichia coli Rosetta proteína das três construções. A amostra protéica pura foi utilizada para estudos por espalhamento dinâmico de luz (DLS), espalhamento de raios-X a baixo ângulo (SAXS), dicroísmo circular (CD) e cristalização para uso aplicando difração de raios-X. Assim, nosso principal objetivo neste estudo foi a descrição da Glicosilhidrolase XCC3535, permitindo assim a geração de conhecimento para o entendimento da função desta proteína e de seus domínios. / Global demand for energy has grown with the development of new industries that requires constant improvement and search for new sources of energy. Nowadays, the growing awareness of the population about the need for renewable energy have opened an optimistic expectation for the use of biomass as energy source. A variety of microorganisms like bacteria and fungi produce enzymes that can be used for the depolymerization of cellulosic biomass into glucose monomers. Within this context, we study one cellulase (XCC3535) from Xanthomonas campestris organism. This protein is a natural hybrid with two domains (a glicosyl hidrolase domain and an expansin-like domain) which seem to have complementary functions. It is believed that expansins help in the degradation of crystalline cellulose by participating in substrate binding, followed by formation of enzyme complexes or possibly attaching to cell surface. This work was initiated using bioinformatics analysis of the protein sequence and three constructs were made: a full length containing both domains (catalytic and expansin), another with only the catalytic domain, and a third one with only the expansin-like domain. We were able to overexpress these recombinant proteins in Escherichia coli Rosetta strain. The pure protein sample was used for studied by Dynamic Light Scattering (DLS), Small angle X-ray scattering, Circular Dichroism (CD) and Crystallization for X-ray diffraction. Thus, our main objective in this study was structurally describe these proteins, thereby allowing the generation of knowledge for understanding function of these proteins.

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Four families are described to this superfamily: α-expansins, β-expansins, expansins-like A and expansins-like B. The α-expansins are present in most eudicots, whereas the β-expansins are involved in cellular expansion process of the monocots family Poaceae. To analyze the sequence and to verify the functional activity of a β-expansin on filter paper, in this work a gene of β-expansin (expb11) of sugarcane was isolated, cloned and expressed in the yeast Pichia pastoris. Nucleotide sequences of expansin genes from sugarcane were initially obtained from the public SUCEST database using reference sequences of expansins from sorghum, maize and rice as query. A total of 227 ESTs were identified. These ESTs were submitted to clustering and 30 contigs and 92 singletons were obtained. Specific oligos were designed and used to capture the genomic fragment corresponding to the expb11 gene by PCR. The coding DNA fragment of expb11 was obtained by RT-PCR from the total RNA extracted from stalks of the RB867515 sugarcane cultivar. This fragment was cloned into the pGEM-T Easy vector and subcloned into the pPIC9 vector. Genomic and cDNA fragments were sequenced. The expression cassette generated by subcloning into the pPIC9 expression vector was integrated into the P. pastoris strain GS115 genome, but it has not been possible to detect a functional activity of expansin. The expb11 gene comprises 1367 bp, containing 3 introns, and its cDNA is 801 bp long, with an ORF of 776 bp. The alignment of sugarcane and sorghum sequences of expb11 showed that the two species share a 95% sequence identity along these genes and that the gene structure is highly conserved in these species. The in silico analysis of the putative EXPB11 amino acid sequence allowed the detection of two conserved domains, one similar to the GH45 family, and the other to the carbohydrate binding module (CBM). The putative EXPB11 protein has a predicted molecular weight of approximately 26.4 kDa, an isoelectric point (pI) of 4.88, and contains two glycosylation sites. Our results confirmed that the isolated and cloned expb11 gene corresponds to a β-expansin gene from sugarcane, paving the way to the expression, isolation and use of recombinant EXPB11 in the mix of enzymes and proteins for lignocellulosic biomass degradation. / Nos últimos anos tem crescido a busca por novas fontes de energia renováveis, e uma das tecnologias utilizadas é a produção de etanol a partir da biomassa lignocelulósica (etanol de segunda geração). Para a obtenção de açúcares fermentáveis a partir dessa biomassa, é necessário um complexo de enzimas e proteínas que atuarão sobre os polissacarídeos da parede celular vegetal. As expansinas são proteínas que podem auxiliar as enzimas no processo de degradação, promovendo o afrouxamento da parede celular das plantas pelo rompimento de ligações de hidrogênio entre fibras de celulose e hemicelulose. A superfamília das expansinas foi descrita principalmente em plantas, entretanto, há relatos em fungos e bactérias. São descritas 4 famílias de expansinas: α-expansinas, β-expansinas, expansinas like-A e expansinas like-B. As α e β-expansinas já são caracterizadas, desempenhando importante função no crescimento vegetal. As α-expansinas são mais presentes em plantas dicotiledôneas, enquanto que as β-expansinas estão envolvidas no processo de expansão celular de monocotiledôneas da família Poaceae. Para analisar a sequência e verificar a atividade funcional de uma β-expansina sobre bagaço de cana-de-açúcar, neste trabalho foi isolado, clonado e expresso um gene de β-expansina (expb11) de cana-de-açúcar na levedura Pichia pastoris. A sequência de nucleotídeos do gene de β-expansina da cana-de-açúcar foi obtida a partir da biblioteca de cDNA de cana-de-açúcar do projeto SUCEST. Sequências de referências de expansinas de sorgo, milho e arroz foram utilizadas para identificar ESTs de expansinas no banco de dados SUCEST. Foram identificadas 227 ESTs. Essas ESTs foram submetidas à clusterização e foram obtidos 30 contigs e 92 singletons. Após o desenho de oligonucleotídeos, o fragmento genômico correspondente ao gene expb11 foi amplificado por PCR. A região codante do gene expb11 foi obtida por RT-PCR a partir de RNA total obtido de colmo da cultivar RB867515. Esse material foi clonado no vetor pGEM-T Easy e subclonado no vetor pPIC9. Os fragmentos genômico e cDNA obtidos foram analisados por sequenciamento. O cassete de expressão gerado pela subclonagem em vetor de expressão pPIC9 foi integrado no genoma de P. pastoris linhagem GS115, mas não foi possível detectar atividade funcional da expansina. O gene expb11 possui 1367 pb, contendo 3 íntrons, enquanto o cDNA 801 pb. Pelo alinhamento das sequências genômicas do gene expb11 obtidas de cana-de-açúcar e de sorgo, foi possível se observar que estes genes possuem 95 % de identidade, e estrutura de íntrons/éxons semelhantes. Pela análise in silico da sequência de aminoácidos da proteína EXPB11 foi possível verificar que ela possui dois domínios, um similar ao da família GH45, e outro similar ao módulo de ligação ao carboidrato (CBM). A proteína EXPB11 possui peso molecular de aproximadamente 26,4 kDa, pI 4,88, e contém dois sítios de glicosilação. Os resultados obtidos através das análises in silico mostraram que o gene expb11, isolado e clonado, corresponde a um gene de β-expansina de cana-de-açúcar, e ao ser produzida, a EXPB11 recombinante poderá integrar o mix de enzimas e proteínas para a degradação de biomassa lignocelulósica.